一種醫用納米復合物的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種醫用納米復合物，包括：（a）用于分子識別的寡核苷酸或多肽適配體；（b）超順磁氧化鐵納米微粒；（c）生物相容性雙親性葡聚糖嵌段共聚物載體，用于超順磁氧化鐵納納米粒子和連接用于分子識別的寡苷酸酸或多肽適配體。本發明使用適配體、超順磁性氧化鐵納米微粒與聚乙二醇、聚己內酯和多糖的嵌段共聚物組裝成為的醫用納米復合物，利用適配體與靶分子特異性結合的靶向作用及SPIO納米微粒的磁共振造影特性，通過生物相容性的嵌段共聚物構建復合納米膠束，進入體內后，靶向定位微小病灶，通過常規的核磁共振造影診斷設備用于體內外微小病變的早期靶向定位診斷。本發明通過選擇合適的靶分子適配體，也可以用于細胞信號傳導、代謝過程、基因檢測、病毒偵測、腫瘤探測等生物研究。
【專利說明】一種醫用納米復合物
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種醫用納米復合物，適用于微小病變定位的早期的輔助治療。
【背景技術】
[0002]由于當前老齡化社會的趨勢和世界范圍內人們壽命的延長，人們逐漸意識到如何實現個人健康生活的重要性。相應地，人們一直強調對于諸如癌癥和其它威脅生命的重大疾病早期診斷的必要，因此一直迫切需要開發一種在認為需要的時候能夠用于早期診斷，并且具備微小病變精確定位的診斷技術。在此背景下人們一直努力開發新穎的診斷和治療技術，應用人類基因組計劃所獲得的豐富的生物信息與納米技術相結合，將兩者結合巧妙地用于制造高度敏感及具有精確靶向的生物傳感器件，結合常規的核磁共振影像技術，從而實現體內外微小病變的早期靶向定位診斷及其它生物目的研究，如細胞信號傳導、代謝過程等等研究。[0003]SELEX技術是近年來發展起來的一種研究核酸結構、功能及進化等的一種新的組合化學技術，它不僅在基礎研究、生物篩查等方面均有很好的應用，而且在臨床診斷方面顯示了廣闊的前景。通過指數富集配基的系統進化技術體外篩選得到的一組能與目標靶分子高親和、高特異性結合的寡核苷酸系列(單鏈DNA或RNA)，稱為適配體(Aptamer)。作為一類新型的功能分子，適配體克高親和力和高特異性地識別不同的分子。它的親和力和特異性可與抗體相媲美，被認為是“挑戰”抗體地位的一種新型試劑，已在生命科學、化學等領域獲得越來越多的應用，以不同類型的示蹤分子標記適配體后，該類適配體探針可以直觀地將適配體與靶分子的特異性識別轉化為靈敏的示蹤信號，從而為靶分子的檢測提供一種靈敏、特異的新型模式，在疾病診斷和治療中發揮越來越重要的作用。最近Santa-ColomaTA等報道了用IE標切換技術制備的高特異性“monoclonal oligobody (單克隆寡核苷酸適配體)”或 “synthetic oligobody (合成寡核苷酸適配體)” (Bianchini M et al, J.1mmunol, methods, 2001, 252:191-197)可以特異性識別相應的蛋白質,應用于蛋白質印跡、免疫組化、免疫共沉淀等分析試驗中。相對于適配體，蛋白類抗體的產生和應用存在以下限制:病毒性抗原免疫,動物無法產生耐受免疫,免疫原性弱導致抗體難以產生；雜交瘤單克隆抗體，在人體的排異反應；抗體生產成本高、費時費力，稀有抗體需要大量篩選才能得到，克隆細胞株需要傳代培養；批間質量不均一，需要重新優化標定，體內外識別特異性差異；抗體對溫度敏感，壽命有限，需要低溫保存等缺點。而適配體在體外篩選，特性可依要求設計改變；動力學參數可依照診斷條件的要求而改變；無毒性抗原和免疫原性弱的抗原所受限制；在體外化學合成，可以保證時間、質量和數量的特別需要；特異性不受組織或樣品中非靶蛋白的干擾；可以在合成時精確、定點、隨意連接其它功能集團和分子，如巰基、氨基、熒光素、生物素、酶等；比抗體分子小，更適合于體內影像診斷和治療；變性和復性可逆,而且速度快,可反復使用、長期保存和室溫下運輸。
[0004]目前在影像探針的研究領域，可用作藥物載體的聚合物膠束已受到越來越多的關注，這些聚合物膠束通過雙親性兩嵌段聚合物在水溶液中自組裝而形成核-殼結構。經自組裝形成的聚合物膠束體系具有較低臨界膠束濃度(CMC)、較低藥物毒副作用和較長血液循環時間等優點，是包裹功能性納米粒子如SPIO和量子點燈的良好載體，用于生物成像的研究。聚合物膠束包裹納米粒子所形成的納米復合物除保留納米粒子原本的磁學和光學特性外，還提高了它在體內外的生物相容性，尤其突出的是多個磁性納米微?？梢栽谀z束疏水核內形成致密的團簇結構，從而在同樣鐵濃度下產生比單個氧化鐵粒子更強的T2效應，這一獨特結構是開發高靈敏度磁共振影像探針的重要基礎。同時兩嵌段聚合物膠束的親水段可以和適配體連接，從而具有了靶向特異性。多糖是一類具有良好生物相容性的天然聚合物，其中葡聚糖、透明質酸、硫酸軟骨素和殼聚糖等在藥物和基因轉導中已有廣泛的應用。右旋糖酐等葡聚糖因其良好的生物安全性而在臨床上用于血漿替代品，它也是Feridex和Resovist兩種SPIO造影劑得包被材料。但單一的葡聚糖本身并不能夠使疏水性SPIO顆粒在水溶液中穩定分散。

【發明內容】

[0005]為解決上述問題，本發明提供一種醫用納米復合物，包括:
Ca)用于分子識別的寡核苷酸或多肽適配體；
(b)超順磁氧化鐵納米微粒；
(c)生物相容性雙親性葡聚糖嵌段共聚物載體，用于超順磁氧化鐵納納米粒子和連接用于分子識別的輔助治療。
[0006]進一步的，上述寡核苷酸或多肽適配體是篩選可特異性結合某些靶標；具體包括腫瘤、病毒、細菌、信號蛋白、抗原、抗體，核酸、有機小分子、金屬離子及某些特異性細胞等。
[0007]進一步的，上述生物相容性雙親性葡聚糖嵌段共聚物，是通過縮合反應連接分子識別寡核苷酸或多肽適配體，通過乳液揮發包裹超順磁氧化鐵納米粒子。
[0008]進一步的，基于上述適配體的寡核苷酸或多肽與超順磁氧化鐵納米顆粒在生物相容性嵌段共聚物中組合成為具有靶向功能的納米復合影像造影劑，利用適配體的靶向識別革巴分子。
[0009]上述靶分子包括蛋白質、多肽、氨基酸、核苷酸、藥物、維生素、有機化合物、無機化合物、細胞、細菌、病毒、腫瘤、信號蛋白、抗原、抗體、金屬離子中的一種或多種組合。
[0010]一種醫用納米復合物的應用，可用于體內、體外靶向定位微小病灶，通過常規的核磁共振造影診斷設備用于體內外微小病變的早期靶向定位診斷，也可用于細胞信號傳導、代謝過程、基因檢測、病毒偵測、腫瘤探測等生物研究。
具體實施例
[0011]選用葉酸作為靶標分子，將葉酸、福氏免疫佐劑、磷脂、膽固醇適量混合研磨制備免疫原,將上述免疫原小鼠大腿、背部皮下多點免疫注射,30-60天后采血檢測葉酸抗體。采小鼠血清提取葉酸抗體，將小鼠抗葉酸抗體用PBS緩沖液稀釋后在合適的溫度條件下包被聚乙烯小孔板。實驗時將葉酸稀釋適量加入已包被抗葉酸抗體的聚乙烯小孔板孵育適當時間，用PBS緩沖液清 洗未結合的游離葉酸分子，真空低溫抽干密封儲存于4°C冰箱備用。
[0012]把約0.5nmol生物素標記的隨機ssDNA和上述聚苯乙烯微孔板在500ul含1%BSA的結合 TE 緩沖液(IOmM Tris-HCl, PH 7.5，ImM EDTA, lmMCaC12, ImM MgCl2)中孵育，輕輕震蕩，4°C過夜。傾去孵育液，然后用0.5 ml TE緩沖液洗滌3次微孔板，然后用7M尿素在94°C反應10分鐘洗脫結合的寡核苷酸，然后用酚/氯仿/異丙醇(25:24:1，PH 8)抽提，洗脫液加入10%糖原后用乙醇沉淀，再進行PCR (95°C預變性5分鐘后，擴增5個循環:94°C變性1分鐘，55°C退火2分鐘，72°C延伸1分鐘，最后72°C終止延伸5分鐘)，取10 ul上述PCR產物為模板，再次PCR擴增，每3個循環取樣，選擇PCR產量大，無雜帶的循環數為最佳循環數，將剩余90ul產物全部擴增。其中一部份以[a -32P] CTP為底物進行PCR，得到的產物與包被不同濃度有葉酸的聚苯乙烯板雜交進行驗證。其余部分通過PCR生成生物素化dsDNA，再拆分為生物素化ssDNA。
[0013]不同濃度葉酸包被微孔板和放射性標記的第一輪篩選后的擴增文庫進行點雜交，結果顯示雜交信號強度隨葉酸濃度增加而增加，表明獲得的標記DNA文庫和葉酸有特異的結合作用。
[0014]將上述雜交方法篩選到與葉酸有強力結合的次級DNA文庫用尿素-苯酚洗脫抽提純化，通過PCR (95°C預變性5分鐘后，擴增90個循環:94°C變性1分鐘，55 °C退火2分鐘，72°C延伸1分鐘，最后72°C終止延伸5分鐘)擴增生成生物素化dsDNA，拆分為生物素化ssDNA葉酸寡核苷酸適配體，多克隆寡核苷酸適配體經過PCR擴增后，連接與pGEM-T easyVector,然后轉染感受態細胞，挑取3個克隆進行測序。每一個陽性克隆即為一個單克隆寡核苷酸適配體。通過包被葉酸聚苯乙烯微孔板，可以檢測單克隆寡核苷酸適配體的結合系數，選擇合適的單克隆寡核苷酸適配體備用。
[0015]將1mmolFe (acac) 3與5mmol 1，2_十六燒醇、3mmol油酸及3mmol油胺混合于1OmL芐醚、氬氣保護下加熱至300°C回流1小時，溶液冷卻至室溫后用甲醇沉淀得到黑色固體，將沉淀回溶于混合了油酸油胺的正己烷中，再用甲醇沉淀，得到的產物產物于正己烷中保存。
[0016]用乳液揮發法按照聚合物/SP1O等于3的質量比，將適量的聚合物和SP1O分散于0.5mL氯仿，并將其加至5mL純水中，用探頭超聲(SON1CS，US)分散，氯仿揮發后即得到水相中的Dex-g-PCL/SP1O納米復合物,該納米復合物的粒度分布和形貌分別通過MalvernNanos1zer粒度儀和掃描電子顯微鏡(H1tach1 S-4800, Janpan)進行表征。
[0017]生物素化ssDNA葉酸寡核苷酸適配體攜帶的生物素與Dex-g-PCL葡聚糖通過縮合反應聯接在一起，通過合適的柱層析純化“適配體-Dex-g-PCL”復合物。
[0018]適配體-Dex-g-PCL/SP1O納米復合物制備
將柱層析純化“適配體-Dex-g-PCL”復合物加按照3:1加入超順磁氧化鐵納米微粒(SP10)，用乳液揮發法制備復合物。
[0019]用動態光散射、磁化強度和T2馳豫效能(relax1v1ty)等參數來表征膠束的物理特性；通過小鼠肝臟造影來評價該納米復合材料的體內顯影效果；通過靜脈注射造影劑后在不同時間點對肝臟、脾臟進行組織病理學切片和染色，檢測磁共振造影劑在體內的分布、細胞吞嗤及靶向情況。
[0020]本發明醫用納米復合物，利用適配體與靶分子特異性結合的靶向作用及SP1O納米微粒的磁共振造影特性，通過常規的核磁共振造影診斷設備用于體內外微小病變的早期靶向定位診斷。本發明通過選擇合適的靶分子適配體，也可以用于細胞信號傳導、代謝過程、細菌/病毒偵測、分子相互作用等生物研究。[0021]本發明選擇雙親性葡聚糖作為包裹SPIO納米粒子而形成納米復合材料，技術上以聚乙二醇、聚己內酯等與多糖合成的嵌段共聚物，形成雙親性的納米膠束，既可以包裹疏水性SPIO納米微粒，同時通過合適的基團與修飾后的適配體聚合反應，可以共同組成具有靶向特異性的一種醫用納米復合物。
【權利要求】
1.醫用納米復合物，其特征在于， 包括: Ca)用于分子識別的寡核苷酸或多肽適配體； (b)超順磁氧化鐵納米微粒； (c)生物相容性雙親性葡聚糖嵌段共聚物載體，用于超順磁氧化鐵納納米粒子和連接用于分子識別的寡苷酸酸或多肽適配體。
2.根據權利要求1所述的一種核磁共振影像造影劑，其特征在于，寡核苷酸或多肽適配體是經篩選的可特異性結合靶標或特異性細胞。
3.根據權利要求2所述的一種核磁共振影像造影劑，其特征在于，所述可特異性結合靶標包括腫瘤、病毒、細菌、信號蛋白、抗原、抗體，核酸、有機小分子或金屬離子。
4.根據權利要求1所述的一種核磁共振影像造影劑，其特征在于，所述生物相容性雙親性葡聚糖嵌段共聚物，是通過縮合反應連接分子識別寡核苷酸或多肽適配體，通過乳液揮發包裹超順磁氧化鐵納米粒子。
5.根據權利要求1所述的一種核磁共振影像造影劑，其特征在于，所述基于上述適配體的寡核苷酸或多肽與超順磁氧化鐵納米顆粒在生物相容性嵌段共聚物中組合成為具有靶向功能的納米復合影像造影劑，利用 適配體的靶向識別靶分子。
6.一種如權利要求1所述的一種醫用納米復合物的應用，是用于體內、體外靶向定位微小病灶、病變的輔助治療。
【文檔編號】C12Q1/68GK103893783SQ201210579872
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年12月28日 優先權日:2012年12月28日
【發明者】陳亞玲 申請人:上海長征富民金山制藥有限公司