專利名稱：：一種培育葉夾角改變的轉基因水稻的方法及其專用重組載體的制作方法
技術領域：
：本發明涉及生物
技術領域：
，特別涉及一種培育葉夾角改變的轉基因水稻的方法及其專用重組載體。
背景技術：
：理想的株型是水稻提高產量的決定因素。在水稻的理想株型中，半矮化和葉片直立是兩個對增產非常有利的性狀(WangYandLiJ,.2008，Annu.Rev.PlantBiol.，59:253-279)。綠色革命就是通過改良水稻株型提高水稻產量的成功例證。近年的一些研究表明葉片直立也是成就水稻高產株型的目標之一。葉片直立可提高冠層光合速率，改善群體下部光照，增加物質生產量；同時增加冠層基部光量，增強根系活力，提高抗倒性；且利于密植，提高單位土地面積上的凈光合速率。研究表明油菜素內酯(BRs)影響著水稻的許多重要農藝性狀，如株高、葉片角度、分蘗角度、種子形態等(YamamuroC"a丄，2000PlantCell12:1591-1605;HongZa丄，2005，PlantCell17:2243—2254;TanabeSa丄，2005，PlantCell17:776-790;Wang"a丄，2008，PLoSONE3:e3521)。尤其是最近對BRs突變體的研究表明通過密植具有直立葉片的水稻品種可以達到增產的目的(MorinakaYetal.,2006,PlantPhysiol141:924-931;SakamotoTetal.，2006，NatBiotechnol24:105-109)，所以人們推測水稻BRs信號途徑的關鍵基因或BRs合成途徑的關鍵酶是改良水稻株型的潛在分子工具。一個成功的例子是通過突變0^股i/^基因，它編碼水稻BRs合成途徑的關鍵酶，獲得了葉片直立而育性正常的水稻品種，密植這種水稻品種可以提高水稻產量(Sakamotoa丄，2006)。這使人們對通過調控BRs途徑關鍵基因，改良水稻株型、提高水稻產量的策略信心倍增。迄今為止，人們分離到的水稻BRs信號途徑的關鍵基因有0s^i7，和6Is^/7V么其中人們對6>5^/7的突變體在水稻增產方面的應用進行了詳細的研究。研究表明由于OsBRIl是水稻的BRs受體，它在水稻BRs信號途徑的核心作用使得它突變后很難找到弱突變體。人們在篩選了100多個突變體后，找到了Os^//的弱突變體VW-7，雖然該突變體密植可以增加水稻的生物量，但因為^W-7結小種子所以并沒有帶來產量的增加。反義RNA技術是一個已經發展比較成熟的研究基因功能的技術。它是將基因以反向的方式插入到特定的啟動子下游，使其表達產物與內源的mRNA反向互補，從而可以與內源mRNA相結合，抑制內源基因的翻譯成蛋白質。采用反義RNA技術可以使我們了解在該基因的表達被抑制的情況下，水稻的生長、發育和株型建成以及產量等性狀。
發明內容本發明的目的在于提供一種重組載體。本發明提供的重組載體是含有反向的0^^7-7基因片段的重組載體，所述09^4A7-7基因片段是將序列表中序列1所示的基因用f/w/和5^c/雙酶切得到的基因片段。上述重組載體是將DNA片段A導入骨架質粒中得到的重組載體；所述骨架質粒是pCAMBIA1301;所述DNA片段A是含有反向的OsiS4A7-7基因的DNA片段。上述DNA片段A自上游至下游依次包括UbiPro、反向的&別^-/基因片段和Noster。上述重組載體是將as^4A7-7基因片段反向插入質粒pUN1301的多克隆位點中，得到的重組載體；所述^^W7-7基因片段是將序列表中序列1所示的基因用和^c/雙酶切得到的基因片段；所述質粒pUN1301是用包含UbiPro和Noster的片段插入質粒pCAMBIA1301中，得到的重組質粒；所述包含UbiPro和Noster的片段是用￡coRI和歷y7din載體pUN19，得到的2.3kb的片段；所述pUN19是將UbiPro插入質粒pUC19-Noster中，得到的載體；所述質粒pUC19-Noster是將NosterpolyA終止序列插入pUC19，得到的重組質粒；所述NosterpolyA終止序列是用5"acI和￡boRI雙酶切pBI221得到的序列。含有上述的重組載體的重組菌也屬于本發明的保護范圍之內。本發明的另一目的在于提供一種培育葉夾角改變的轉基因水稻的方法，是將ft^AW基因或反向的ttsi^A7-7基因片段導入目的水稻中，得到葉夾角改變的轉基因水稻，所述^WA7基因是序列1的自5'端第1-2180位所示的DNA分子；所述^^^7-7基因片段是將序列表中序列1所示的基因用《/w/和5"ac/雙酶切得到的基因片段。4上述反向的^^(A7-7基因片段是通過上述的重組載體導入水稻中的；所述葉夾角改變的轉基因水稻是與所述目的水稻相比，葉夾角變小的轉基因水稻。本發明的又一目的在于提供上述的方法在培育水稻新品種的應用。上述水稻新品種是水稻單產提高的品種。本發明通過將水稻中BRs途徑的關鍵基因6^iS4A7構建反義表達載體，得到轉OsBAKl-AS(OsBAKl-antisense)的轉基因水稻，植株不僅具有直立的葉片，而且育性和種子的百粒重與野生型無異。因此0s^^7可以作為一種潛在的分子育種工具，通過調控水稻BRs信號傳遞改良水稻株型提高水稻產量。圖l:反義表達載體物理圖譜示意圖。圖2:OsBAKl-AS轉基因水稻的表型觀察，其中A是成熟期的水稻成體植株和種子大小表型；B是轉基因水稻的株高統計；C是抽穗期轉基因水稻葉夾角相對角度的統計。圖3實時定量PCR結果，表示該基因在轉基因材料中的表達水平，其中A是實時定量PCR檢測OsBAKl-AS轉基因水稻中內源<9s^M7的表達；B是實時定量PCR檢測OsBAKl-AS轉基因水稻中Os朋A7及其同源基因的表達。圖4:OsBAKl-AS轉基因水稻根對BL處理的敏感性檢測，其中A是lpM24-ep氾L處理導致水稻主根抑制圖片；B是柱形圖顯示lnM24-epiBL處理后主根的相對長度；C是水稻主根對24-ep氾L處理響應的生長曲線。圖5:OsBAKl-AS轉基因水稻的葉夾角對BL處理的敏感性檢測，其中A是1000ng/nl的24-鄰iBL處理導致水稻葉夾角增大圖片；B是柱形圖顯示lOOOng/pl的24-ep氾L處理導致水稻葉夾角增大的數值；C是水稻葉夾角對24-epiBL處理響應的增長曲線。具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，但本發明并不限于以下實施例。下述實施例中，如無特殊說明，均為常規方法。本發明涉及的水稻葉夾角是指水稻葉片與水稻直立的莖稈的夾角。實施例l、水稻葉夾角變小的轉基因水稻的獲得及其檢測一、水稻葉夾角變小的轉基因水稻的獲得1、OsBAKl的cDNA的獲得1)水稻總RNA的提取由于RNA易降解，有機溶劑必須是新購的，用DEPC處理的ddH20配制所需試劑。所用玻璃器皿全部在180。C烘箱中烘烤8h以上，操作時勤換一次性手套。在液氮中研磨100mg材料，研碎后轉入到含1mlTrizol試劑的1.5ml離心管中，充分混勻，室溫放置5min;每管中加入0.2ml新鮮氯仿，劇烈振搖15sec，室溫靜置2-3min，《12,000rpm(不低于IO，OOOrpm)，4"C，離心15min;把上層無色水相轉移到一個新的1.5ml離心管中，用0.6ml異丙醇沉淀RNA，室溫放置10min，《12,000rpm，4"C，離心10min;去上清，將RNA沉淀用1ml75%乙醇清洗2次，超凈臺吹干(5min左右，注意不要完全干)；將沉淀溶于適量DEPC處理過的ddH20中，6(TC溫育10min，-7(TC保存；將提取好的RNA樣品(0.5-1叫)，用1/4倍的TAEbuffer配置的瓊脂糖膠，在200V電壓下電泳5min，觀察照相。測0D26。/28。值，以0D26。/28。大于1.9為宜，并確定RNA濃度。2)RT-PCR獲得OsBAKl的cDNAA、反轉錄第一鏈cDNA的合成參照SSII反轉錄酶(Invitrogen)說明書進行。TotalRNA(l^gM)2piOligodT(0.5PgAi1)1fildNTPMixture(2.5raM)4(ilRNasefreeWater4pi65X:變性5min，迅速冰浴待用。加入各種反轉錄試劑混合5xreversetranscriptbuffer4pi;RNaseInhibitor0.5jil;0.1MDTT2pi;混勻，42"C溫浴2min。最后加入SSII反轉錄酶0.5pi，RNasefreeWater2jil，補足反應體積到20混勻后水浴，42°C50min;70°C15min。B、PCR合成第二鏈人工合成一對引物如下正向引物5'-TCCCCCGGGAGGGTGGTGCTGATTTGGTGT-3，；反向引物5，-GGGGTACCGTTCCTTGGGCTCCTGCTGTT—3'。取第一鏈稀釋10倍的產物1)Lll為模板，以上述的正向引物和反向引物為引物，按常規PCR程序進行PCR擴增。PCR擴增體系(50|il):Pyrobest/PrimerStarenzyme(Takara)0.5|il2xPyrobest/PrimerStaxGCbuffer25|iildNTPMixture(2.5raM)4(il正向引物(20PM)1pi反向引物(20MM)1|ulTemplate2^1H2016.5(^1PCR擴增程序98°C2min;98°C10sec;58°C30sec;72°Clkb/min(通常一分鐘該酶可合成lkb的DNA，根據擴增片斷長度設定擴增時間)；36個循環后，72°ClOmin。PCR擴增得到2180bp的片段，命名為asW^7，回收該片段連入載體pGEM-TEasy,得到重組質粒，命名為pT0sBAKl，將該重組質粒轉化大腸桿菌DH5a(寶生物工程有限公司，大連)，以上述的正向引物和反向引物為引物PCR鑒定陽性克隆，擴增出2180bp左右片段的克隆為陽性克隆。提取陽性克隆的質粒，以該質粒載體上的T7和SP6啟動子序列為引物對其進行核苷酸序列測定，測序結果表明的核苷酸序列如序列表中序列1的自5'端第1-2180位所示。2、重組載體的構建1)玉米泛素啟動子(UbiPro)的獲得a、玉米基因組DNA的提取剪取約0.2g玉米幼苗，置于液氮中研磨；然后加入800fiL新配制的提取緩沖液(含O.lMTris-HC1pH8.0，50mMEDTA，0.5MNaCl，1%SDS和1%P-巰基乙醇)，劇烈振蕩使其全部懸浮;65"水浴30分鐘，每5分鐘顛倒混勻一次;然后加入250pL預冷的5M乙酸鉀，立即顛倒混勻，冰浴5分鐘；加入等量酚/氯仿，抽提一次，12000rpm離心5分鐘；收集上清，加入0.6倍體積的異丙醇沉淀DNA，室溫放置40分鐘；4°C12000rpra離心15分鐘，棄上清；沉淀用70%、100%乙醇各洗一次；干燥后，溶于20pL含100(ig/mLRNase的ddH20中，得到玉米基因組DNA。b、PCR擴增玉米泛素啟動子(UbiPro)取2斗步驟1)獲得的玉米基因組DNA溶液作為模板，在帶有HindIII識別位點的5'引物(GGAAGCTTCTGCAGTGCAGCGTGACCCGG)和帶有^/dll識別位點的3'引物(CGGGATCCAAGTAACACCAAACAACAGGG)的引導下進行PCR擴增，PCR反應條件為先94°C3分鐘；再94。C45秒，62°C45秒，72°C2分鐘，共35個循環，最后72°CIO分鐘。反應結束后，對PCR產物進行0.8X瓊脂糖凝膠電泳檢測，表明得到長度約為2kb的擴增片段，與預期結果相符，回收該目的片段，用限制性內切酶A'/7dIII和BaraHI雙酶切后回收，得到帶有粘性末端的玉米泛素啟動子(UbiPro)，備用。2)pUN1301載體的構建用限制性內切酶5acI和fcoRI將NosterpolyA終止序列從質粒載體pBI221(Clontech公司)上切下，連接到載體pUC19(TaKaRa公司)的相應位點中，得到重組載體，命名為pUC19-Noster。再用限制性內切酶歷'/7dl11和ife/dil雙酶切pUC19-Noster，瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收線性化的載體大片段，并將該回收片段與步驟1獲得的帶有粘性末端的玉米泛素啟動子(UbiPro)相連，得到重組載體，命名為pUN19。用限制性內切酶^coRI部分酶切和ffi/7din完全酶切從步驟2購建的重組載體pUN19切下包含UbiPro和Noster的長度約為2.3kb的片段，將該片段克隆入質粒載體pCAMBIA1301(CenterfortheApplicationofMolecularBiologytoInternationalAgriclture,www.cambia.org)多克隆位點的fc。RI禾口歷;dIII位點處，得到重組載體，命名為pUN1301。3)反向表達載體pUNBAKl-AS的構建對RT-PCR獲得的Os^4A7片段用限制性內切酶^wI和&c/進行雙酶切，得到1800bp左右片段，命名為0s別A7-/。電泳回收得到的片段。將pUN1301質粒同樣用限制性內切酶《P"I和5"ac/進行雙酶切，將上述1800bp的片段反向克隆到酶切過的pUN1301中，得到反向表達載體，命名為pUNBAK1-AS。其物理圖譜如圖1所示。將pUNBAKl-AS轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，用含有10pg/ml硫酸卡那霉素的LB培養基篩選出所需重組子并進行測序分析，經過測序鑒定，證明含有反向的&別,_/-7基因的pUNBAKl-AS的序列及結構正確，該重組質粒受UbiPro啟動子控制。其中，pUNBAKl-AS與pCAMBIA1301的區別在于多了一個DNA片段，命名為DNA片段A。3、水稻葉夾角變小的轉基因水稻的獲得1)重組農桿菌的獲得參照電激儀(EasyJecTPlus電激儀，英國EquiBio有限公司)操作指南，將質粒plMBAK1-AS通過電激法轉入農桿菌EHA105(寶生物工程有限公司，大連)中，獲得陽性克隆，備用轉化水稻。2)轉基因水稻的獲得參照陳惠等的方法(植物學通報，2008，25:322-331)轉化水稻。將攜帶質粒pUNBAKl-AS的農桿菌EHA105擴接種到20ml含Km50mg/1的YEB液體培養基中28'C搖菌培養至對數生長晚期；再從中取0.5ral轉接至50ml同樣的YEB培養基中，同樣條件下培養至OD600為0.5左右。將培養好的根癌農桿菌4000g離心10分鐘后，沉淀用等體積的培養基重懸。侵染水稻中花10號(浙江國稻高科技種業有限公司，浙江省杭州市體育場路359號，郵編:310006)的愈傷組織，經共培養感染、抗性培養基篩選及分化培養基上分化得到潮霉素抗性的陽性苗。待小苗長至10厘米左右時，打開容器封口膜，煉苗2-3天，然后將小苗移入人工氣候室栽培。煉苗同時，取潮霉素抗性的陽性苗的幼根切段2-3毫米進行GUS染色鑒定。GUS染色液組成為10Ommol/LNaP04pH7.0，0.l%TritonX-100,10mraol/LEDTA，0.5mmol/L鐵氰化鉀，X-Gluclmg/mL)。37。C溫育2小時，觀察藍色反應，進一步確定陽性轉化體。能夠出現藍色反應的植株為外源基因已經可以表達的抗性苗。得到轉pUNBAKl-AS的轉基因水稻株系7個，我們隨機挑選其中的兩個株系AS-2和AS-3做進一步生理實驗的檢測。二、檢測分析1、轉基因水稻表型分析以野生型水稻中花10號為正對照；以水稻BRs非敏感突變體6^7-7(由MakotoMatsuoka教授(NagoyaUniversity,BioscienceCenter,Chikusa，Nagoya464-8601，Japan,email:;j45751a@iiucc.cc.nagoya—u.etc..jp,fax:81-52-789-5226)提供)為負對照。將上述的兩個轉基因株系AS-2和AS-3、正對照和負對照在水稻生長季進行田間培養，進入成熟期后拍照并統計株型、葉片夾角和種子形態。實驗重復3次，結果如圖2所示，其中A是成熟期的水稻成體植株和種子大小表型；B是轉基因水稻的株高統計。P，穗長；I、II、III、IV分別表示穗下第1、2、93、4節間的長度；C是抽穗期轉基因水稻葉夾角相對角度的統計。Flagleaf:劍葉；2ndleaf:劍葉下第二葉；3rdleaf:劍葉下第三葉。WT，中花10號，正對照；d61-1，水稻BRs非敏感突變體，負對照。統計數據為20株水稻的平均值。轉基因株系株型緊湊(圖2A)，株高沒有變化說明植株發育正常(圖2B)，葉夾角變小(圖2C)。種子形態指標統計結果如表1所示，轉基因水稻的種子雖然長度變小但寬度增加，百粒重與野生型相比沒有明顯改變。表1.轉基因植株的種子形態指標<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>2、轉基因水稻中flsWAW基因的表達分析1)水稻模板RNA的制備參照實施例l中方法，提取GUS陽性苗和對照材料的總RNA，依以下體系去除RNA中可能混雜的基因組DNA:1PlRNaSIN(40U/(4)4HiDNaseI(40UM)2W10XDNaseIbufferXPiRNA(20Pg)Y14H20到總反應體積為50Ml。(依據RNA濃度決定X，Y=50-1-4-2-X)將混合物置于37。C，20min后，用等體積的酚、氯仿抽提以去除RNA中的蛋白污染。乙醇過夜沉淀(2倍體積的無水乙醇，0.3MNaAc，pH5.2)，12,000g，4°C，10min。70%乙醇洗滌3次，吹干沉淀后溶于RNasefree水。用水稻一個帶有內含子的內參基因ACTIN引物進行RT-PCR，確保模板RNA中沒有基因組DNA污染。參照實施例l中方法，反轉錄合成第一鏈cDNA。2)PCR體系利用SYBRGREENPCR試劑盒(T0Y0B0)進行熒光PCR。首先將反轉錄產物稀釋50倍，然后各取5W樣品進行檢測(每個樣品設置3次重復)。以基因ACTIN為內參，引物如下上游引物5，-CGTATGAGCAAGGAGATCAC-3，;下游引物5'-CACATCTGTTGGAAGGTGCT-3'。檢測tt^4A7表達所用引物如下上游引物5，-GAGTTGATCTTGGGAATGCTGC_3';下游引物5，-CACTAGGTATCGTTCCGCTTATGTT—3，。檢測(9^^A7同源基因表達所用引物如下。說，上游引物5，-CGGAGGGTG下游引物5'-CACGCTGTT上游引物5'-AAATCTTGA下游引物5，-GGTTATTGG上游引物5'-TGTCCTGTC下游引物5'-GGCCAAGAGPCR混合物成分如下10W2XSYBR*GREENRealtimePCRMasterMix5cDNAtemplate0.3W上游引物(20MM)0,3下游引物(20MM)4.4H20反應終體積為20W/個反應，先配置反應混合物，混勻分裝后加入模板。操作要在冰上進行，使用進口PCR管，為防止觸摸影響管壁的透光度，操作過程中需戴手套。3)PCR程序及實驗結果分析按照SYBR㊣GREENRealtimePCRMasterMix(T0Y0B0)推薦程序進行PCR:ATGCCCTAT-3，；GTCAGGGTTAC-3'。AGTGCTGGACTTG-3，；AGAAACTGATTGG-3，。CTTGGCTGGT-3，；AAGCTGGTATTTC-3'。①95。C，30sec;②95。C，5sec;55°C，10sec;72°C，15sec;45個循'環。PCR反應及其檢測分別使用SYBRGreenRealtimeMastermix和STARTAGENEMX3000PTmsystem。實時定量PCR結果如圖3所示，在AS-2和AS-3兩個轉基因水稻株系中，內源61^力A7的表達被抑制了50%以上(圖3a)，并且Os^4A7的同源基因的表達也不同程度地受到抑制(圖3b)。3、轉基因水稻對水稻油菜素內酯(BR)的敏感性檢測1)轉基因水稻的根的生長受BR的抑制實驗將AS-2和AS-3兩個轉基因水稻株系和正對照中花10號、負對照^W-7水稻種子滅菌后在添加有25mg/L潮霉素的無菌水中3(TC浸泡48h(篩選得到陽性轉基因水稻苗)。挑選萌發一致的水稻種子接種在含有不同濃度24-印iBL(上海生工生物工程技術服務有限公司)(油菜素內酯的一種)的1/2MS培養基上。28t:無菌培養8天，測量幼苗主根長并拍照，所得數據用Excel軟件進行統計分析。每組生理實驗都被重復三次以上。結果如圖4所示。A是1MM24-印iBL處理導致水稻主根抑制，每幅圖左側為未處理時的主根長，右側為l幽24-印iBL處理后的主根長；B是柱形圖顯示1MM24-印iBL處理后主根的相對長度，其中，主根的相對長度是指經24-印iBL處理后的主根長與未經24-印iBL處理(Control)的主根長的比例，而主根伸長抑制率=100%-主根的相對長度;C是水稻主根對24-印iB處理響應的生長曲線。AS-2和AS-3是兩個轉基因水稻株系；WT是正對照中花10號；fl^7-7是負對照，即水稻BRs非敏感突變體；control是未經24-ep氾L處理的對照。在24-印iBL存在下，AS-2和AS-3兩個轉基因水稻株系和正對照中花10號、負對照VW-7水稻幼苗的主根生長受抑(圖4A)。具體抑制結果如圖4B所示，正對照中花10號的主根伸長被24-印iBL處理抑制了54%;負對照BRs非敏感突變體c^-7的主根伸長僅被抑制了20%;而AS-2和AS-3兩個轉基因水稻株系居于兩者之間，主根伸長分別被抑制了44%和34%。這表明0sBAKl-AS轉基因水稻的主根對BL處理的敏感性低于野生型。本發明還統計0sBAKl-AS轉基因水稻代表株系AS-2和正負對照水稻幼苗在不同濃度24-印iBL(0、0.01、0.0和1MM)處理條件下的主根長度，描繪生長曲線。實驗結果顯示中花10號的主根曲線變化明顯，隨BL濃度升高，主根變短。BRs非敏感突變體在不同濃度BL處理條件下主根的變化不明顯，生長曲線平直。而AS-2轉基因水稻株系主根生長曲線趨于平緩，接近于突變體^W-厶進一步表明0sBAKl-AS轉基因水稻的主根對BL處理的敏感性降低。2)葉夾角對BR的敏感性實驗將AS-2和AS-3兩個轉基因水稻株系和正對照中花10號、負對照t/W-7水稻種子浸種萌發后，挑選萌發一致的水稻種子播種到花丼土中，在培養箱中28'C培養3天。用無水乙醇溶解24-epiBL，使其終濃度為10ng/|ul、100ng4il、500ng/pl和1000ng/Vl，每種濃度的24-epiBL溶液中加入TritonXlOO，使其終濃度為0.1%。取lpl上述各濃度的24-epiBL溶液滴加在第二葉的葉枕處，繼續培養3天，取處理的葉夾角照相，用ImageJ軟件測量。用Excel軟件進行統計分析。每個數據代表20株以上幼苗第二葉葉夾角的平均值，誤差為SE。每組生理實驗都被重復三次以上。結果如圖5所示，其中A是lOOOng/pl的24-epiBL處理導致水稻葉夾角增大；B是柱形圖顯示1000ng/|Lil的24-epiBL處理導致水稻葉夾角增大的數值；C是水稻葉夾角對24-epiBL處理響應的增長曲線。AS-2和AS-3是兩個轉基因水稻株系；WT是正對照中花10號；必7-J是負對照，即水稻BRs非敏感突變體；control是未經24-epiBL處理的對照。沒有24-ep氾L處理的水稻幼苗長到三葉期，第二葉包裹在葉鞘上并不展開，而24-epiBL處理后的同期水稻幼苗的第二葉被24-epiBL促進產生彎曲，葉夾角增大。用1000ng/|il的24-epiBL處理AS-2和AS-3兩個轉基因水稻株系和正對照中花10號、負對照^5/-7水稻幼苗，對水稻幼苗第二葉葉夾角進行拍照，圖片如圖5a所示，野生型對照的葉夾角最大，負對照的葉夾角最小，AS-2和AS-3介于之間。具體結果如圖5b所示，野生型中花10號的第二葉葉夾角達到了約93。；而BRs非敏感突變體的第二葉葉夾角僅為30°;AS-2和AS-3兩個轉基因水稻株系居于兩者之間，第二葉葉夾角分別為55°和48°。實驗結果說明轉基因水稻的葉夾角對BL處理的敏感性低于野生型，接近于81^非敏感突變體^6/-/。AS-2轉基因水稻和中花10號、^57-7水稻第二葉葉夾角在不同濃度BL處理后的結果如圖5c所示，野生型中花10號的第二葉葉夾角隨BL濃度的升高，增大明顯；而BRs非敏感突變體^67-/的第二葉葉夾角變化很小，曲線平直；AS-2轉基因水稻第二葉葉夾角變化曲線居于兩者之間，更接近于突變體d6/:。與根的敏感性檢測相似，葉夾角敏感性實驗也表明OsBAKl-AS轉基因水稻葉片夾角對BL處理是不敏感的。13序列表<110>中國科學院植物研究所<120〉一種培育葉夾角改變的轉基因水稻的方法及其專用重組載體<130〉CGGNARL92502<160〉1〈210>1<211>2180〈212〉謹〈213〉水稻(6!r，saOVa)<400〉1tcccccgggagggtggtgctgatttggtgtggaggcgggg肌6ltgCgtg3tgtgtg卿t60ctagggcgtgggg鄉Cgg3tcgcggcaatggcggcgcatcggtgggcggtgtgggcggt120gctgctgctgcggctgctcgtgccggcggcgcgggtgctcgccaacatggaaggtgatgc180attgcatagcatttagttgatcctaataatgttctacaaagttgggaccc240aactctggtcaat:ccgtgcacttggtttcatgttacttgca^t肌cgac3acagtgttat300cagagttga/tcttgggaatgctgcactatcaggcactttggtcccacaacttgggcaact360caatacctggagctctacagagcggaacgatacctagtga420wttgga^Etcctcacaaacttggtcagtttggatttgtacttgaacaacttcactggtcc■aMaccag3ttcacttggaaacctattgaagctacgattcctgcgtcttaacaataacag540cctttcggg"ttcaattcctaaatcactaactgctatcactgccctacaagttctagatct600ttcaaacaacaatttgtctggagaagttccatcaactggttccttttcattattcacccc660tatcagttttgcc^caacccttccttgtgtggtcctgggaccacaaaaccttgccctgg720tgctccccccttttccccacctcctccatataatcctccaactcctgtgcagtcaccagg780gagttcatctagtactggagcaattgctggtggagtggctgctggagcagccttgctatt840tgctattcctgctattggttttgcatggtatcggcgc鄉肌3cccc3agagcatttctt900tgatgtgcctgctg郷aggatccagaggtccatcttggccsgctta^犯gattttcact960acgagaactacaagttgcaacagataccttcagcaataaaaacattctcgg犯g郷tgg1020gtttggC3￡Lggtctataaaggaagattagc￡tg￡Ltggttctttagtagctgttaagagact1080a犯ggagg3gagaacacctggtgggg纖tacagtttcaaacagaagttgag^tg3ttag1140catggctgtacatagaaatctgctgcgtttacgagggttctgtatgacacccacagaaag1200gttgcttgtgtatccatacatggctaatggaagcgttgcgtcacgtcttag卿acggcc1260accgLtcgga^cctccacttgattggcgaac犯g8卿ELggattgcgttggg"ttccgccag1320ggggctgtcctatttacatgatcattgtgacccaaagattatccatcgtg1380tgC333t3ttttattagatgaagactttga3gCtg"t3gt3ggggactttggtttggcca31440cccatgtaacaactgcagttcgtggaaca^ttgggwtat1500tgcaccagaatatctttc犯caggaaaatcatctgagaaaactgatgtatttggttatgg1560gattatgcttttggagcttat犯caggacaacgtgcctttgaccttgctcgtctagcca31620tgatgatgatgtxatgctactggactgggtctcaaggaga8^ggCtgg31680gatgttggttgatccagatt:tac3gagca^ctac3t"tgat1740ccaggttgctcttctttgcacacaaggctcccccacag犯cgccccaagatggcggaggt1800tgtg郷atgcttgaaggtgatggccttgccg卿gatgggaggagtggc3gsa_ga_t3ga_1860agtagtacggagcttggccctcatcggaactx卿gtggattgtcgactc1920gacggacaaccttcatgcggttgagctatcagggccgaggtgatgacagcgcactggtag1980tttgctgctaattcttgtccgtcgga卿gtgatttttatcagccatcctagtcgaatcg2040ccatttgttcataccaaccaattggcccaatgtagccagct3caact3tgttttgatgta2100tattgcttgatttgctccttgatgtgccgccttggatatcggtgacccgaaaaca_gc3gg2160agcccaaggaacggtacccc2180權利要求1、含有反向的OsBAK1-1基因片段的重組載體，所述OsBAK1-1基因片段是將序列表中序列1所示的基因用KpnI和SacI雙酶切得到的基因片段。2、根據權利要求1所述的重組載體，其特征在于所述重組載體是將麗A片段A導入骨架質粒中得到的重組載體；所述骨架質粒是pCAMBIA1301;所述DNA片段A是含有反向的0創A7-7基因的DNA片段。3、根據權利要求2所述的重組載體，其特征在于所述DNA片段A自上游至下游依次包括UbiPro、反向的fe別^7-J基因片段和Noster。4、根據權利要求l-3任一所述的重組載體，其特征在于所述重組載體是將0sBAK1-l基因片段反向插入質粒p麗1301的多克隆位點中，得到的重組載體；所述&^4A7-7基因片段是將序列表中序列1所示的基因用5kc/雙酶切得到的基因片段；所述質粒pUN1301是用包含UbiPro和Noster的片段插入質粒pCAMBIA1301中，得到的重組質粒；所述包含UbiPro和Noster的片段是用I和歷Vdni載體pUN19，得到的2.3kb的片段；所述pUN19是將UbiPro插入質粒pUC19-Noster中，得到的載體；所述質粒pUC19-Noster是將NosterpolyA終止序列插入pUC19，得到的重組質粒；所述NosterpolyA終止序列是用&c1和I雙酶切pBI221得到的序列。5、含有權利要求l-4任一所述的重組載體的重組菌。6、一種培育葉夾角改變的轉基因水稻的方法，是將&^^7基因或反向的6te^4A7-7基因片段導入目的水稻中，得到葉夾角改變的轉基因水稻，所述&^^7基因是序列1的自5'端第1-2180位所示的DNA分子；所述fls別A7-7基因片段是將序列表中序列1所示的基因用《/m/和5"acJ雙酶切得到的基因片段。7、根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述反向的^^4A7^基因片段是通過權利要求l-4任一所述的重組載體導入水稻中的；所述葉夾角改變的轉基因水稻是與目的水稻相比，葉夾角變小的轉基因水稻。8、權利要求6或7所述的方法在培育水稻新品種的應用。9、根據權利要求8所述的應用，其特征在于所述水稻新品種是水稻單產提高的品種。全文摘要本發明公開了一種培育葉夾角改變的轉基因水稻的方法及其專用重組載體。本發明提供的重組載體，是含有OsBAK1-1基因片段的重組載體，所述OsBAK1-1基因片段是將序列表中序列1所示的基因用KpnI和SacI雙酶切得到的基因片段。將該重組載體導入水稻，得到轉基因水稻，該轉基因的水稻葉直立，可以提高單產。文檔編號C12N15/84GK101659965SQ200910091548公開日2010年3月3日申請日期2009年8月25日優先權日2009年8月25日發明者丹李,康種,許智宏,家黎申請人:中國科學院植物研究所