專利名稱：一種花生基因組dna的提取方法
技術領域：
本發明涉及基因組DNA的提取方法，具體涉及一種花生基因組DNA的提取方法。
背景技術：
花生又名落花生，屬一年生草本植物，其含油量高，被人們譽為“植物肉”。除供食用外，還可用于印染、造紙工業等，是我國重要的油料和經濟作物。我國的花生種植面積和生產總量均居世界前列在國際上具有很強的競爭力。但是，我國目前花生的種質資源相對有限，一些抗病抗逆的種質資源相對缺乏，尤其是抗黃曲霉品種。常規的雜交育種、誘變育種都很難有目的性地進行花生遺傳基因改良。而轉基因育種可以任意選擇生產上的當家品種進行外源基因的導入，達到目的性狀基因的轉移和種質改良的目的?，F有花生轉基因育種的常用方法有農桿菌介導法和基因槍法。無論采用何種方法，提取組織培養的外植體的基因組DNA、對轉化體進行分子鑒定從而篩選轉化體都是必經的途徑。由于花生體內含有的次生代謝物質較多，所以花生基因組的提取相對較難。目前廣泛應用的技術方案有CTAB、酚類法大量提取，這些方法均存在以下缺陷1、對操作人員身體有害；2、需要較多的樣品，步驟繁瑣、耗時，對植株也有影響。植物基因組DNA的提取和鑒定是進行植物生物技術試驗所必需的試驗內容，高質量的植物基因組DNA對于后續試驗非常有利。發明一種快速提取花生基因組DNA的方法，減小DNA提取實驗過程中對實驗人員身體的傷害，有利于開展花生的生物技術試驗。

發明內容
本發明的目的在于克服上述現有技術的缺陷，提供一種快速提取花生基因組DNA的方法，其提取周期短、成本低、步驟簡單且對實驗人員無傷害。為實現上述目的，本發明采用如下技術方案
一種花生基因組DNA的提取方法，其包括以下步驟
1)將花生葉片磨成粉末；
2)加入溶液A和終濃度為lmg/ml的RNA酶，充分混勻后靜置；
3)加入KAc充分混勻后進行第一次離心分離；
4)取步驟3)得到的上清液加入異丙醇，充分混均，此時出現絮狀的核酸，進行第二次離心分離或者挑取出絮狀物質，然后用體積濃度為75%的乙醇漂洗絮狀物質，漂洗后干燥，再用無菌的ddH20溶解干燥所得的沉淀物；
上述步驟中所述溶液A是由IM Tris-HCUO. 5M EDTA、5M NaCl、質量濃度為20%的SDS、H2O按體積比為I :1 1 :1 :6混勻，再按混合溶液體積的2%加入β-巰基乙醇，最后加入終濃度為40-50mg/l的RNA酶制成的。優選地，為了瞬間凍結樣品，抑制樣品中的一些酶如DNA酶，RNA酶，多酚氧化酶等活性，步驟I)花生葉片是用液氮研磨成粉末的。優選地，步驟2)中每克花生葉片粉末加入的溶液A的體積為1-2. 5ml，更優選地，每克花生葉片粉末加入的溶液A的體積為I. 5-2 ml。優選地，步驟2)中常溫靜置5-10分鐘。優選地，為了使核蛋白復合體中的蛋白質充分變性，將DNA與蛋白質、多酚、多糖等物質分離，步驟3)中KAc先經過預冷處理，預冷至4°C后再加入，低溫更有效地抑制內源DNA酶的活性，保護DNA的完整性。 優選地，步驟3)中加入的KAc的濃度為5M，其加入量為溶液A的體積的1/3。優選地，步驟4)中異丙醇的加入量與上清液的體積相等。優選地，為了充分地分離上清液與殘渣，第一、二次離心分離的轉速為8000-15000rpm,時間為 8-15 分鐘。更優選地，第一、二次離心分離的轉速為10000-12000rpm，時間為10分鐘。優選地，步驟4)無菌的ddH20的用量為O. 05_2ml。與現有技術相比，本發明的有益效果是
1、本方法需要的試劑品種少且較便宜，對試驗人員身體無傷害；
2、本方法步驟少、流程簡單，方便快捷可操作性強，提取花生基因組DNA的整個流程僅需要25-45分鐘，能適用于大量待檢測花生基因組DNA提取；
3、本方法能適用于微量和大量的花生基因組DNA提取，可滿足不同的實驗要求。


圖I是用NanoDrop-1000超微量核酸蛋白測定儀檢測微量花生基因組DNA的結果 圖2是用NanoDrop-1000超微量核酸蛋白測定儀檢測大量花生基因組DNA的結果圖；圖3是對花生基因組DNA進行酶切的電泳圖，圖中I為BamH I酶切的結果，2為EcoR I酶切的結果，3為Hind III酶切的結果，4為Kpn I酶切的結果，5為Pst I酶切的結果，6為花生基因組DNA ；
圖4為PCR電泳檢驗結果，其中1-3為轉基因植株bar基因的檢測，+為陽性對照，M為DL2000 DNA marker0
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例子對本發明一種花生基因組DNA的提取方法作進一步詳細說明。實施例I
一種花生基因組DNA的提取方法，其包括以下步驟
I)將花生葉片置于離心管或研缽中，加入液氮，磨成粉末；2)取步驟I)得到的粉末O.3-0. 5g，加入O. 75ml溶液A和10mg/ml的RNA酶4ul，使得終濃度為lmg/ml，充分混均后在常溫下靜置5-10分鐘；
3)取體積O.25ml的KAc,先預冷至4°C后再加入，充分混均后進行離心分離，轉速為8000-15000rpm,時間為 8-15 分；
4)取步驟3)得到的上清液加入等體積量的異丙醇，充分混均，此時出現絮狀的核酸，再進行離心分離，轉速為8000-15000rpm，時間為8_15分，然后用體積濃度為75%的乙醇漂洗離心分離得到的絮狀物質，漂洗后干燥，再用O. 05-2 ml無菌的ddH20溶解干燥所得的沉淀物，得到DNA提取液。上述步驟中所述溶液A是IM Tris-HCl,0. 5M EDTA, 5M NaCl，質量濃度為20%的SDS，H2O按體積比為I :1 :1 :1 :6混均，再按混合溶液體積的2%加入β -巰基乙醇，最后加入終濃度為40-50mg/l的RNA酶制成的。實施例2
一種花生基因組DNA的提取方法，其包括以下步驟
1)將花生葉片置于離心管或研缽中，加入液氮，磨成粉末；
2)取步驟I)得到的粉末5-7g，加入9ml溶液A和10mg/ml的RNA酶45ul，充分混均后在常溫下靜置5-10分鐘；
3)取體積3ml的KAc,先預冷至4°C后再加入，充分混均后進行離心分離，轉速為8000-15000rpm,時間為 8-15 分；
4)取步驟3)得到的上清液加入等體積量的異丙醇，充分混均，此時出現絮狀的核酸，挑取出絮狀物質，用體積濃度為75%的乙醇漂洗絮狀物質，漂洗后干燥，再用O. 05-2ml無菌的ddH20溶解干燥所得的沉淀物，得到DNA提取液。上述步驟中所述溶液A是IM Tris-HCl,0. 5M EDTA, 5M NaCl，質量濃度為20%的SDS，H2O按體積比為I :1 :1 :1 :6混均，再按混合溶液體積的2%加入β -巰基乙醇，最后加入終濃度為40-50mg/l的RNA酶制成的。實施例3
用NanoDrop-1000超微量核酸蛋白測定儀檢測實施例I制得的花生基因DNA的質量，結果如圖I所示。由圖I可知，D260/D280的值均在I. 8-2. O之間，且測得的濃度在600ng/ul以上，說明此方法提取花生基因組DNA是可行的。實施例4
用NanoDrop-1000超微量核酸蛋白測定儀檢測實施例2制得的花生基因DNA的質量，結果如圖2所示。由圖2可知，D260/D280的值均在I. 8-2. O之間，且測得的濃度在600ng/ul以上，說明此方法提取花生基因組DNA是可行的。實施例5對提取的花生基因DNA進行酶切電泳檢測
如圖3所示，直接應用實施例2所提取基因組DNA進行不同酶切，經電泳檢測可見，均用2ul的基因組DNA進行6小時的酶切，由圖3中的2孔和3孔可見酶切效果良好，說明所提取的花生基因組DNA在未經純化處理的條件下，對基因組DNA質量要求較高的酶切無影響。實施例6 PCR檢測
直接應用實施例I所提取的基因組DNA進行PCR擴增，結果如圖4所示，經電泳檢測，效果相當好，擴增條帶清晰，說明所提取的花生基因組DNA在未經純化處理的條件下，可直接用于常規的生物技術操作。上述實施例僅為本發明的優選實施案例不能以此來限定本發明的保護范圍，本領域的技術人員在發明的基礎上所做的任何非實質性的變換及替換均屬于本發明所要求保護的范圍。權利要求
1.一種花生基因組DNA的提取方法，其特征在于包括以下步驟 1)將花生葉片磨成粉末； 2)加入溶液A和終濃度為lmg/ml的RNA酶，充分混勻后靜置； 3)加入KAc充分混勻后進行第一次離心分離； 4)取步驟3)得到的上清液加入異丙醇，充分混均，此時出現絮狀的核酸，進行第二次離心分離或者挑取出絮狀物質，然后用體積濃度為75%的乙醇漂洗絮狀物質，漂洗后干燥，再用無菌的ddH20溶解干燥所得的沉淀物； 上述步驟中所述溶液A是由IM Tris-HCUO. 5M EDTA、5M NaCl、質量濃度為20%的SDS、H2O按體積比為I :1 1 :1 :6混勻，再按混合溶液體積的2%加入β-巰基乙醇，最后加入終濃度為40-50mg/l的RNA酶制成的。
2.如權利要求I所述的花生基因組DNA的提取方法，其特征在于步驟I)花生葉片是用液氮研磨成粉末的。
3.如權利要求I所述的花生基因組DNA的提取方法，其特征在于步驟2)中每克花生葉片粉末加入的溶液A的體積為1-2. 5ml。
4.如權利要求I所述的花生基因組DNA的提取方法，其特征在于步驟2)中常溫靜置5-10分鐘。
5.如權利要求I所述的花生基因組DNA的提取方法，其特征在于步驟3)中KAc先經過預冷處理，預冷至4°C后再加入。
6.如權利要求I所述的花生基因組DNA的提取方法，其特征在于步驟3)中加入的KAc的濃度為5M，其加入量為溶液A的體積的1/3。
7.如權利要求I所述的花生基因組DNA的提取方法，其特征在于步驟4)中異丙醇的加入量與上清液的體積相等。
8.如權利要求I所述的花生基因組DNA的提取方法，其特征在于第一、二次離心分離的轉速為8000-15000rpm，時間為8-15分鐘。
9.如權利要求8所述的花生基因組DNA的提取方法，其特征在于第一、二次離心分離的轉速為10000-12000rpm，時間為10分鐘。
10.如權利要求I所述的花生基因組DNA的提取方法，其特征在于步驟4)無菌的ddH20 的用量為 O. 05-2ml。
全文摘要
本發明涉及一種花生基因組DNA的提取方法，其包括以下步驟1)花生葉片磨成粉末；2)加入溶液A和終濃度為1mg/ml的RNA酶；3)加入KAc后進行離心分離；4)取步驟3)得到的上清液加入異丙醇，進行離心分離或者挑取出絮狀物質，用體積濃度為75%的乙醇漂洗絮狀物質，干燥，再用無菌ddH2O溶解干燥所得的沉淀物；上述步驟中所述溶液A是由1MTris-HCl、0.5MEDTA、5MNaCl、質量濃度為20%的SDS、H2O按體積比為11116混勻，再按混合溶液體積的2%加入β-巰基乙醇、終濃度為40-50mg/l的RNA酶制成的。本發明的方法安全、快捷、高效，可滿足不同的實驗要求。
文檔編號C12N15/10GK102732508SQ20121023262
公開日2012年10月17日 申請日期2012年7月5日 優先權日2012年7月5日
發明者劉海燕, 李洪杰, 梁炫強, 洪彥彬, 溫世杰 申請人:山東圣豐種業科技有限公司, 廣東省農業科學院作物研究所