專利名稱：檢測轉基因水稻品系科豐8號的引物和探針、試劑盒和方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域。更具體地，本發明涉及用于通過實時PCR法檢測轉基因水稻品系科豐8號或其組分的引物和探針，包含所述引物和探針的試劑盒，以及利用所述引物和探針檢測轉基因水稻品系科豐8號成分或其組分的實時PCR檢測方法。
背景技術：
轉基因生物是指利用生物技術，將外源基因轉移到其它物種中以改造其遺傳特性，從而獲得人類所需的性狀、營養品質而產生的生物新品種。以轉基因生物或以其為原料加工而來的食品農產品就是轉基因食品農產品。從1994年第一例轉基因食品農產品(轉基因番茄)在美國誕生至今，轉基因生物已廣泛進入食品飼料領域。轉基因抗蟲水稻的培育水稻(Oryza sativa L.)是中國最大宗糧食作物，年產量在2億噸左右，約占中國糧食總產量的40%。水稻生產中的主要害蟲為鱗翅目害蟲，主要包括二化螟(Chilosuppressalis)、三化螟(Tryporyza incertulas)、稻縱卷葉螟(Chaphalocrocis medina)和大螟(Sesamia inferens),以及屬于同翅目害蟲的褐飛風(Milaparvata lugens, Stal)、白背飛風(Sogatella furcifera, Horv6th)等,嚴重影響中國大米生產。培育轉基因抗蟲水稻是防治的有效途徑。蘇云金芽抱桿菌殺 蟲晶體蛋白(Bacillus thringiensis insecticidalcrystalprotein ；Bt蛋白)，是蘇云金桿菌芽孢形成過程中產生的伴胞晶體,該蛋白對鱗翅目和部分鞘翅目昆蟲具高度特異的殺蟲活性，在靶昆蟲堿性腸道內溶解并經中腸蛋白酶的消化后，成為具有活性的毒性肽，與昆蟲中腸的膜受體特異結合，形成跨膜離子通道，破壞消化道細胞的滲透壓，最終致死昆蟲。由于Bt蛋白在哺乳動物中無結合位點，且在人體內可被快速消化，因此對人和家畜無毒，在有機農業中已使用了 50多年。St豆胰蛋白酶抑制劑基因(Cowpea trypsin inhibitor, CpTI)是另一類常用的抗蟲基因。在自然界CpTI主要存在于豇豆種子中，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族，被害蟲攝食后，CpT能抑制其腸道內胰蛋白酶的活性，同時產生厭食反饋信號，致使害蟲進食減少，最終抑制其生長發育。中科院遺傳所與福建農科院等將密碼子優化的CrylAc基因和CpTI基因轉入水稻品種明恢86中，經自交選育獲得轉基因自交系科豐8號，經農業部批準進行了中間試驗、環境釋放和生產性試驗，有望在不久的將來在農業生產上應用。轉基因食品的管理要求已完成的安全試驗和環境釋放試驗結果顯示，轉基因水稻具有食用安全和生態安全、抗蟲效果優良等特點。作為食品或飼料，轉基因作物與常規品種沒有實質差別。但轉基因食品農產品作為一種新技術產品，消費者仍憂慮其安全性。世界上主要國家立法對轉基因產品進行管理，美加、歐盟、日本、韓國、澳新的法律明確規定，轉基因動植物品種需經政府批準，并經嚴格的生物安全、環境安全測試才可以田間種植、環境釋放及作為食品、飼料，歐盟、日本、韓國、澳新等要求轉基因食品進行標識，并規定了相應閾值水平。中國于2001年5月23日頒布《農業轉基因生物安全管理條例》也有相應的安全管理規定。2002年3月20日開始實行的《農業轉基因生物標識管理辦法》也規定了轉基因食品、農產品的標識制度。轉基因產品檢測是執法的關鍵措施之一，需要通過定性檢測確定轉基因的種類，鑒別其是否為已批準的或已獲準用于食品、飼料、農產品，以防止具有風險的未知轉基因產品的任意擴散，對社會產生危害；還需要通過定量檢測確定轉基因產品的含量，明確是否已達到所在國家規定的閾值水平，因為每個國家轉基因標識的閾值水平都不相同。轉基因食品的檢測方法與蛋白表達具有組織特異性相比，核酸檢測不受到材料種類的限制，且核酸比蛋白穩定，在加工食品、飼料、農產品中仍可檢出，因此，食品、飼料、農產品的轉基因檢測中主要檢測轉基因核酸。當外源基因插入到受體細胞染色體時，同時攜有啟動子、終止子、選擇標記基因和報告基因，如花椰菜花葉病毒(CaMV) 35s啟動子，胭脂堿合酶NOS終止子等，核酸檢測的靶標是插入的外源基因，包括外源基因的整合位點、啟動子、終止子、選擇基因的序列。核酸的檢測方法包括常規PCR方法和實時PCR方法(Real-time PCR)，其中，實時熒光定量PCR是在常規PCR方法的基礎上建立起來的。在實時PCR體系中，除了兩條普通的引物外，還有一條在5’ -和3’ -端分別標記了報告熒光染料基團(R)、猝滅熒光染料基團(Q)、并與PCR產物特異結合的寡核苷酸探針。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被 淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’-外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅基團分離，從而熒光監測系統可以接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光報告分子被釋放，從而實現了熒光信號的積累與PCR產物形成的完全同步。以標準品制備內源基因和外源基因標準曲線，獲得PCR模板的起始拷貝數，計算待檢產品中的轉基因含量。因此，具有常規PCR不能無法比擬的優點。轉基因的標識需求和一些法規對轉基因成分含量的限制，要求對食品中轉基因成分進行定量檢測。實時PCR方法已被歐盟、日本等作為食品、飼料、農產品等轉基因檢測的標準方法。實時PCR方法的關鍵是引物和探針設計，引物長度在17_30nt之間，嚴格限制上下游引物的配對和引物自身配對；探針長度在20-30nt之間，且Tm值在65-75度之間，并高于引物Tm值10度以上。目前，國內外少見報道能快速、簡單、特異且靈敏地檢測轉基因水稻品系科豐8號或其組分的方法。因此，本領域需要一種操作簡單、快速、特異性好、靈敏度高的轉基因水稻品系科豐8號或其組分檢測方法。

發明內容
本發明的一個目的在于，提供用于通過實時PCR方法檢測轉基因水稻品系科豐8號或其組分的特異性寡核苷酸引物及探針。
本發明的另一個目的在于，提供轉基因水稻品系科豐8號或其組分的實時熒光PCR檢測方法。本發明的再一個目的在于，提供用于通過實時PCR方法檢測轉基因水稻品系科豐8號或其組分的試劑盒。本發明的再一個目的在于，提供本發明的特異性寡核苷酸引物和探針或試劑盒在檢測轉基因水稻品系科豐8號或其組分中的應用。針對上述發明目的，本發明提供以下技術方案根據本發明的第一方面，本發明提供了用于通過實時PCR方法檢測轉基因水稻品系科豐8號或其組分的特異性寡核苷酸引物對及探針。在一個實施方式中，所述引物對由上游引物和下游引物組成，所述上游引物為KF8-Fl: 5’ -CCCTGCAGACTGGCCATCAA-3’ (SEQ ID NO:1),所述下游引物為 KF8-R: 5’ -GCGAATGCTAGAGCAGCTTGAGC-3’ (SEQ ID NO:2);所述探針為KF8_P:5’-AGGCGGGAAACGACAATCTGATCC-3’ (SEQ ID N0:3)，在探針的3’端連接有熒光淬滅基團BHQl，5’端連接有熒光報告基團FAM。第二方面，本發明提供轉基因水稻品系科豐8號或其組分的實時PCR檢測方法，所述方法包括使用本發明第一方面所述的特異性寡核苷酸引物對和探針。在一個實施方式中，本發明的轉基因水稻品系科豐8號或其組分的實時PCR檢測方法包括如下步驟(a)從待測廣品中提取DNA樣品；和

(b)使用本發明第一方面所述的特異性寡核苷酸引物對及探針通過實時PCR方法進行核酸PCR擴增反應和檢測擴增產物。在一個優選的實施方案中，所述PCR擴增的反應參數為95°C，IOmin的起始變性；和950C 15s ；60°C, Imin的45個擴增循環。在本發明方法的優選實施方案中，所使用的本發明的特異性寡核苷酸引物對及探針包含以下特異性寡核苷酸引物對和探針堿基序列為SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2的寡核苷酸引物對以及堿基序列為SEQ ID NO:3的探針，在探針的3’端連接有熒光淬滅基團BHQl，5’端連接有熒光報告基團FAM。第三方面，本發明提供用于檢測轉基因水稻品系科豐8號或其組分的試劑盒，所述試劑盒包括本發明第一方面所述的特異性寡核苷酸引物對以及探針。在本發明的試劑盒的優選實施方案中，所述試劑盒包含以下特異性寡核苷酸引物對和探針堿基序列為SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2的寡核苷酸引物對以及堿基序列為SEQID NO:3的探針，在探針的3’端連接有熒光淬滅基團BHQ1，5’端連接有熒光報告基團FAM。在優選的實施方案中，所述試劑盒還包括用于樣品DNA提取的試劑和用于PCR反應的試劑以及使用說明書。在一個優選的實施方案中，所述試劑盒中的使用說明書包括對用于快速檢測轉基因水稻品系科豐8號或其組分的PCR擴增條件的描述。第四方面，本發明提供本發明第一方面所述的特異性寡核苷酸引物對和探針在檢測轉基因水稻品系科豐8號或其組分中的應用。第五方面，本發明還提供本發明的試劑盒在檢測轉基因水稻品系科豐8號或其組分中的應用。本發明以轉基因水稻品系科豐8號的DNA為檢測基礎，提供了用于通過實時PCR方法檢測轉基因水稻品系科豐8號或其組分的特異性寡核苷酸引物及探針、試劑盒和檢測方法。本發明的實時熒光PCR檢測方法由于使用熒光染料實時顯示PCR產物的動態積累，在整個檢測過程中閉管操作，沒有PCR后處理過程，有效地解決了 PCR后污染問題。使用本發明的實時熒光PCR檢測方法，能夠簡單、快速、特異且靈敏地檢測出含有轉基因水稻品系科豐8號的農廣品、食品。


圖1:顯示本發明寡核苷酸引物及探針的檢測特異性的實時PCR檢測結果，其中使用特異性寡核苷酸引物對KF8-F1(SEQ ID NO:1)和KF8_R(SEQID NO:2)和探針KF8_P(SEQID NO:3)進行檢測。熒光曲線編號與樣品對應如下基線以上的熒光曲線為轉基因水稻品系科豐8號樣品(2次重復)，基線位置為抗優97、科豐6號、華恢I號、克螟稻KMD1、LL62、LL601、T2a-1、巴呑米、K105、培雜35、津稻9618、皖稻181、春優59、陰性對照明恢63及空白對照。這些水稻品種由國家農業部門命名，為本領域所公知。圖1的橫坐標為PCR循環數，縱坐標為熒光值。圖2 :顯示轉基因水稻品系科豐8號組分的實時PCR定量檢測限，其中使用特異性寡核苷酸引物對KF8-F1(SEQ ID NO:1)和KF8_R(SEQ ID NO: 2)和探針KF8-P (SEQ ID NO:3)進行檢測。熒光曲線從左向右依次為相對質量分數為O. 2%、0. 1%、0.01%、0.001% (W/W)的轉基因水稻品系科豐8號組分的擴增圖(各2次重復)。圖2的橫坐標為PCR循環數，縱坐標為熒光值。
具體實施方式
通過實施例的方式對本發明作進一步的說明，但是本發明并不僅僅局限于以下實施例。實施例1 :特異性測試本實施例測試了本發明寡核苷酸引物及探針的特異性，其中使用特異性引物KF8-F1/R，即所使用的寡核苷酸引物的堿基序列為SEQ ID NO:1和SEQID NO: 2，探針的堿基序列為KF8-P(SEQ ID NO: 3)，在探針的3’-端連接有一個熒光淬滅基團BHQ1，5’-端連接有一個突光報告基團FAM。在本實施例中，檢測了轉基因水稻品系科豐8號樣品，以及親緣相近的常見水稻品系的樣品，包括抗優97、科豐6號、華恢I號、克螟稻KMDl、LL62、LL601、T2a-l、巴吞米、K105、明恢63、培雜35、津稻9618、皖稻181、春優59。此外，使用不含DNA的樣品作為空白對照。主要檢測儀器微量移液器(lOOOuL、100uL、IOuL或 20uL、2. 5uL ；Eppendorf);熒光定量 PCR儀(ABI7700);高速臺式離心機(Picol7Thermo ;12000r/min);高速粉碎機(IKA-WEARKEGERMANY);凝膠成像系統；電泳儀(DYY22C型)；核酸蛋白分析儀(DYY-6C北京六一儀器廠)；聞壓滅菌鍋；制冰機等。移液器Tips :務必使用帶濾芯的型號，否則在混勻和分樣時非常容易污染；同時IOuL和2. 5uL的移液器務必使用長Tips，普通短Tips在工作時，移液器桿部可能會與離心管內壁接觸，造成污染。豐要試劑Taq 酶、dNTPs、10XPCR Buffer、溴化乙淀、DNA Ladder Marker (Takara) ；TaqManUniversal PCR Master Mix (ABI)；上游引物為KF8-F1:5’-CCCTGCAGACTGGCCATCAA-3’ (SEQ ID NO:1)，下游引物為 KF8-R:5’-GCGAATGCTAGAGCAGCTTGAGC-3’ (SEQ IDNO :2);探針為 KF8_P:5’-AGGCGGGAAACGACAATCTGATCC-3’ (SEQ IDNO: 3)，在探針的3’端連接有一個熒光淬滅基團BHQl，5’端連接有一個熒光報告基團FAM。上述引物和探針通過本領域公知的常規多核苷酸合成技術制備。主要檢測步驟1. DNA 提取 可以采用CTAB分步離心法進行DNA純化。也可以使用商購的植物基因組DNA純化試劑盒，如植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱型；可購自Qiagen公司或天根生化科技有限公司)等進行DNA純化。待測品系樣品為科豐8號、抗優97、科豐6號、華恢I號、克螟稻KMD1、LL62、LL601、T2a-l、巴吞米、K105、明恢63、培雜35、津稻9618、皖稻181和春優59。CTAB分步離心法描述于Wang, W, et al. , Simultaneous Detection of EightFoodAllergens Using OpticalThin-Film Biosensor Chips, Journal of agriculturalandfood chemistry. 2011，59，6889-6894。簡要而言，包括以下步驟稱取50. Omg樣品粉末，加入LOml CTAB提取緩沖液及4. O μ L蛋白酶K(IOmg/ml)，65°C溫浴孵化Ih ；以12000rpm離心15min,取幾近清澈的上清700 μ I ;加入500 μ L氯仿，高速潤旋混合30秒；以12000rpm離心IOmin,收集500 μ L上清,轉移到新的1. 5ml反應管中；加入兩倍體積的CTAB沉淀緩沖液，室溫，孵育Ih ；以12000rpm離心5min棄上清,將沉淀溶于350 μ L的1. 2mol/L的氯化鈉溶液中，充分溶解；加入350 μ L三氯甲烷，小心高速渦旋混合30秒；以12000rpm離心lOmin，將上清轉移到新的反應管中；加入0. 8倍的異丙醇，室溫孵育至少20min ；以12000rpm離心IOmin,棄上清；在沉淀中加入500 μ L70%乙醇,高速潤旋30秒；以12000rpm 離心 lOmin，棄上清，60°C干燥 15_25min，并溶于 50 μ LTE (ρΗ8· 0)。取3μ I提取的DNA樣品，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據其亮度和擴散程度判斷DNA的質量。獲得的基因組DNA樣品-20 °C保存備用。每次提取均設立相應的空白對照(以雙蒸水代替樣品)。2.樣品總DNA濃度的測定純化的樣品基因組DNA可以利用紫外分光光度法測定濃度。分別測定DNA在260nm和280nm波長下的吸收光值，并根據測定的吸收光值計算測定的DNA濃度。3.實時PCR操作流程I).實時 PCR 體系
表1:水稻品系科豐8號轉化事件特異性PCR體系
權利要求
1.用于通過實時PCR方法檢測轉基因水稻品系科豐8號或其組分的寡核苷酸引物對及探針，其中所述引物對和探針為堿基序列為SEQ ID No.1和SEQ IDNo. 2的寡核苷酸引物對以及堿基序列為SEQ ID No. 3的探針，在探針的3’端連接有熒光淬滅基團BHQl，5’端連接有熒光報告基團FAM。
2.用于通過實時PCR方法檢測轉基因水稻品系科豐8號或其組分的試劑盒，其包括權利要求I所述的寡核苷酸引物對及探針。
3.根據權利要求2所述的試劑盒，其還包括用于提取DNA的試劑、用于實時PCR的試齊U、空白對照以及使用說明書。
4.用于檢測檢測轉基因水稻品系科豐8號或其組分的實時PCR方法，所述方法包括使用權利要求1所述的寡核苷酸引物對及探針，或權利要求2或3所述的試劑盒。
5.根據權利要求4所述的實時PCR方法，其為Taqman熒光探針法。
6.根據權利要求4或5所述的實時PCR方法，所述方法包括如下步驟 (a)從待測產品中提取DNA樣品；和 (b)使用權利要求1所述的寡核苷酸引物對及探針，或權利要求2或3所述的試劑盒，通過實時PCR方法進行核酸擴增反應和檢測擴增產物。
7.根據權利要求4-6中任一項所述的實時PCR方法，其中所述實時PCR方法進行核酸擴增的反應參數為95°C, IOmin的起始變性；和95°C 15s ；60°C,lmin的45個擴增循環。
8.權利要求1所述的特異性寡核苷酸引物對及探針在檢測轉基因水稻品系科豐8號或其組分中的應用。
9.權利要求2或3所述的試劑盒在檢測轉基因水稻品系科豐8號或其組分中的應用。
全文摘要
本發明涉及用于通過實時PCR法檢測轉基因水稻品系科豐8號或其組分的引物和探針，包含所述引物和探針的試劑盒，以及利用所述引物和探針檢測轉基因水稻品系科豐8號成分或其組分的實時PCR檢測方法。
文檔編號C12N15/11GK103060459SQ201310018200
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月17日 優先權日2013年1月17日
發明者黃文勝, 陳穎, 鄧婷婷, 付凱 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院