專利名稱：肺癌驅動性基因突變的檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體地涉及肺癌驅動性基因突變的檢測試劑盒。
背景技術：
肺癌是世界范圍內常見的癌癥，發病率和死亡率居各癌癥之首。2002年全世界肺癌的新發病率為138萬，近一半09.9%)發生在發展中國家。據2008年我國衛生部的統計，肺癌死亡率為30. 83/10萬。肺癌已經成為發病率和死亡率第一位的惡性腫瘤，肺癌的死亡例數遠大于乳腺癌、結腸癌和前列腺癌死亡例數的總和(Orras JM, Fernandez Ε, Gonzalez JR, et. , al. Lung cancer mortality in European regions(1955-1997). Ann Oncol, 2003,14(1) :159-161 ；中華人民共和國衛生部，《2008年中國衛生統計》年鑒)。肺癌從組織病理學上可以分為兩大類小細胞癌(SCLC)和非小細胞癌(NSCLC)， 其中非小細胞癌約占所有肺癌病例數85%，包括鱗癌、腺癌和大細胞癌。發達國家的肺癌患者的5年生存率為15-20%，而我國肺癌患者5年生存率僅為10%。其主要原因是大多數肺癌由于缺乏高靈敏度的基因突變檢測和確診技術，以及與之相匹配的科學的治療方案， 從而失去了治療的最佳時機。因此，肺癌的基因突變檢測和診斷技術，對于制定與之相匹配的科學有效的化療方案，提高肺癌患者的生存率，延長生存期有著重大的現實意義。肺癌的發生主要是由于暴露于致癌環境下，引起驅動性基因突變，導致突變細胞過度增殖而形成。肺癌的驅動性基因突變是一種惡性的基因突變，是導致肺癌發生、增值、 轉移和耐藥的最根本的原因。美國國立癌癥研究所的肺癌突變聯盟組織14家研究單位，對 1000例的肺腺癌的驅動突變進行檢測。結果顯示約60%的患者含有驅動性基因突變(Mark G. Kris, et al. Molecular Profiling Defines New Potential Targets for Lung Cancer Treatment. ASC0. 2011，)。進一步表明了檢測肺癌驅動性突變對于肺癌的早期診斷，和化療靶向用藥的預后有著重要意義。現任 ASCO (American Society of Clinical Oncology)主席 George W. Sledge 認為基因組的研究迎來了腫瘤治療的新紀元。根據基因分析，可分為“愚蠢”和“聰明”兩類腫瘤，前者腫瘤，多為純質性的單個驅動突變，治療效果較好，即便耐藥，也發生較遲；而后者多屬異質性，即一種優勢驅動突變與多重驅動突變并存的腫瘤，常見早發耐藥。預示了癌癥的治療已進入了基因突變特異性治療(Mutation Specific Therapy)的到來，即必須依據患者腫瘤基因突變分子來選擇治療藥物，而不是依靠傳統的腫瘤組織病理學分類來進行化療。因此，肺癌的驅動性突變的檢測是肺癌靶向藥物的開發與用藥的前提和基礎。多項研究證實，肺癌的驅動性基因突變主要包括EGFR、KRAS, EML4-ALK、BRAF, PUCA、AKTl、MEKl、MET、HER2、NAS和AKT等驅動性突變。研究顯示在肺癌中EGFR、KRAS、 BRAF和EML4-ALK的驅動性突變率約占總突變的60 %，其中EGFR驅動突變為20-30 % ,KRAS 驅動突變為20%、BRAF驅動突變為5%、EML4-ALK驅動突變為7% (Pao W, Girard N. New driver mutations in non-small-cell lung cancer. Lancet Oncol 2011. 12. 175-80 ； Mark G.Kris, et al. Molecular Profiling Defines New Potential Targets for LungCancer Treatment. ASCO. 2011)。表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Rec印tor，EGH )是一種酪氨酸激酶受體，由其介導的信號傳導是包括肺癌在內的多種癌癥的主要發病機理之一，是肺癌化療的最主要靶點之一。目前，臨床上EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)靶向治療的藥物主要有Iressa (易瑞沙)和Tarceva (特羅凱)。研究顯示，這兩種藥物的療效與肺癌患者組織中的EGFR基因外顯子18-21上的突變呈正相關(Lynch TJ et al. N. Engl. J. Med. 2004 ； 350)。2011年《美國國立癌癥綜合網絡(NCCN)臨床實踐指南》明確指出，EGFR基因是人體腫瘤中最常見的驅動性突變基因，在肺癌患者接受靶向藥物化療之前必須進行EGFR基因突變檢測。因此，檢測EGFR驅動性突變，可以有效預測上述兩種藥物的治療的療效。KRAS基因參與編碼細胞內信號傳遞的蛋白，KRAS基因突變，主要集中發生在12、 13,61特定的密碼子上，占突變的90%以上。目前，臨床上靶向藥物Cetuximab (愛必妥) 和Panitumumab (帕尼單抗)對無突變的KRAS基因有較好的治療效果，對突變的KRAS基因患者無效。2011年《美國國立癌癥綜合網絡(NCCN)臨床實踐指南》明確指出，KRAS 基因是人體腫瘤中最常見的驅動性突變基因，在肺癌患者接受靶向藥物化療之前必須進行KRAS基因突變檢測。當KRAS驅動基因突變發生時，不建議病人使用Cetuximab (愛必妥)或I^anitumumab (帕尼單抗)進行分子靶向治療(Lievre et al. KRAS Mutations As an Independent Prognostic Factor in Patients With Advanced Colorectal Cancer Treated With Cetuximab. J. Clin. Oncol. 2008 ；26)。因此，KRAS 驅動突變基因的檢測，可以預后Cetuximab (愛必妥)或Panitumumab (帕尼單抗)兩種藥物的療效。BRAF基因是RAF-MEK-ERK信號轉導通路中的主要成員之一，是一種絲/蘇氨酸特異性激酶，在細胞增值、分化和凋亡方面發揮主要作用。約90 %的BRAF基因突變發生在 Exon 15的1799核苷酸上，導致其編碼的谷氨酸由纈氨酸取代(V600E)。研究發現，V600E突變可模擬T599和S602兩個位點的磷酸化過程，從而使BRAF蛋白激活異常。臨床研究表明， 靶向藥物Sorafenib (索拉非尼)和PLX4032與BRAF基因驅動突變呈正相關(Roche and Plexxikon' s PLX4032 shows 81 % response in metastatic melanoma patients in Ph I trial. The Pharma Letter. 2011. 8)。因此，檢測BRAF驅動基因突變，可以用來有效預測上述兩種靶向藥物化療的預后效果。EML4-ALK基因為棘皮動物微管結合蛋白4(EML4)與間變淋巴瘤激酶(ALK)形成的融合基因，研究發現EML4-ALK可誘導腫瘤生成，給予ALK抑制劑后腫瘤可迅速消退。在目前已報道的研究中EML4-ALK融合基因在非小細胞肺癌中的陽性率約為7%，EML4-ALK融合基因已成為肺癌臨床治療新靶點。臨床研究表明，新藥Crizotinib(克里唑蒂尼)對于 ALK融合基因有很好的治療效果(A Phase III Trial of Crizotinib Versus Standard Of Care In Patients With Advanced Non-Smal1 Cell Lung Cancer(NSCLC)With a Specific Alteration of the Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK) Gene. Pfizer Oncology. 2011 ；6)。 因而，對用EML4-ALK驅動性突變的檢測是實施Crizotinib化療預后必需的指標。目前，約有70%的肺癌患者仍接受化療，為了使肺癌患者能接受到最好的治療，提高生存率，延長患者生存期。實施以驅動性基因突變分型治療是腫瘤化療必然趨勢。對肺癌患者腫瘤藥物靶點及相關的驅動性基因突變的了解是實施肺癌突變特異性治療(Mutation Specific Therapy)和制定正確化療方案的前提和基礎。2011年《美國國立癌癥綜合網絡(NCCN)臨床實踐指南》已經明確把EGFR，KRAS, BRAF等驅動性突變的檢測應該在實施化療前成為常規化。因此，在實施化療之前對于肺癌主要的驅動性突變的檢測，對于提高了肺癌患者的生存率，延長患者生存期，避免過度治療有著主要的現實意義。驅動性突變基因屬體細胞稀有突變，具有稀少性、異質性、不穩定性等特點。因而， 驅動性突變基因分子檢測必須具備較高的靈敏度。研究發現，驅動性突變的量往往都低于直接測序等技術所能達到的檢測限，所以直接測序等技術無法滿足驅動性突變基因檢測的實際需求。因此，迫切需要開發一種高靈敏度與高特異性的驅動性突變基因檢測技術，以實現采用高靈敏度檢測方法對肺癌患者進行多重“驅動性基因突變”聯合的檢測，從而為制定肺癌患者的個體化用藥方案和耐藥處理方案提供科學參考依據。本發明提供了一種高靈敏度和高特異性的肺癌驅動性突變的檢測方法及試劑盒。 該方法可以實現肺癌的多重“驅動性基因突變”聯合檢測，大大縮短了檢測的時間，提高了肺癌驅動性突變檢測的靈敏度和準確率，從而實現了肺癌驅動性突變的早期檢測和化療靶向用藥的準確預后。

發明內容
本發明的目的在于提供一種用于肺癌驅動性基因突變檢測的引物和探針，包括 EGFR，KRAS, BRAF和EML4-ALK驅動性基因突變的檢測探針和引物，通過對驅動性突變的檢測實現肺癌驅動突變的早期診斷和化療預后，其特異引物與雙環探針包括如下序列表IEGFR驅動突變特異性引物和雙環探針核苷酸序列
權利要求
1.用于檢測肺癌驅動性基因突變的引物及探針，包括下列4組71條引物和探針 (I)EGFR驅動突變特異性引物和雙環探針核苷酸序列其序列為SEQ ID NO :1至SEQID NO 24 ；O) KRAS驅動突變特異性引物和雙環探針核苷酸序列SEQ IDNO :25至SEQ ID NO 44 ；(3)BRAF驅動突變特異性引物和雙環探針核苷酸序列SEQ ID NO :45至SEQ ID NO 47 ；以及(4)EML4-ALK驅動突變特異性引物和雙環探針核苷酸序列SEQ ID NO :48至SEQ ID NO :71。
2.如權利要求1所述的肺癌驅動性基因突變檢測試劑盒的檢測方法，包括以下步驟(1)提供權利要求1所述的4組71條引物和探針；(2)待測樣品的處理和模板的提取；(3)配制焚光PCR擴增反應體系；(4)用步驟(1)的引物和探針擴增待測驅動性基因突變靴序列(5)利用雙環探針與特異性引物的雜交，檢測反應體系的FAM和HEX或ROX焚光強度， 以HEX信號達到設定閾值(Ct > 18)是表明上樣DNA的量在允許范圍內，FAM信號結果可 信；以FAM達到設定的閾值時所需要的循環次數Ct值作為陰陽性判定標準，Ct值為O或 35 陰性；Ct值小于32 陽性。
3.如權利要求2所述的一種肺癌驅動性基因突變檢測試劑盒的檢測方法，其特征在 于步驟( 所述的待檢測樣品包括手術切除的新鮮病理組織，石賭包埋病理組織，石賭切 片，全血，血菜，血清和胸腔積液。
4.一種檢測肺癌驅動性基因突變的檢測試劑盒，包括權利要求1所述的4組67條引 物和探針。
5.如權利要求4所述的檢測肺癌驅動性基因突變的檢測試劑盒，包括EGFR、KRAS、BRAF 和EML4-ALK的焚光PCR的反應體系分別為EGFR驅動突變焚光PCR反應體系 IX PCR緩沖液模板3 6 ML各引物0. 1 l.Opmol各探針0.5 1.0 pmolTaq 酶2. O 3. O UdNTP0.5 L5mmolMgCLa5. O 7. O mmol總體積20 60 MLKRAS驅動突變焚光PCR反應體系 IX PCR緩沖液模板3-、6MLKRAS引物0.1 ,1. 0μπιο KRAS探針0.5 ,1. 0μπιο iTaq 酶0.5 ,3. 0UHGH引物0.1 ,1. 0μπιο HGH探針0.5 ,1. 0μπιο dNTP0.5 ,1. 5mmolMgCL25.0 ,9. 0mmol總體積20-60 mLBRAF驅動突變熒光PCR反應體系 IX PCR緩沖液模板3 6 pL各引物0. --1. 0 μπιο 各探針ο. δ--1. 0 μπιο iTaq 酶1. 5 3· 0 UdNTP0. 5 L 5 mmolMgCL25. 0 9. 0 mmol總體積20 EML4-ALK驅動突變熒光PCR反應體系Takara 10XPCR Buffer 稀釋為 IX模板3 7ML各引物1. Ο-"4. 0 pmol各探針Ι. 0、"3. 0 pmoliTaq 酶0. 5、-2. 0 UdNTP0.卜"1. 5 mmolMgCL21. 0、-2. 7 mmol甲酰胺1 2%總體積20 丨60 mL
6.-種用于檢測肺癌驅動性基因突變的引物及探針，其特征在于，其由SEQ ID NO ID NO :71的寡核苷酸引物和探針或與其有至少70%同一性的寡核苷酸引物序列-1 SEQ組成。
全文摘要
本發明公開了肺癌驅動性基因突變的檢測試劑盒，其包括用于檢測肺癌EGFR、KRAS、BRAF和EML4-ALK驅動性基因突變的引物、探針。本發明的方法包括(1)提供4組71條引物和探針；(2)檢測樣品DNA模板的提取；(3)配制檢測EGFR、KRAS、BRAF和EML4-ALK驅動突變的熒光PCR反應體系；(4)利用雙環探針與特異性引物的雜交，檢測反應體系的FAM和HEX或ROX熒光強度，根據FAM和HEX或ROX熒光強度判定結果。本發明的方法可以檢測肺癌EGFR、KRAS、BRAF和EML4-ALK基因的驅動性突變，該方法具有靈敏度高，特異性強，檢測速度快，檢測方便等特點。
文檔編號C12N15/11GK102443626SQ201110284778
公開日2012年5月9日 申請日期2011年9月22日 優先權日2011年9月22日
發明者張海龍, 施偉杰, 肖桃英, 鄭立謀, 阮力 申請人:廈門艾德生物醫藥科技有限公司