專利名稱：人非小細胞肺癌l858r+v834l基因突變原代腫瘤移植瘤模型的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫藥行業，尤指一種人非小細胞肺癌L858R+V834L基因突變原代腫瘤移植瘤模型在篩選治療非小細胞肺癌EGRF突變陽性患者的靶向藥物中的應用，并為探索表皮生長因子受體(EGFR)突變在非小細胞肺癌發生中的作用提供實驗技術平臺。
背景技術：
非小細胞肺癌患者EGFR酪氨酸激酶區域基因突變在我國肺癌患者中的發生率約 為30%左右，突變主要發生在外顯子19和21，各占突變總數的54. 5%和40. 3%。其中外顯子21第858位密碼子發生堿基替換(T — G)突變，使得EGFR蛋白中該位點的氨基酸由亮氨酸(L)轉變為精氨酸(R)，簡稱L858R突變，第834位密碼子發生堿基替換(G — T)突變，該位點的氨基酸由纈氨酸(V)轉變為亮氨酸(L)簡稱V834L突變。雖然目前國際上已有少數兩個EGFR L858R突變的細胞株，但目前還未見L858R+V834L雙基因突變細胞株。且目前認為雖然腫瘤細胞株實用、可重復、易于操作，但是這些模型的治療結果與病人的臨床結果的一致性欠佳，主要由于只有極少數的原發性腫瘤能形成細胞株，且他們的生長為單層不能反應人類腫瘤的微環境和在體內對治療產生相同的反應，而且這些在體外生長的腫瘤代表了一組臨床預后更差的病人，從而需要其他的更多臨床相關非小細胞肺癌NSCLC模型，并將它們應用在臨床實驗中。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對上述現有技術的不足，提供一種人非小細胞肺癌L858R+V834L基因突變原代腫瘤移植瘤模型的應用。為了解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案是一種人非小細胞肺癌L858R+V834L基因突變原代腫瘤移植瘤模型，表達L858R+V834L基因突變，且腫瘤能被吉非替尼抑制，該模型在篩選治療非小細胞肺癌EGRF突變陽性患者的靶向藥物中的應用，并為探索EGFR突變在非小細胞肺癌發生中的作用提供實驗技術平臺。人非小細胞肺癌L858R+V834L基因突變原代腫瘤移植瘤模型的建立實驗動驗為5組3-4周齡SCID小鼠，每組10只，雌性，體重10 12g，購于中國醫學科學院實驗動物研究所，在SPF級條件下飼養。從手術室無菌取病人原代肺腫瘤組織轉移至含15 mL Hank’s液的無菌離心管中，4°C運至實驗室。在實驗室超凈工作臺中用O. OlM PBS緩沖液清洗3次，去除正常組織及壞死腫瘤組織，將瘤體剪成I. O I. 5mm3大小的瘤塊，24h內用套管針接種于第一組免疫缺陷小鼠背部皮下，每只小鼠接種ABCD四個點，見圖1，每點各接種I. O I. 5_3瘤塊兩塊，在小鼠背部中間兩側左右各剪一小口，用套管針將腫瘤組織送至AB⑶四個點。當免疫缺陷鼠某一點的皮下移植瘤直徑大于I I. 5cm時，用戊巴比妥鈉過量麻醉處死小鼠，剝離腫瘤，將瘤體剪成I. O I. 5mm3大小的瘤塊，再次用套管針接種于第二組免疫缺陷小鼠背部皮下，每只小鼠接種AB兩個點，各接種I. O I. 5mm3瘤塊兩塊，如此接種至第四代。每一代均留標本做HE染色、免疫組化、免疫印跡、DNA測序。結果分別如圖2、圖3、圖4和圖5所示，從圖2HE染色可以看出P1、P2、P3、P4各代均保持PO患者腫瘤的病理特性。圖3為L858R突變單克隆抗體免疫組化染色，AEC染色，陽性為紅色，從圖中可以看出PO、P1、P2、P3、P4各代均表達EGFR L858R突變蛋白。圖4為L858R突變單克隆抗體免疫印跡，M為蛋白質分子量標準，β-actin是內參蛋白，從圖中可以看出P0、P1、P2、P3、P4各代均表達EGFR L858R突變蛋白，圖5為L858R+V834L突變測序，圖中左邊箭頭為V834L突變，右邊 箭頭為L858R突變，從圖中可以看出P0、P1、P2、P3、P4各代均有L858R+V834L突變。如此，通過取病人的小片腫瘤直接移植至免疫缺陷鼠體內建立該原代腫瘤移植瘤模型，該模型均保持非小細胞肺癌、腺癌、EGFR高表達、L858R及V834L雙突變的特征，能產生比細胞株和鼠類異體移植更好的代表原始腫瘤異質性的模型，該模型移植瘤能被吉非替尼(Iressa)抑制，可用于篩選治療非小細胞肺癌EGRF突變陽性患者的靶向藥物，為探索EGFR突變在非小細胞肺癌發生中的作用提供實驗技術平臺。


圖I是肺腫瘤組織接種示意圖。圖2是各代移植瘤HE染色圖。圖3是各代L858R單克隆抗體免疫組化圖。圖4是各代L858R免疫印跡圖。圖5是各代L858R+V834L基因突變測序圖。其中圖2-圖5各圖中P0代表患者腫瘤(其所代表的圖為PO代圖，以此類推)，Pl代表第一代移植瘤，P2代表第二代移植瘤，P3代表第三代移植瘤，P4代表第四代移植瘤。圖6是移植瘤Iressa藥物試驗圖，圖中HKI為吉非替尼溶劑對照組，Irresa為吉非替尼藥物組。
具體實施例方式實驗動驗為3 4周齡SCID小鼠共12只，雌性，體重10 12g，購于中國醫學科學院實驗動物研究所，在SPF級條件下飼養。取P3代的新鮮移植瘤，將瘤體剪成I. O I. 5mm3大小的瘤塊，用套管針接種于免疫缺陷小鼠背部皮下，每只小鼠接種一個點(ABCD四點中的B點)，每個點接種I. O
I.5mm3瘤塊一塊，當瘤體直徑達到3mm時，把動物分成2組，一組喂吉非替尼，另一組為對照組，喂吉非替尼的溶劑HKI，每周測量瘤體長徑、短徑兩次，喂藥兩周，兩周后處死動物，取瘤體稱重，瘤體數據按V = O. 5a2b (V為體積，a為短徑，b為長徑)作圖，見圖6。結果表明該移植瘤能很好的被吉非替尼抑制，能作為篩選治療非小細胞肺癌EGFR突變陽性患者的靶向藥物的模型。
權利要求
1.一種人非小細胞肺癌原代腫瘤移植瘤模型，表達L858R+V834L基因突變，且腫瘤能被吉非替尼抑制。
2.如權利要求I所述的人非小細胞肺癌L858R+V834L基因突變原代腫瘤移植瘤模型在篩選治療非小細胞肺癌EGRF突變陽性患者的靶向藥物中的應用。
3.如權利要求I所述的人非小細胞肺癌L858R+V834L基因突變原代腫瘤移植瘤模型為EGFR突變在非小細胞肺癌發生中的作用提供實驗技術平臺。
全文摘要
一種人非小細胞肺癌L858R+V834L基因突變原代腫瘤移植瘤模型產生的移植瘤能被吉非替尼(Iressa)抑制，本發明的L858R+V834L基因突變原代腫瘤移植瘤模型可用于篩選治療非小細胞肺癌EGRF突變陽性患者的靶向藥物，并為深入探索表皮生長因子受體(EGFR)突變在非小細胞肺癌發生中的作用提供實驗技術平臺。
文檔編號C12Q1/02GK102660507SQ20121013449
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月3日 優先權日2012年5月3日
發明者周新民, 李建明, 胡野榮 申請人:中南大學湘雅二醫院