專利名稱：一個長鏈非編碼rna基因的應用方法
技術領域：
本發明屬于腫瘤分子生物學領域，具體涉及一個新克隆的長鏈非編碼RNA基因序列的應用方法。
背景技術：
原發性肝癌是亞洲與部分非洲地區的高發腫瘤，其病死率居我國惡性腫瘤的第二位，五年生存率只有5%左右，肝癌的防治及其發病機制研究一直是我國醫學科學研究中的重要課題。肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是原發性肝癌的一種主要類型,盡管目前在肝細胞癌的診斷和治療方面有了新的進展，但是對于其發生發展及轉移的確切機制仍然存在大量未知的問題。長鏈非編碼RNA (longnon-coding RNA, IncRNA)是一類轉錄本長度超過200個核苷酸的非編碼RNA，研究發現很多IncRNA在腫瘤的發生發展中有重要調節作用，它具有抑制腫瘤生長和促進腫瘤轉移等生物學作用。IncRNA根據其基因位置可分為五種類型:正義 IncRNA(sense IncRNA)、反義 IncRNA(antisense IncRNA)、雙向 IncRNA(bidirectionalIncRNA)、基因內 IncRNA(intronic IncRNA)及基因間 IncRNA(intergenic IncRNA) 之前一直被認為是轉錄“噪音”的IncRNA，因在基因調節中的重要功能，目前已成為繼miRNA之后非編碼RNA領域又一研究熱點。近年的研究已表明，IncRNA參與X染色體沉默、基因組印記以及染色質修飾、轉錄激活、轉錄干擾、核內運輸等多種重要的調控過程。IncRNA有望成為腫瘤診斷、治療和預后新的標志物，同時也為腫瘤的治療提供了新的靶點。新一代測序(Next Generation Sequencing, NGS)技術的迅猛發展將基因組水平的研究帶入了一個新的階段，許多基于全基因組的研究成為可能，RNA測序(RNA-Sequencing, RNA-Seq)就是利用新一代測序技術對生物樣品轉錄的全部RNA進行高通量測序，以獲得被測樣品 轉錄組(transcriptome)數據的一種重要新技術。最近我們利用新一代測序技術對肝細胞癌患者活檢標本及正常對照肝組織樣品進行RNA-Seq，在肝癌樣品中檢測到染色體llql3.1區域存在相鄰的幾個明顯RNA-Seq信號峰，而在正常對照組織中卻沒有，且該染色體區域目前尚無已知基因登錄，提示可能存在一個或多個未知的新基因。我們以此為線索，證實這幾個RNA-Seq峰來自同一個新基因，并克隆了該基因全長序列。該基因全長序列為3526bp，可轉錄成多個轉錄本，將該基因全長的序列輸入ORF finder軟件進行開放閱讀框預測，未發現明顯的開放閱讀框，說明該基因編碼一個長鏈非編碼 RNA (long non-coding RNA, IncRNA)。我們從肝癌及正常對照組織中抽提RNA后通過逆轉錄，實時定量PCR，檢測了該IncRNA的表達情況，結果顯示該IncRNA在肝癌組織中表達上調(P〈0.001)。我們隨后又利用原位雜交的方法，進一步在大樣本中驗證了該IncRNA在肝癌中表達顯著上調(P〈0.001)。因此針對該IncRNA的檢測制劑可用于肝癌的輔助診斷。生存曲線分析發現該IncRNA表達高的患者其生存時間短于該IncRNA表達低的患者(P=0.024)。因此針對該IncRNA的檢測制劑也可以用于肝癌的預后判斷。
我們還針對該IncRNA基因的序列設計了用于RNA干擾的短發夾RNA表達載體，利用該載體在肝癌細胞系中抑制了該IncRNA的表達，且發現抑制該IncRNA表達可抑制肝癌細胞系的生長。因此針對該IncRNA的抑制制劑也具有肝癌基因治療的潛在用途。

發明內容
本發明的目的是提供一個新克隆肝癌相關IncRNA基因的應用方法，根據該基因序列，設計并合成實時定量PCR引物和原位雜交探針，制備用于肝癌輔助診斷或者療效預測的制劑。一個長鏈非編碼RNA基因的應用方法，根據該基因制備用于肝癌輔助診斷或者療效預測的制劑；該基因轉錄本序列為序列表中SEQ ID NO:1-12所示的核苷酸序列中的任一條；或者是與序列表中SEQ ID NO:1-12任一條所不的序列具有90%以上同源性的核苷酸序列；或者是與序列表中SEQ ID NO:1-12任一條所示的序列經硫代修飾或/和甲氧基修飾得到的核苷酸序列。用于肝癌輔助 診斷或者療效預測的制劑包括原位雜交檢測試劑和實時定量PCR檢測試劑。根據該基因設計并合成用于原位雜交的寡核苷酸探針。用于原位雜交的寡核苷酸探針序列包括:5’-CATTGTTTTAATGCTTCCAGATGAGTTTGTATC-3’5’-CTTTGGAAATAGTGCAGACACAAAACTAGGG-3，5’-GTGTGTTTTGCAGTCTCCTTGTTTGTTTCTTC-3’ 。根據該基因設計并合成出用于實時定量PCR的檢測引物。用于實時定量PCR檢測的上、下游引物分別為:5，-GTCCGTCAGTCCCTCACCT-3，和 5，-ATACAGCCCCAGACCCAAAC-3，。本發明首次發現了一個新克隆的肝癌相關長鏈非編碼RNA基因序列，并通過原位雜交、熒光實時定量PCR等方法證明該基因在肝癌組織中的特異性表達，為肝癌的輔助診斷和預后預測提供了強有力的分子生物學工具。


圖1為肝細胞癌和正常對照樣品RNA-Seq結果及其在染色體上的位置圖，表明通過RNA-seq我們發現了一個新基因；其中A =RNA-Seq發現的信號峰位于染色體llql3.1區段；B =RNA-Seq信號峰與鄰近基因的位置關系；C:肝細胞癌(HCC)和正常對照(Normal)樣品中RNA-Seq結果的對比，及克隆擴增該新基因全長序列所用引物設計示意圖；圖2為RT-PCR證實染色體llql3.1區段的RNA-Seq峰轉錄自同一個基因且剪接成多個轉錄本；A:以肝癌組織cDNA為模板用引物IF和2R及IF和3R進行RT-PCR擴增，PCR產物的電泳結果；B:引物IF和2R及IF和3R擴增的PCR產物經TA_clone、測序后發現的不同轉錄本剪接方式；C:引物3F和4R及4F和5R進行RT-PCR擴增的結果；D:引物3F和4R及4F和5R擴增的PCR產物經TA-clone、測序發現的不同轉錄本剪接方式；
圖3為GeneRacer克隆新基因5’和3’全長序列；A =GeneRacer實驗策略草圖；B:3’ GeneRacer PCR產物電泳結果；C:5’和3’ GeneRacer測序結果得到的該基因5’端和3’端不同的剪接形式；圖4為新克隆的基因及12種不同轉錄本，開放閱讀框預測結果顯示為長鏈非編碼RNA ；A:通過測序獲得的新克隆基因12種代表性轉錄本剪接形式；B:0RF Finder預測該新基因，未發現明顯的開放閱讀框，表明該基因編碼長鏈非編碼RNA ；圖5為實時定量PCR檢測該IncRNA在10例正常肝組織和36例肝癌組織中表達的結果；其中:N代表正常組織，T代表肝癌組織；圖6為原位雜交檢測新克隆IncRNA在正常肝組織(左)及肝癌組織中的表達(右)；表明該IncRNA在正常肝組織中不表達，而在肝癌組織中高表達；圖7為新克隆的IncRNA生存曲線分析結果；根據新克隆IncRNA的表達水平將51例肝癌患者分組，IncRNA高表達患者組(28例患者，細虛線)生存時間短于I n c RNA低表達患者(2 3例患者，粗實線)，表明新克隆的IncRNA可用于肝癌患者預后判斷；圖8為針對該新克隆的IncRNA設計`并構建shRNA表達載體，干擾肝癌細胞系HepG2中該IncRNA的表達；表明設計的4個shRNA載體均可干擾H印G2細胞內該IncRNA的表達，四個shRNA載體混合轉染細胞，效果更佳；圖9為shRNAs干擾肝癌細胞H印G2中新克隆IncRNA的表達后細胞的生長曲線，表明干擾細胞內新克隆IncRNA的表達可以抑制!fepG2細胞的生長。
具體實施例方式以下結合具體實施方式
進一步說明本發明，而非限制本發明。一、新的IncRNA基因克隆與分析1.材料與方法:1.1試劑及試劑盒瓊脂糖(agrose)等常用生化試劑、膠回收試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司，lkbladder DNA 分子量 Marker 購自 Invitrogen 公司 j[^RNeasy Mini Kit (Qiagen)抽提試劑盒抽提高質量的RNA, SuperScript III (Invitrogen)試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA。1.2新一代測序技術進行RNA測序人肝癌組織樣品和正常肝組織樣品提取總RNA后，過柱純化，保留200nt以上的RNA ；然后富集mRNA，并用二價陽離子高溫加熱的方法將mRNA片斷化；以mRNA短片段為模板；用六堿基隨機引物反轉錄合成雙鏈cDNA，經純化、末端修復、加堿基A、加測序接頭的步驟，經瓊脂糖凝膠電泳回收片段，并進行PCR擴增完成測序文庫的制備；構建好的文庫經cBot擴增，用i I lumina soIexa進行測序；
對illumina solexa進行RNA測序的結果進行分析:包括去除低質量、污染、接頭的序列，將RNA測序結果與人類基因組參考序列進行比對和映射，在肝癌樣品中檢測到染色體llql3.1區域存在相鄰的幾個明顯RNA-Seq信號峰，而在正常對照組織中卻沒有，且該染色體區域目前尚無已知基因登錄，提示可能存在一個或多個未知的新基因。1.3克隆新基因序列為了驗證在11號染色體所檢測到的各個RNA-Seq峰是否來自同一個RNA序列，我們針對各個RNA-Seq峰分別設計了正向(Forward, F)引物和反向(Revise, R)引物,利用相鄰峰對應引物組合進行PCR擴增.各引物所在的大致位置和方向見圖1C，對應的序列如下: IF: 5 ’ -CCCTTGTTTAGCCTCTGCTG-3’，2F: 5 ’ -CCTCTGTCACTGCCACAAAA-3，，2R: 5 ’ -CATGTGGTGAGTGGCTGTG-3’，3F: 5 ’ -TCACTTACCCCTGCGACTCT-3，，3R: 5 ’ -CATCACAGGGTGTGTTTTGC-3’，4F: 5 ’ -GCCCTGCTCTATCAGCAAAC-3，，4R: 5 ’ -GCCTGCTGAGTTTGCTGATA-3’，5R: 5 ’ -CCCAAACCAAGCTGACAAAT-3，。依次對應序列表中SEQ ID NO: 13-20。利用GeneRacer試劑盒(Invitrogen)擴增未知RNA的5’端及3’端全長序列,針對本項目RNA序列用于GeneRacer反應的基因特異性引物(Gene Specific Primer, GSP)大致位置和方向見圖1C，序列如下:Racer Rl:5’ -GCAGAGGCTAAACAAGGGGGTCCTG-3，，序列表中 SEQ ID NO:21 ；Racer F5:5’ -CACTGAATGCCCCACGTCAAAGAAA-3，；序列表中 SEQ ID NO:22 ；RT-PCR 或者 GeneRacer PCR 的產物均用 TA clone 試劑盒(Invitrogen)進行連接、轉化，挑選陽性克隆用Sanger法測序，以獲得插入片段的序列。1.4序列分析及生物信息學預測所用軟件 新一代測序技術進行RNA-Seq發現的新基因，我們用傳統的Sanger法測序進行了驗證，并用Sanger法測序克隆了該基因的全長序列，Sanger法測序所獲得的序列用DNAStar軟件(DNASTAR Inc.)進行組裝和校對；新克隆基因潛在開放閱讀框(Open Reading Frame, 0RF)米用美國國立生物信息研究所(National Center forBiotechnology Information,NCBI)開發的在線分析軟件ORF Finder (www.ncb1.nlm.nih.gov/gorgorf.html)進行預測；潛在開放閱讀框編碼的多肽序列輸入Pfam(http://pfam.sanger.ac.uk/)數據庫與已知蛋白結構域是否有同源性。2 結果2.1RNA-Seq在染色體llql3.1區域發現多個相鄰的RNA信號峰
通過新一代測序技術對肝細胞癌活檢組織及正常對照樣品中的RNA進行高通量測序(RNA-Seq)，并以人類基因組參考序列(Build37.3，Hgl9)為模版對RNA-Seq序列進行組裝，我們發現肝癌組織中在染色體llql3.1區域(圖1A)距11號染色體短臂末端物理距離65.6Mb附近(圖1B)存在6個相鄰的較明顯的RNA信號峰(圖1C)，除第5個峰只有50個左右測序讀長(reads)支持外,其余每個峰都有超過100個reads支持,最高達到近400個reads支持(圖1C下半部分)，而同一染色體區域正常對照樣品中則沒有或僅有痕量的reads (圖1C上半部分)，表明在所檢測的肝癌組織中這一染色體區段轉錄出了一條或多條RNA序列，且轉錄水平較高；這些RNA信號峰所在的染色體部位沒有已知基因登錄(圖1B)。
為了驗證這幾個RNA-Seq峰到底是來自幾個獨立的RNA序列還是來自同一條RNA序列，我們針對各個RNA-Seq峰分別設計了正向和反向引物(圖1C)，然后以肝癌組織cDNA為模板，用相鄰峰對應的引物配對進行PCR擴增。2.2RT-PCR證實llql3.1區域多個RNA-Seq峰轉錄自同一個基因以肝癌組織cDNA為模版，用引物IF和2R進行PCR擴增，PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳發現擴增出多條目的帶，引物IF和3R也同樣得到了多條帶(圖2A).將目的條帶分別割膠純化、TA克隆，挑選陽性克隆進行測序，發現引物IF和2R獲得的PCR產物覆蓋了第1、2和3個RNA-Seq峰，且存在至少2種轉錄后剪接形式，同樣的，引物IF和3R擴增的PCR產物覆蓋了第廣4個RNA-Seq峰，存在至少3種轉錄后剪接形式(圖2B).
用引物3F和4R、4F和5R等組合PCR擴增也得到了類似的結果(圖2C和圖2D)，證實染色體llql3.1區段測得的這幾個相鄰的RNA-Seq峰實際上轉錄自同一個基因，它們對應的DNA片段為同一個基因的不同外顯子，且由PCR和測序結果可知該基因轉錄的RNA存在多種剪接方式.利用引物IF和5R我們擴增了該基因更多種類型的轉錄本。 由于PCR擴增得到的是DNA雙鏈，僅從測序結果我們還無法判斷該RNA的實際方向，也還沒得到該RNA5’和3’端全長序列，因此我們進一步利用GeneRacer試劑盒擴增該RNA的5’和3’端全長。2.3GeneRacer 克隆 RNA 全長序列GeneRacer所用引物GeneRacer試劑盒(Invitrogen)提供見圖3A,首先用煙草酸性焦磷酸酶(Tobacco Acid Pyrophosphatase,TAP)去除RNA5’端帽子(cap)結構，然后在去除帽子結構的RNA5’端用RNA連接酶(RNA Iigase)連接一段特異性RNA接頭序列(該接頭序列由GeneRacer試劑盒(Invitrogen)提供圖3A中左端黑色粗線條部分)，接下來用5’端增加了另一段特異性接頭的oligo-dT為引物該接頭序列由GeneRacer試劑盒(Invitrogen)提供,對RNA進行逆轉錄,獲得cDNA的第一條鏈,此時cDNA就在兩頭都分別加上了兩段特異性的接頭序列。針對這兩端的接頭序列，GeneRacer試劑盒(Invitrogen)分別提供了 5’和3’端的GeneRacer公共引物，再在我們感興趣的目的基因序列中設計基因特異性引物(gene specificprimer, GSP,即前述的Racer Rl和Racer F5)與公共的5’或3’ GeneRacer引物組合進行PCR擴增就可以得到我們感興趣的基因5’和3’端全長序列。 將肝癌組織RNA用GeneRacer試劑盒逆轉錄的cDNA(兩頭已加接頭)為模板，利用圖1C中設計的2條基因特異性GeneRacer引物Racer Rl和Racer F5與試劑盒中的GeneRacer3’公共引物進行PCR擴增(圖3B)，結果Racer Rl與GeneRacer3’公共引物未能擴出目的條帶，而Racer F5與GeneRacer3’引物則擴出了非常清楚的目的條帶,表明RacerF5靠近目的基因的3’末端，其對應的圖1C中第6個RNA-Seq峰就是該新基因的第6號外顯子.利用GeneRacer試劑盒中提供的Hela細胞cDNA為模板，Racer F5與GeneRacer3’引物也未擴出特異性條帶，表明該基因在Hela細胞中不表達或者表達很弱。圖3B中RacerF5與GeneRacerf’公共引物擴增產物電泳結果除了有一條很強的目的條帶外，在該條帶上方還有兩條較弱的條帶(圖中箭頭所示)，表明該基因3’末端可能同樣存在可變剪接。將PCR產物TA clone，Sanger法測序，我們獲得了該新基因3’端三種不同轉錄本的序列(圖3C右邊部分).我們接下來用Racer Rl與GeneRacerf’公共引物進行擴增，獲得了該新基因5’端6種不同轉錄本的序列(圖3C左邊部分).
2.4新克隆的基因有多個轉錄本且沒有明顯的開放閱讀框我們在其他肝癌組織樣本中進一步大量PCR，TA克隆和測序分析，得到了該基因更多的轉錄本序列，圖4A是在肝癌組織中表達頻率比較高的12種轉錄本剪接模式。將該基因不同的轉錄本序列輸入NCBI的ORF finder軟件進行開放閱讀框預測，發現該基因沒有明顯的開放閱讀框(所有潛在的開放閱讀框均小于500bp)。將所有潛在ORF編碼翻譯為多肽序列與Pfam數據庫中已知的蛋白或者結構域進行比對，也未發現有同源性，表明該基因可能編碼一個長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA, IncRNA)。二、熒光實時定量PCR1.材料與方法:10例正常肝臟組織和36例肝癌組織抽提總RNA，2 μ g RNA經逆轉錄成cDNA后，進行熒光實時定量PCR。新克隆IncRNA引物為5’ -GTCCGTCAGTCCCTCACCT-3’(序列表中SEQID NO:23)和 5’ -ATACAGCCCCAGACCCAAAC-3’(序列表中 SEQ ID NO:24)。用于對照的18S 引物為 5’ -TCTTAGCTGAGTGTCCCGCG-3’(序列表中 SEQ ID NO:25)和 5’ -ATCATGGCCTCAGTTCCGAA-3’(序列表中 SEQ ID NO:26),熒光實時定量PCR反應體系
SYBR Premix Ex Taqrw (2χ)10μ1 PCRForwardPrimer (10pn)0.4μ1
PCR Reverse Primer (IOpm)0.4μ]
cDNA 投板2.0μ
M2O7.2μ1
Total20μ1熒光實時定量PCR反應步驟1 94 0C5min2 95 °CIOsec3 58 °C30sec4 72 °C20sec5 Plate read6 82 °C30sec7 Plate read8 Go to step2for more39times9 Perform melting curve from55.0 °C to95.0 °C , read every0.2 °C , holdforlsec反應結束后確認熒光實時定量PCR的擴增曲線和熔解曲線，各基因的表達強度根據CT值(threshold cycle values)、內參基因(18S)標化后,采用group t_test檢驗計算P值。2.結果
新克隆的IncRNA在正常對照組織中不表達或者表達很低，而在肝癌組織中高表達 P〈0.001 (圖 5)三、原位雜交1.材料方法I)寡核苷酸探針的設計利用DNA Club軟件將新克隆的IncRNA序列轉換為其互補序列。利用Primer3軟件(http://frod0.w1.mit.edu/cg1-bin/primer3/primer3.cgi/)的探針設計功能，以每一個基因的互補序列為模板，在其閱讀框架內設計寡核苷酸探針，探針參數設定基本一致，GC含量為40-60%，Tm為65-70°C。根椐基因序列長度，以200或300個堿基的間隔，在同一條件下設計5-6條30個堿基長度的寡核苷酸探針。使用美國國立生物信息學研究中心(NCBI)的在線 BLAST 軟件(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi)對所設計探針進行精確匹配，篩選出雜交參數最佳特異性的3條寡核苷酸探針。2)用于肝癌和對照正常組織原位雜交的寡核苷酸探針新克隆的IncRNA及用作對照的看家基因GAPDH對應的寡核苷酸探針長度為30個喊基，募核昔酸探針5’端為憐酸基團，3’端為輕基，探針序列均為這些基因cDNA的互補序列?；蚬押塑账崽结樀脑敿毿蛄腥缦?。寡核苷酸探針采用化學合成方法合成。新克隆的IncRNA探針:5’-CATTGTTTTAATGCTTCCAGATGAGTTTGTATC-3’(序列表中 SEQ ID NO:27)5’-CTTTGG AAATAGTGCAGACACAAAACTAGGG-3’(序列表中 SEQ ID NO:28)5’-GTGTGTTTTGCAGTCTCCTTGTTTGTTTCTTC-3’(序列表中 SEQ ID NO:29)看家基因GAPDH所對應的探針:5’-CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3’(序列表中 SEQ ID NO:30)5’-CAGTAGAGGCAGGGATGATGTTCTGGAGAG-3’(序列表中 SEQ ID NO:31)5’-GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3’(序列表中 SEQ ID NO:32)3)寡核苷酸探針標記試劑盒和原位雜交檢測試劑Dig Oligonucleitide Tailing Kit (2nd Generation)試劑盒(Roche 公司)，抗地高辛-辣根過氧化物酶復合物檢測試劑盒(Ant1-Digoxigenin_POD,Fab fragments, Roche公司)。增強原位表達檢測信號的TSA信號放大系統(TSA Biotin System, NEL700試劑盒,PerkinElmer公司)。DAB染色試劑盒(北京中山公司)。20 X SSC,硫酸葡聚糖(Dextransulphate),去離子甲酸胺(Deionized Formamide),多聚腺苷酸(polyadenylic acid,PolyA),多聚脫氧腺苷酸(polydeoxyadenylic acid,Poly dA),變性剪切的娃精 DNA (denaturedand sheared salmon sperm DNA, ssDNA),酵母轉運 RNA (yeast t-RNA, tRNA), DTT,50XDenhardts’ s solution, PBS buffer,胃蛋白酶K, BSA(牛血清清蛋白)，三乙醇胺(TEA), TNB Buffer(0.1M Tris-HCl，ρΗ7.5，0.15M NaCL，0.5%Blocking Reagent)，TNTBuffer (0.1M Tris-HCl, pH7.5,0.15M NaCL,0.05%Tween20)醋酸酐，阻斷試劑(Blockingreagent agent, Roche 公司)。4)其他主要試劑和材料無水乙醇、90 %酒精、70 %酒精、50 %酒精、松節油、雙蒸水、PBS緩沖液(pH7.2
7.4，NaC1137mmol/L, KC12.7mmol/L, Na2HP044.3mmol/L, KH2PO4L 4mmol/L) ；3% 甲醇-雙氧水溶液(80%甲醇和30%雙氧水配置)；0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液(citrate buffer, CB,pH6.0±0.1,9ml0.1M檸檬酸溶液和41ml0.1M檸檬酸鈉溶液加入450ml蒸餾水中臨時配置后再校正工作液PH值)；0.1%胰蛋白酶；蘇木素；I %鹽酸酒精(Iml濃鹽酸+99ml70%酒精配置)；組織微陣列專用封片膠(PTS Cure Mount II );專用蓋玻片(480 X 240mm2)定制于鄭州玻璃儀器廠。Leica低熔點(58°C)石蠟，國產蜂蠟，無水酒精，二甲苯，10%中性多聚甲醛(0.01mol/L, pH7.4，DEPC雙蒸水和PBS緩沖液配制)，蘇木素，伊紅，中性封片樹膠，蓋玻片，載玻片。5)寡核苷酸探針的標記利用3-tailing DIG Olignucleutide Kit進行寡核苷酸探針標記，反應體系如下。IOOpmol oligonucleotide + ddH20 = 9 μ I (control: controloligonucleutide5 μ l+ddH20 4 μ I)
Reaction buffer (vial I)4μΙ
Coc!2 (vial 2)4μ1
Dig-dUTP(vial 3)Ιμ
dATP( vial 4)ΙμΙ
Terminal transferaseΙμ 混勻，稍離心。37°C水浴反應30min，加2ul EDTA(0.2M，ρΗ8.0)中止反應。6)寡核苷酸探針標記后純化為了增加標記探針的純度，需對已標記的探針進行純化，具體操作如下:a)探針反應混合物(22 μ 1)+2.5 μ 14Μ LiCL+75 μ 1100% 冷乙醇(_20°C ).
b)-7(TC 沉淀 60min，or-20°C 2h。c) 13.000Xg4°C離心 15min。d)棄上清，用50 μ I冰冷的70%(V/V)乙醇洗滌。e) 13.0OOxgfC,離心 5min。f)棄上清，真空4°C干燥。g)用無菌雙蒸水重溶探針。7)組織切片雜交前處理a) 4°C保存的組織切片置于58°C烤片30min，熔化表面石蠟。b) 二甲苯依次脫臘3X5min。c)梯級酒精洗滌，100%酒精2X2min — 95%酒精lX5min — 70%酒精I X 5min— 50%酒精lX5min — DEPC 水洗滌 2X3min — DEPC-PBS 洗滌 2X5min。d)滴加300 μ I胃蛋白酶Κ(10μ g/ml)于切片上，37°C消化20min。e)切片入PBS (0.1M PBS+2mg/ml谷氨酸)洗滌lmin，中止反應。f)切片入0.2N HCL,于37°C反應20_30min，增加組織的通透性。g)切片用4%多聚甲醛(0.1M PBS溶解)后固定lOmin，室溫。
h)為了增加組織陽性雜交強度，對切片進行乙酰化處理。切片入0.25%乙酸酐Buffer I(0.1M 三乙醇胺)，室溫 IOmin。i)lM PBS 洗滌 2X5min。8)組織預雜交和雜交a)預雜交:_20°C保存的預雜交液，先置于37°C孵育60min，預雜交液的用量為每平方厘米切片面積12.5 μ 1，相應大小的石蠟膜覆蓋切片，37°C濕盒中預雜交2小時。(預雜交液成份包括:2XSSC, 10%Dextran sulphate, IX Denhardt’s solution, 50mM PhosphateBuffer(PH7.0),50mM DTT,250 μ 1,100 μ g/ml poly A,5 μ g/ml poly dA,250 μ g/ml yeastt-RNA,500 μ g/ml ssDNA,47%Deionized formamide)。b)移去石蠟膜，甩掉預雜交液，切片置于2X SSC中5min。c)雜交反應:37°C雜交過夜(18_20h)。每一切片加入250 μ I雜交液并用石蠟膜覆蓋。預雜交液中加入相應的探針就成為雜交液。雜交液在預雜交時配制，放置37°C孵育，使探針充分溶解于雜交液中，本實驗用多條寡核苷酸探針混合，按每一探針500ng/ml濃度配制成探針雜交液。地高辛加尾標記試劑盒標記探針濃度計算依據:每一探針的濃度按其與陽性定量探針時檢測反應時顯色進行比對和100pmol30個堿基的裸探針標記反應理論探針產量為900ng兩種標準進行綜合計算出標記探針的濃度。d)雜交后洗滌，切片浸入2XSSC，10min，揭去石蠟膜。依次于搖床上搖動洗滌，2X SSC(0.5%SDS)，2X15min — 0.25X SSC(0.5%SDS)，2X 15min。9)雜交后顯色檢測反應a)采用Ant1-Digoxigenin-POD檢測地高辛探針與目的RNA結合復合物；TSA放大系統增強原位雜交反應顯色反應的陽性信號，DAB顯色。b)切片轉至TNT緩沖液中，3X5min。c)滴加 TNB 阻斷緩沖液，300 μ 1/TMAs，室溫，30min。d)不洗，吸去多余阻斷劑，1:100 稀釋的 Ant1-Digoxigenin-POD (TBS+0.l%TritonX-100+1%阻斷劑)，室溫4小時。e)TNT Buffer (0.1M Tris-HCl, PH7.5，0.15M NaCL, 0.05%Tween20)洗 3X5min。f)切片上滴加信號放大試劑Biotinyl Tyamid, 300 μ 1/TMAs, (Biotinyl Tyramid忙存液:Biotinyl Tyramid 溶解于 0.2ml DMS0, Biotinyl Tyramid 工作液:I X 稀釋液，1:50稀釋Biotinyl Tyramid忙存液)，室溫10分鐘。8)丁町洗，3父511^11。h)切片滴加SA-HRP (鏈霉卵白素-辣根過氧化物酶)，300 μ 1/TMAs,室溫30min。丨)丁町洗，3父511^11。j)蒸溜水洗滌，I X lmin。k)DAB顯色，顯微鏡下控制顯色反應。I)蘇木素復染，m)酒精梯級脫水，切片干燥。η)滴加組織切片專用封片膠，相應規格的蓋玻片蓋片，切片膠帶轉移系統配備的紫外燈下交聯切片lmin。10)結果判斷及標準
應用Nikon E600雙目光學顯微鏡分別在低倍和高倍鏡下進行觀察，首先觀察目標RNA的陽性表達信號在觀察目標細胞內的定位:位于細胞核、細胞漿或細胞膜。再分別以該檢測RNA表達部位陽性信號的強度和陽性表達的細胞數兩種標準進行綜合評分，判斷標準為:(1)依據陽性細胞染色強度判斷:a.細胞無染色，記O分；b.細胞染成淺棕色為弱陽性，記I分；c.細胞染成棕色且無背景著色，或細胞染成深棕色并有淺棕色背景為中等陽性，記2分；d.細胞染成深棕色且無背景著色為強陽性，記3分。(2)依據陽性細胞表達數計分:a.無陽性細胞表達，記O分；b.陽性表達細胞數< 25%，記I分；c.25%<陽性細胞數< 50%，記2分；d.陽性表達細胞數彡50%,記3分(由于每一組織點直徑僅為
0.9_，統計陽性細胞數時于IOX低倍鏡下記數每個組織點的全部目標細胞)。為了盡量降低評分結果的主觀因素，由兩位病理學專家在不知道各個組織點性質的情況下，分別按上述標準之一各自進行判斷和評分，再將兩者評分相乘，結果為:①O分者最終計為O分，認為陰性表達 級I分和2分者最終計為I分，認為弱陽性表達3分和4分者最終計為2分，認為中等陽性表達；@6分和9分者最終計為3分，認為強陽性表達。11)分析和統計軟件應用SPSS13.0統計軟件對實驗結果進行統計學分析，兩兩比較用x 2test或Fisher exact test,相關性分析米用Spearmen correlation方法；P < 0.05即差異有統計學意義。生存曲線分析采用Kaplan-Meier method及log-rank test ;多變量分析采用Cox’ s proportional hazards model ；P < 0.05 即差異有統計學意義。2 結果I)新克隆的IncRNA在肝癌及正常對照組織中的表達新克隆的IncRNA在 51例肝癌中均有表達，其表達在細胞漿和胞核均有(圖6右)，而在92% (50例正常組織樣本中的46例)的正常肝組織中呈陰性表達，其余8%為弱表達(圖6左)，兩者之間具有明顯的統計學差異(P〈0.001)。2) Kaplan-Meier 生存分析我們對所有51例肝癌患者進行了電話隨訪，詳細詢問了他們的首發時間、治療情況、有無復發、有無再患其他疾病、復發及死亡時間等，并登記了生存時間和狀態，并對肝癌組織中新克隆IncRNA的表達與病人的生存時間和狀態進行的生存分析，發現新克隆的IncRNA高表達患者平均生存時間為16.09個月，四年(48個月)內82.1% (23/28)的患者已經死亡，而新克隆IncRNA低表達的患者，平均生存時間已超過24.53個月，四年(48個月)內僅34.8% (8/23)的患者已經死亡(圖7)。說明新克隆的IncRNA是一個與肝癌預后相關的分子標記，該IncRNA表達高，病人預后差。四、構建shRNA載體干擾新克隆I ncRNA的表達1.材料方法I)試劑及試劑盒限制性內切酶HindII1、BglI1、EcoR I及Cla I，T4DNA連接酶等購自TakaRa公司；TRIZ0LTM Reagent (Invitrogen)；質粒抽提試劑盒(#D6943_01，OMEGA)；膠回收試劑盒(#M5212，OMEGA)；
逆轉錄試劑盒(#A3500,Promega)；抗生素G418 (Ameresc)。2) shRNA 的設計首先將新克隆的IncRNA序列輸入Invitrogen公司的Block-1t RNAi designer軟件，尋找該IncRNA的shRNA最佳祀點,挑選最佳的4條相應的祀點序列如下:shRNA-Ι:5’ -GGACAAGGTCCAAGCTCTTAC-3’(序列表中 SEQ ID NO:33)shRNA-2:5，-GCAGTGCAGCAGTATCATTGC-3’(序列表中 SEQ ID NO:34)shRNA-3:5’ -GCAGCAGTATCATTGCTTAGC-3’(序列表中 SEQ ID NO:35)shRNA-4:5’ -GCAGCTCTGTGTGAGATTTGT-3’(序列表中 SEQ ID NO:36)以廣泛使用的在人類基因組中沒有任何靶點的Scramble序列作為陰性對照，其序列如下:Scramble:5’ -GACACGCGACTTGTACCAC-3’(序列表中 SEQ ID NO:37)針對這4條IncRNA祀點序列，及Scramble序列，根據OligoEngine公司pSUPER載體說明書，設計可形成 發夾結構的寡核苷酸單鏈及其反向互補序列，它們退火后即可形成兩端分別帶限制性酶切位點BglII和HindIII粘性末端的DNA雙鏈。具體需合成的各條寡核苷酸序列及它們配對退回后形成的DNA雙鏈如下:shRNA-Ι:5’ -GATCCCC GGACAAGGTCCAAGCTCTTACTTCAAGAGA GTAAGAGCTTGGACCTTGTCCTTTTTA-313 ' -GGG CCTGTTCCAGGTTCGAGAATG AAGTTCTCT CATTCTCGAACCTGGAACAGGAAAAATTCGA-5， shRNA-2:5’ -GATCCCC GCAGTGCAGCAGTATCATTGC TTCAAGAGA GCAATGATACTGCTGCACTGCTTTTTA-3’3， -GGG CGTCACGTCGTCATAGTAACG AAGTTCTCT CGTTACTATGACGACGTGACGAAAAATTCGA-5， shRNA-3:5， -GATCCCC GCAGCAGTATCATTGCTTAGC TTCAAGAGA GCTAAGCAATGATACTGCTGCTTTTTA-3’3， -GGG CGTCGTCATAGTAACGAATCG AAGTTCTCT CGATTCGTTACTATGACGACGAAAAATTCGA-5， shRNA-4:5， -GATCCCC GCAGCTCTGTGTGAGATTTGT TTCAAGAGA ACAAATCTCACACAGAGCTGCTTTTTA-3’3 ' -GGG CGTCGAGACACACTCTAAACA AAGTTCTCT TGTTTAGAGTGTGTCTCGACGAAAAATTCGA-5， Scramble5’-GATCCCC GACACGCGACTTGTACCAC TTCAAGAGA GTGGTACMGTCGCGTGTC TTTTTA-3，3’-GGG CTGTGCGCTGAACATGGTG AAGTTCTCT CACCATGTTCAGCGCACAG AAAAATTCGA-5J依次對應序列表中SEQ ID NO:38-47。下劃線的部分為shRNA靶向的IncRNA序列。兩條互補配對的DNA退火后，左邊是限制性內切酶BglII的粘性末端，右邊是HindIII的粘性末端。3) shRNA 載體構建
化學合成上述4個shRNA對應的8條單鏈oligo序列,將合成好的oligo用oligoannealing buffer溶解成20 μ Μ,互補單鏈各取10 μ I混合。然后將oligo混合物在PCR儀中95°C加熱5分鐘，然后自然冷卻至室溫，形成雙鏈oligo片段。用Bgl II和Hind III雙酶切pSUPER質粒，回收3.1kb的載體片段，將退火后的粘性末端的DNA和酶切回收的載體按照3:1的物質量的比例混合，用T4連接酶，16°C連接過夜。轉化E.coil感受態，挑選轉化子，菌落PCR以及測序鑒定，再用Cla I和EcoR I酶切構建好的PSUPER質粒，2%的瓊脂糖DNA凝膠電泳，以空白pSUPER為空白對照，判斷插入了目的片段的陽性克隆，陽性克隆測序驗證后用于干擾細胞內新克隆IncRNA的表達。4)細胞培養與轉染肝癌細胞系HepG2購自中國科學院上海生化細胞所，細胞培養所用RPMI1640培基和胎牛血清，及消化細胞所用的胰蛋白酶均為美國Gibco公司產品。將生長狀態良好的肝癌細胞!fepG2按2X IO5個細胞/孔接種于6孔板中，將6孔板置于37°C，5%C02培養箱中，待培養細胞生長至50-70%密度即可開始shRNA表達載體的轉染；轉染過程如下:在無菌EP管中加入3 μ I的lipofectamine2000于100 μ I無血清培養基中混勻靜置5min ； 將構建的shRNA表達載體加入ΙΟΟμ I無血清培養基中；然后與上述包含Iipofectamine的100 μ I無血清培養基溫和混勻，室溫靜置30分鐘，使DNA與脂質體形成復合體；用D-Hank’ s液洗滌細胞3次；將上述混合物中加入800 μ I無血清培養基(無抗生素)，溫和混勻后加入6孔板中的I個孔；將6孔板置于CO2培養箱中，37°C培養6小時，然后棄上清，加入完全培養基繼續培養48小時。5)實時定量PCR檢測shRNA干擾IncRNA表達的效果: 將各種shRNA載體轉染后的IfepG2細胞抽提總RNA，2 μ g RNA經逆轉錄成cDNA后，進行熒光實時定量PCR。新克隆IncRNA引物為5’ -GTCCGTCAGTCCCTCACCT-3’(序列表中SEQID NO:23)和 5’ -ATACAGCCCCAGACCCAAAC-3’(序列表中 SEQ ID NO:24)用于對照的18S 引物為 5’ -TCTTAGCTGAGTGTCCCGCG-3’(序列表中 SEQ ID NO:25)和 5’ -ATCATGGCCTCAGTTCCGAA-3’(序列表中 SEQ ID NO:26),熒光實時定量PCR反應體系
權利要求
1.一個長鏈非編碼RNA基因的應用方法，其特征在于，根據該基因制備用于肝癌輔助診斷或者療效預測的制劑；該基因轉錄本序列為序列表中SEQ ID NO:1-12所示的核苷酸序列中的任一條；或者是與序列表中SEQ ID NO:1-12任一條所示的序列具有90%以上同源性的核苷酸序列；或者是與序列表中SEQ ID NO:1-12任一條所示的序列經硫代修飾或/和甲氧基修飾得到的核苷酸序列。
2.根據權利要求1所述的應用方法，其特征在于，用于肝癌輔助診斷或者療效預測的制劑包括原位雜交檢測試劑和實時定量PCR檢測試劑。
3.根據權利要求2所述的應用方法，其特征在于，根據該基因設計并合成用于原位雜交的寡核苷酸探針。
4.根據權利要求3所述的應用方法，其特征在于，用于原位雜交的寡核苷酸探針序列包括:5’ -CATTGTTTTAATGCTTCCAGATGAGTTTGTATC-3’.5’-CTTTGGAAATAGTGCAGACACAAAACTAGGG-3，.5’-GTGTGTTTTGCAGTCTCCTTGTTTGTTTCTTC-3’ 。
5.根據權利要求2所述的應用方法，其特征在于，根據該基因設計并合成出用于實時定量PCR的檢測引物。
6.根據權利要求5所述的應用方法，其特征在于，用于實時定量PCR檢測的上、下游引物分別為:.5，-GTCCGTCAGTCCCTCACCT-3'和 5，-ATACAGCCCCAGACCCAAAC-3，。
全文摘要
本發明涉及一個新克隆的長鏈非編碼RNA基因的應用方法，根據該基因序列，設計并合成實時定量PCR引物和原位雜交探針，制備用于肝癌輔助診斷或者療效預測的制劑。利用該制劑，在肝癌臨床病例標本中檢測該長鏈非編碼RNA的表達水平，發現該長鏈非編碼RNA在肝癌中表達顯著上調，且該長鏈非編碼RNA表達高的肝癌患者預后較差。
文檔編號C12Q1/68GK103160580SQ20131005986
公開日2013年6月19日 申請日期2013年2月26日 優先權日2013年2月26日
發明者熊煒, 李桂源, 曾朝陽, 李小玲, 張文玲, 范松青, 石磊, 李夏雨, 向波, 肖凱, 向娟娟, 彭淑平, 周艷宏, 肖嵐, 李征, 曹利 申請人:中南大學