專利名稱：小鼠間充質干細胞的分離培養方法
技術領域：
本發明涉及間充質干細胞的分離培養方法。尤其是涉及小鼠的間充質干細胞培養方法。

背景技術：
間充質干細胞除具有長期自我更新和多向分化的潛能，還有免疫原性低，被認為是細胞治療和基因治療的合適的細胞源。由于小鼠維持費用低及它的基因分析很清楚，故當前用于細胞治療和基因治療的動物模型一般是小鼠。
因間充質干細胞的貼壁的特性，在人、狒狒、兔、大鼠等其它動物的骨髓中都能成功分離出間充質干細胞，而小鼠間充質干細胞在分離培養中因非間充質細胞的污染使其遠比人和其它物種難以分離，代傳困難。在國內，暫無人系統詳實的陳述小鼠間充質干細胞的分離方法。最近幾年，雖有幾篇文獻介紹小鼠間充質干細胞的培養方法，但國內的研究機構并未成功的分離培養出來。
發明內容及具體實施方案 材料和推薦試劑 ·DMEM-LG·有蓋培養皿或小瓶子 ·HEPES ·6-孔培養板 ·FBS·15ml離心管 ·外科材料(適當大小的剪子，鑷子等) ·血細胞計數器 ·帶有22G針頭的5ml注射器 ·0.3％臺盼藍(溶于PBS) 培養基 基礎培養基是DMEM-LG含3.7g/l的碳酸氫鈉各種0-15mM HEPES。完全培養基含10％FBS的基礎培養基。
原代培養 步驟 1.用頸椎脫臼法殺死小鼠 2.放入70％的酒精中3分鐘左右，再轉到操凈臺上 3.移去附著在股骨、脛骨上的連接組織(用無菌的剪刀和鑷子) 4.用含有完全培養基的注射器將針頭插入骨的一端并將另一頭的骨端剪去，也可將兩端剪去，沖洗骨髓到皿中 5.來回沖洗最多五次后，將骨棄去 6.轉移細胞懸液到15ml的離心管中，離心300-400g，10分鐘 7.在6ml的完全培養基中重懸細胞。
8.取少量與臺盼藍1∶1混合，用計數板計算細胞數 9.再離心收集細胞，以適當的完全培養基重懸細胞，使細胞的濃度為5×106/ml 10.每孔加入3.5ml的細胞懸液并放入37℃，5％CO2的孵箱 11.種板72小時后，吸出全部舊培養液，加入3.5ml的新鮮培養液 12.在上述條件下，當細胞在第1周至第2周內有70-80％的匯合時，就可進行傳代。
MSC的傳代培養 材料和推薦試劑 ·含10mM HEPES(鈉鹽)且無Ca2+和Mg2+的PBS液 ·胰蛋白酶-EDTA液(0.25％胰蛋白酶和0.01％EDTA). 1.為取得最好的效果，在37℃下，預熱PBS 2.移去培養液，至少用1ml的PBS洗單(細胞)層兩次 3.加50μl/cm2胰蛋白酶-EDTA，37℃孵育5-10分鐘(第一到三傳代)。從第四代起，消化時間約2分鐘 4.用兩倍體積的完全培養液再懸浮細胞，分裝到兩個新的培養瓶中(1:2傳代) 5.當細胞匯合時，重復步驟1-4。到達匯合時，首次傳代可能需要半個月 MSCs培養和傳代的建議 ·每3或4天更換培養液 ·要避免因過多的基質造成細胞無效的分離，避免細胞匯合過度 ·注意消化時間的掌握，不需要一定要將所有的細胞都消化下來 ·這個實驗步驟至少可應用于C57BL和mdx小鼠


1.圖1第九代小鼠間充質干細胞的流式細胞結果； 2.圖2小鼠間充質干細胞光鏡圖片(40×)； 3.圖3小鼠間充質干細胞成骨圖片(100×)； 4.圖4小鼠間充質干細胞成脂圖片(100×)。
第九代小鼠間充質干細胞的流式細胞結果(圖1)、普通光鏡(圖2)及成骨(圖3)及成脂(圖4)。
權利要求
一種分離培養小鼠間充質干細胞的方法，其特征是利用間充質干細胞的貼壁的特性，經過下述條件分離而成
(1)骨髓有核細胞種板量約為2×105cm2
(2)原代胰蛋白酶消化時間需較長(10分鐘)，第一代至四代約5分鐘，此后消化時間1-2分鐘
(3)前四代細胞的匯合度約80％左右時就可消化，按1∶2來傳代。四代后一般按1∶3來傳代。
(4)培養過程中，不必另外增加各種促增殖因子如bFGF等。
全文摘要
本發明涉及小鼠間充質干細胞的分離和培養方法，不必另外增加促增殖因子的條件下，解決了當前干細胞治療研究中的主要動物模型的間充質干細胞培養的難題，為干細胞的基礎和臨床研究提供了條件。
文檔編號C12N5/0775GK101353640SQ200710007898
公開日2009年1月28日 申請日期2007年1月22日 優先權日2007年1月22日
發明者勇 李, 成 張, 符 熊, 于美娟 申請人:勇 李, 成 張, 符 熊