一種博來霉素族衍生物的微生物發酵制備方法
【專利摘要】本發明涉及生物醫藥【技術領域】，具體涉及一種博來霉素族衍生物的微生物發酵制備方法，該方法是通過培養SB9026(保藏號CCTCC?M2011292)發酵用菌株、選擇合適的種子培養基和發酵培養基和培養條件，在此基礎上，在發酵罐中對上述微生物發酵制備方法進行中試放大，通過對溫度、轉速、pH值控制及原料補充控制等調控手段來調試和建立放大規模的新型活性博萊霉素衍生物6’-脫羥基-BLM?S的微生物發酵制備工藝。該制備方法縮短6’-脫羥基-BLM?S的發酵制備周期，提高6’-脫羥基-BLM?S的發酵產率,同時增加了6’-脫羥基-BLM?S在總代謝產物中的比例，便于后繼的分離提純。本發明的博來霉素族衍生物其化學結構通式如說明書中所示。
【專利說明】一種博來霉素族衍生物的微生物發酵制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物醫藥【技術領域】，具體涉及一種新型博來霉素族衍生物的微生物發酵制備方法。
【背景技術】
[0002]博萊霉素(Bleomycin，英文簡字BLM)是20世紀60年代從輪枝鏈霉菌(Streptomyces verticillus)的發酵產物中分離發現的一類糖肽類抗腫瘤抗生素。目前已有十余種博萊霉素天然組分被發現，它們的結構僅在末端胺基上存在差異，其中主要成分為博萊霉素A2 (55%~70%)和博萊霉素B2 (25%~32%)。此外，包括泰萊霉素(Tallysomycin),佐伯霉素(Zorbamycin)和腐草霉素(Phleomycin)在內的天然產物與博萊霉素的結構和活性都極為相似，因此統稱為博萊霉素族糖肽類抗腫瘤抗生素。
[0003]博萊霉素有獨特的分子結構和生物活性，能夠介導激活氧分子，并選擇性地引起單鏈和雙鏈DNA的斷裂從而抑制腫瘤細胞DNA合成和復制。此外，博萊霉素還可以選擇性地裂解RNA從而抑制蛋白質的合成。博萊霉素的活性機理決定了其不會抑制骨髓造血系統和免疫系統，因此對人體白細胞，機體免疫功能和造血系統等的副作用較為輕微。博萊霉素屬于細胞周期非特異性藥物，從上世紀80年代起被開發成為一種重要的有效抗腫瘤藥物，在臨床上廣泛應用。以BLM A2和B2為主要成分的商品藥Blenoxane?就被用于治療睪丸癌，同時還廣泛應用于霍奇金淋巴瘤、鱗狀上皮細胞癌、生殖細胞瘤和其他腫瘤的治療。但是博萊霉素能增加活性氧分子從而導致細胞的氧化壓力，并誘導肺中的上皮和非上皮細胞的衰老和凋亡最終導致肺纖維化。目前博來霉素一般與其他抗腫瘤藥物或輔助藥物聯合應用，以降低其毒性和獲得更好的抗腫瘤效果。
[0004]佐伯霉素(Zorbamycin,英文簡字ZBM)是由黃綠鏈霉菌(Streptomycesf lavoviridis)合成的博萊霉素族抗生素。佐伯霉素與博萊霉素在結構極為相似，主要差別在于佐伯霉素中的末端胺基支鏈不同，第一個噻唑啉/噻唑的氧化程度不同，多肽骨架中存在β -羥基化-L-纈氨酸和L-高絲氨酸結構部分，糖基部分為2-0- (3-0-氨基甲酰-甘露糖基)-6_脫氧-L-古洛糖(如式II所示)。相應的，在佐伯霉素生物合成基因簇(zbm)的40個開放閱讀框(ORF)中，僅有22個顯示出與對應的博萊霉素生物合成基因簇(blm)開放閱讀框的同源性，其它開放閱讀框的不同很可能導致了上述兩種化合物的結構差異。
[0005] 博萊霉素自被發現后便因其強效的抗腫瘤活性迅速成為治療多種腫瘤的特效化療藥物，近年來博萊霉素族抗生素在抗病毒研究中的應用，更加拓寬了其應用范圍。但是博萊霉素導致的劑量依賴性肺纖維化以及一些腫瘤細胞逐漸形成的耐藥性極大地限制了其臨床應用和推廣。因此合成新型的高效低毒的博萊霉素族衍生物一直都是開發博萊霉素類抗腫瘤藥物的關鍵和熱點。雖然博萊霉素的化學全合成已經完成，但是通過傳統化學修飾獲取的少量博萊霉素衍生物并未展示出更好的活性或更低的毒性，同時博萊霉素及其復雜的分子結構也導致相關的合成過程繁瑣且效率低下，無法滿足臨床研究的需要和工業化生產的應用。隨著生物化學和分子生物學的快速發展，新興的組合生物合成方法通過遺傳操縱次代謝產物生物合成基因來獲取目標天然產物衍生物，是一種非常有應用前景的高新技術。通過生物合成基因簇中蘊含的信息以及相關微生物的遺傳操縱，組合生物合成技術可實現復雜結構的多功能團化合物的特定結構改變。另一方面，包括博萊霉素、泰萊霉素和佐伯霉素在內的幾種博萊霉素族抗腫瘤抗生素的生物合成被大量研究，其相關生物合成基因簇已經被分別克隆、測序以及表征，這為我們通過組合生物合成技術來操縱這些生物合成器并獲得具有更好抗腫瘤活性和更低毒性的新型博萊霉素衍生物提供了堅實的基礎，也為最終的博萊霉素類新型抗腫瘤藥物的開發提供了一條新穎高效的途徑。
[0006]
【權利要求】
1.一種博來霉素族衍生物的微生物發酵制備方法，所述博來霉素族衍生物為6’-脫羥基-BLM S，其特征是，具體步驟為: 1)黃綠鏈霉菌SB9026的發酵培養: 將黃綠鏈霉菌SB9026菌株接種至種子培養基中培養，在25° C_35°C下培養1_3天；再取所述種子培養基轉接到發酵培養基中培養，接種量為8%-12%，在25° C-35°C下培養9-10 天；所述種子培養基為:12g/L-17g/L 甘油、12g/L-17g/L 棉籽粉、2.5g/L_3.5g/L NaCl和4.5g/L-5.5g/L蛋白胨，其余為水，pH值為6.8-7.2 ;所述發酵培養基為:18g/L_22g/L 葡萄糖，12g/L-17g/L 可溶性淀粉，18g/L-22g/L 黃豆粉，4.5g/L_5.5g/L 酵母粉，0.08g/L-0.12g/L CuSO4.5Η20，0.48g/L_0.52g/L ZnSO4.7Η20 和 2.5g/L_3.5g/L CaCO3，其余為水，pH為6.8-7.2 ;其中黃綠鏈霉菌SB9026的保藏號為CCTCC M 2011292 ； 2)發酵罐發酵制備博來霉素族衍生物: 采取逐級放大的方式將所述發酵培養基轉接至發酵罐中發酵培養；所述發酵罐培養時采取梯度降溫模式，初始溫度為32° C，當發酵罐培養至20-26小時降溫至30°C ;當發酵罐培養至55-65小時時降溫至28° C，繼續發酵培養115-125小時；在發酵培養過程中對微生物的生長和次代謝產物的合成進行控制，同時通過在線監測PH值和溶氧值，使發酵液中殘糖濃度維持在0.8g/L-l.2g/L，同時pH值維持在7.5以下，溶氧維持在40%_60%，發酵周期為6-12天；6’ -脫羥基-BLM S在發酵液中的產量達30mg/L以上。
2.根據權利要求1所述博來霉素族衍生物的微生物發酵制備方法，其特征是，在步驟O發酵培養之前先對黃綠鏈霉菌SB9026進行涂布培養，篩選高產菌株。
3.根據權利要求1或2所述博來霉素族衍生物的微生物發酵制備方法，其特征是，步驟I)為:將黃綠鏈霉菌SB9026菌株接種至種子培養基中培養，在30°C下培養2天；再取所述種子培養基轉接到發酵培養基中培養，接種量為10%，在30° C下培養12天；所述種子培養基為:15gL甘油、15g/L棉籽粉、3g/L NaCl和5g/L蛋白胨，其余為水，pH值為7.0 ;所述發酵培養基為:20g/L葡萄糖，15g/L可溶性淀粉，20g/L黃豆粉，5g/L酵母粉，0.lg/LCuSO4.5Η20，0.5g/L ZnSO4.7H20 和 3g/L CaCO3，其余為水，pH 值為 7.0。
4.根據權利要求1或2所述博來霉素族衍生物的微生物發酵制備方法，其特征是，步驟2)中所述逐級放大的方式具體為:先將300 μ I黃綠鏈霉重組工程菌SB9026的孢子懸浮液接種到60ml種子培養基中進行第一級放大，在32° C下培養24小時后轉至600ml發酵培養基中進行第二級放大，并在32° C再次培養24-36小時直至菌絲體密度達到肉眼可見密集程度；隨后將所述600ml發酵培養基轉接至裝有6L發酵培養基的15L發酵罐中進行發酵培養。
5.根據權利要求1或2所述博來霉素族衍生物的微生物發酵制備方法，其特征是，步驟2)中發酵罐培養的具體方法為:當發酵罐的容積為12L-20L時，發酵罐開始培養時，初始溫度為32° C ;初始pH值為6.8 ;設置發酵罐溶氧值與轉速為聯動狀態，溶氧的下限值為30%，轉速范圍為210rpm-400rpm ;當發酵罐培養至20-26小時，設置發酵罐溶氧值與轉速為聯動狀態，將培養溫度降低至30° C ;當發酵罐培養至55-65小時，發酵液溶氧值跌至最低，轉速在最高值運轉，此時將培養溫度進一步降低至28° C ;在發酵培養后期約115-125小時，發酵液溶氧值和PH值開始上升時，開始補加葡萄糖溶液，并實時測定發酵液中殘留的還原糖濃度，通過調節補料的頻率和速度以及葡萄糖溶液的濃度，使發酵液中殘糖濃度維持在Ig/L，同時pH值維持在7.5以下，溶氧在40%-60% ;當發酵罐維持補充葡萄糖2_3天，溶氧和pH值開始進一步上升，此時整 個發酵周期結束。
【文檔編號】C12R1/465GK104004804SQ201310059456
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2013年2月26日 優先權日:2013年2月26日
【發明者】段燕文, 沈奔, 朱湘成, 楊虎 申請人:長沙天賜生物醫藥科技有限公司, 長沙慈航藥物研究所有限公司, 哈藥慈航制藥股份有限公司