一株ba5641基因缺失的炭疽桿菌及其構建方法
【專利摘要】本發明公開了一株BA5641基因缺失的炭疽桿菌及其構建方法。本發明所提供BA5641基因缺失的炭疽桿菌是將炭疽桿菌基因組中的BA5641基因替換為抗性篩選標記物基因，得到的重組菌；所述BA5641基因的編碼區序列為序列表中序列2；所述抗性篩選標記物基因為壯觀霉素抗性基因；所述壯觀霉素抗性基因的核苷酸序列為序列表中序列1的第1032-2161位；所述炭疽桿菌為炭疽桿菌A16R株。實驗證明，與炭疽桿菌A16R株相比，該重組菌在L-丙氨酸單獨誘導時、在L-丙氨酸和L-脯氨酸共同誘導時、在L-丙氨酸和L-色氨酸共同誘導時，以及在肌苷和L-色氨酸共同誘導時，其芽孢萌發速率均降低。本發明為研制安全性更強的炭疽疫苗提供了新的思路。
【專利說明】一株BA5641基因缺失的炭疸桿菌及其構建方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，涉及一株BA5641基因缺失的炭疽桿菌及其構建方法。【背景技術】
[0002]炭疽桿菌(Bacillus anthracis)是一種桿狀、能形成芽胞的革蘭氏陽性桿菌,能夠引起人畜的炭疽病，如果不及時治療，死亡率極高。炭疽是五大人畜共患病之一，危害性極強，對世界各地的人類健康及畜牧業都構成了嚴重威脅。炭疽桿菌的芽孢接觸到皮膚傷口、消化道或呼吸道上皮后，將感染并會導致皮膚炭疽、肺炭疽、腸道炭疽等疾病。肺炭疽最為嚴重，將很快導致疾病和死亡。炭疽桿菌還被用作生物戰劑和制造生物恐怖，對社會穩定構成威脅。故炭痕桿菌相關研究一直廣受:關注。
[0003]炭疽桿菌疫苗的研發一直是各國關注的焦點。雖然在屠宰、解剖動物時，接觸的主要是炭疽繁殖體，但炭疽感染多為芽孢被動攝入，通過皮膚、黏膜接觸、呼吸道吸入和胃腸道攝入而感染。當芽孢進入機體接觸血液、淋巴液后，可在20~40min內從休眠狀態復蘇，通過激活、發芽和長出3個連續階段形成繁殖體而增殖。
[0004]減毒活芽孢苗采用無莢膜弱毒株，它是炭疽疫苗研制的重要途徑。考慮到毒力恢復的潛在危險，只有俄羅斯和我國采用。我國采用楊叔雅等選育的A16R株，綿羊、兔、猴的保護結果顯示其對炭疽強毒攻擊保護率為75%~100%，人體接種安全，1961年投產使用至今。但因自然病例少，流行病學資料不夠充分，接種采用皮上劃痕，仍然存在接種劑量難以準確的不足。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是提供一種重組菌及其構建方法。本發明所提供的重組菌是BA5641基因缺失的炭痕桿菌。
[0006]本發明所提供的重組菌，是將炭疽桿菌基因組中的BA5641基因替換為含有抗性篩選標記物基因的DNA片段，得到的重組菌。
[0007]所述BA5641基因編碼的蛋白為序列表中序列3所不的蛋白。
[0008]所述BA5641基因的編碼區序列具體為序列表中序列2(GenBank:NC_003997的弟5126232-5126669 位)。
[0009]所述抗性篩選標記物基因可為壯觀霉素抗性基因。
[0010]在本發明的一個實施例中，所述壯觀霉素抗性基因的核苷酸序列具體為序列表中序列I的第1032-2161位。
[0011]在本發明的一個實施例中，所述含有抗性篩選標記物基因的DNA片段的核苷酸序列具體為序列表中序列I的第934-2257位。
[0012]在本發明中，所述炭疽桿菌具體為炭疽桿菌A16R株。
[0013]在基因水平上，更加具體的，本發明所提供的重組菌如下重組菌株:在所述炭疽桿菌A16R株的基因組序列中，將位于核苷酸序列為序列表中序列I的第1-933位所示的DNA片段(即上游同源臂，對應于GenBank號為NC_003997 “Up date:2012_9_27”的序列的第5125293-5126225位)和核苷酸序列為序列表中序列I的第2258-3218位所示的DNA片段(即下游同源臂，對應于GenBank號為NC_003997 “Up date:2012_9_27”的序列的第5126645-5127605位)之間的序列，替換為序列表中序列I的第934-2257位，得到的重組菌株。 [0014]本發明所提供的制備所述重組菌的方法，具體可包括如下步驟:
[0015](a)將如下核苷酸片段克隆至溫度敏感型穿梭質粒中，得到重組載體；
[0016]所述核苷酸片度自5’端至3’端依次為:在所述炭疽桿菌的基因組序列中位于所述BA5641基因上游的DNA片段1，所述抗性篩選標記物基因，以及在所述炭疽桿菌的基因組序列中位于所述BA5641基因下游的DNA片段2 ；
[0017](b)將步驟(a)中得到的所述重組載體導入到所述炭疽桿菌，并在所述穿梭質粒的非敏感溫度下進行培養，得到重組菌中間體；
[0018](C)將步驟(b)中得到的重組菌中間體在所述穿梭質粒的敏感溫度下進行培養，以去除所述重組載體，得到候選重組菌，從所述候選重組菌中獲得所述重組菌。
[0019]在上述方法中，所述DNA片段I具體為序列表中序列I的第1-933位核苷酸所示的DNA片段，所述DNA片段2具體為序列表中序列I的第2258-3218位核苷酸所示的DNA片段；
[0020]更加具體的，所述核苷酸片段的序列為序列表中序列I。
[0021]所述溫度敏感型穿梭質粒具體為pKSV7質粒；
[0022]步驟(b)中，所述的非敏感溫度可為30°C ;步驟(C)中，所述敏感溫度可為37-400C，在本發明的一個實施例中，具體為40°C。
[0023]所述方法中，在步驟(a)之前還包括將所述重組載體去甲基化的步驟。
[0024]將所述重組載體去甲基化的方法，具體可包括如下步驟:將所述重組載體導入甲基化酶缺陷的大腸桿菌中，得到重組大腸桿菌；從所述重組大腸桿菌中提取質粒，得到去甲基化的重組載體；
[0025]在本發明中，所述大腸桿菌具體為大腸桿菌SCSI 10。
[0026]上述方法中，步驟(C)中，從所述候選重組菌中獲得所述重組菌的方法具體可包括如下步驟:將所述候選重組菌分別在僅含有所述抗性篩選標記物(如壯觀霉素)的培養基和僅含有所述重組載體的抗性標記物I (如氯霉素)的培養基中培養，選取在僅含有所述抗性篩選標記物(如壯觀霉素)的培養基生長，而在僅含有所述重組載體的抗性標記物I (如氯霉素)的培養基中不生長的菌株，即得到所述重組菌。
[0027]本發明的再一個目的是提供如下(I)或(2)的生物材料:
[0028](I) DNA分子，其核苷酸序列為序列表中序列I所示；
[0029](2)含有步驟(1)中所述DNA分子的重組載體、表達盒、重組細胞系或重組菌；
[0030]所述重組載體具體為將所述DNA分子插入到溫度敏感型穿梭質粒中得到的重組質粒;
[0031]所述溫度敏感型穿梭質粒具體為pKSV7質粒。
[0032]以上任一所述重組菌在制備炭疽疫苗中的應用也屬于本發明的保護范圍。
[0033]本發明所提供的重組菌為炭疽桿菌A16R株的BA5641基因缺失株，實驗證明，與炭疽桿菌A16R株相比，該重組菌在L-丙氨酸單獨誘導時、在L-丙氨酸和L-脯氨酸共同誘導時、在L-丙氨酸和L-色氨酸共同誘導時，以及在肌苷和L-色氨酸共同誘導時，其芽孢萌發速率均降低。本發明為研制安全性更強的炭疽疫苗提供了新的思路。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1為連接產物化轉大腸桿菌DH5a后的菌落PCR鑒定結果。其中，泳道1、2、3、4、
5、6、7、8、9、10為挑取的克隆(泳道10為陽性克隆)，泳道M為中科瑞泰公司的DNA MarkerIV，目的片段大小約為1K。
[0035]圖2為連接產物化轉大腸桿菌DH5a后提取質粒的酶切鑒定結果。其中，泳道I為Hind III和EcoR I雙酶切的結果，泳道2為未經酶切的原質粒，泳道M為中科瑞泰公司的DNA Marker IV。
[0036]圖3為重組載體pKBA5641USD電轉大腸桿菌SCSllO后的菌落PCR鑒定結果。其中，泳道1、2、3、4、5、6為挑取的克隆(泳道1-6均為陽性克隆)，泳道M為中科瑞泰公司的DNAMarker IV，目的片段大小約為1K。
[0037]圖4為重組載體pKBA5641USD電轉大腸桿菌SCSllO后提取質粒的酶切鑒定結果。其中，泳道I為Hind III和EcoR I雙酶切的結果，泳道2為未經酶切的原質粒，泳道M為中科瑞泰公司的DNA Marker IV。
[0038]圖5為重組載體pKBA5641USD電轉炭疽桿菌A16株后的菌落PCR鑒定結果。其中，泳道1、2、3、4、5、6、7、8為挑取的克隆(泳道1_8均為陽性克隆)，泳道9為陽性對照(以重組載體PKBA5641USD為模板)，泳道M為中科瑞泰公司的DNA Marker IV，目的片段大小約為 500bp。
[0039]圖6為目的菌株外部引物及內部引物的位置信息及其PCR鑒定結果。其中，A為兩對外部引物及一對內部引物的位置信息為兩對外部引物及一對內部引物的PCR鑒定結果，I是以A16R菌株的基因組為模板，2是以A16R Δ BA5641:: spc菌株的基因組為模板。
[0040]圖7為炭疽桿菌A16R株和A16R Λ ΒΑ5641:: spc突變株芽孢蛋白的雙向電泳圖。圖中所示的點G002、G005、G008和GOll為BA5641蛋白點。
[0041]圖8為炭疽桿菌A16R株和A16RABA5641::spc突變株的生長曲線。
[0042]圖9為炭疽桿菌A16R株和A16R Δ BA5641:: spc突變株的生理生化鑒定結果。
[0043]圖10為高濃度的L-丙氨酸(IOOmM的L-丙氨酸)單獨誘導炭疽桿菌A16R株和A16R Δ BA5641:: spc突變株芽孢萌發的萌發曲線。其中的BA5641即表示A16R Δ BA5641:: spc 突變株。
[0044]圖11為L-丙氨酸和L-脯氨酸(ImM的L-丙氨酸和IOmM的L-脯氨酸)共同誘導炭疽桿菌A16R株和A16R Δ BA5641::spc突變株芽孢萌發的萌發曲線。其中的BA5641即表不 A16R Δ BA5641:: spc 突變株。
[0045]圖12為L-丙氨酸和L-色氨酸(ImM的L-丙氨酸和IOOmM的L-色氨酸)共同誘導炭疽桿菌A16R株和A16R Δ BA5641:: spc突變株芽孢萌發的萌發曲線。其中的BA5641即表示A16R Δ BA5641:: spc突變株。 [0046]圖13為肌苷和L-色氨酸(ImM的肌苷和IOOmM的L-色氨酸)共同誘導炭疽桿菌A16R株和A16RA BA5641::spc突變株芽孢萌發的萌發曲線。其中的BA5641即表示A16R Δ ΒΑ5641:: spc 突變株。
[0047]圖14為肌苷(ImM的肌苷)誘導炭疽桿菌A16R株和A16R Δ BA5641:: spc突變株芽孢萌發的萌發曲線。其中的BA5641即表示么161?厶845641::8?(3突變株。
【具體實施方式】
[0048]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0049]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0050]pKSV7 質粒:記載在“Smith K, Youngman P.Use of a new integrational vectorto investigate compartment-specific expression of the Bacillus subtilis spoIIMgene[J].Biochimie, 1992，74:705-711.” 一文中，公眾可從中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所獲得。
[0051]pT-loxp:: spc質粒:記載在“王艷春，姜娜，展德文等.Cre-LoxP系統在炭疽芽胞桿菌基因敲除中的應用及eag基因的敲除[J].生物化學與生物物理進展，2009, 36(7):934-940.” 一文中，公眾可從中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所獲得。
[0052]炭疽芽孢桿菌A16R (即炭疽桿菌A16R):記載在“高美琴，劉先凱，馮爾玲等.炭疽芽孢桿菌A16R株eag基因 缺失突變株構建[J].微生物學報，2009, 49 (I): 23-31.”一文中，公眾可從中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所獲得。
[0053]實施例1、BA5641基因缺失的炭疽桿菌A16R Δ BA5641:: spc的構建
[0054]一、重組載體pKBA5641USD的構建及其去甲基化
[0055]1、重組載體pKBA5641USD的構建
[0056](I)溫敏型質粒線性化
[0057]將溫度敏感型穿梭質粒pKSV7 (6.9Kb)用限制性內切酶Hind III和EcoR I酶切線性化，之后0.6%瓊脂糖凝膠電泳分離，從凝膠上切下目標條帶，用DNA凝膠回收試劑盒回收線性化載體片段，操作步驟按照說明書進行，得到線性化PKSV7質粒。
[0058](2)目標基因(BA5641)上下游同源臂的獲取
[0059]使用Primer premier5.0軟件,根據炭疽桿菌Ames株染色體上BA5641基因(序列2，GenBank:NC_003997的第5126232-5126669位，編碼序列表中序列3所示的蛋白)上下游序列，設計BA5641基因上下游同源臂序列的引物(TBA5641U_F和TBA5641U_R，以及丁8八56410_?和 TBA5641D_R，如表 I 所示)。
[0060]表1研究中使用的引物
[0061]
【權利要求】
1.重組菌，是將炭疽桿菌基因組中的BA5641基因替換為含有抗性篩選標記物基因的DNA片段，得到的重組菌。
2.根據權利要求1所述的重組菌，其特征在于:所述BA5641基因的編碼區序列為序列表中序列2。
3.根據權利要求1或2所述的重組菌，其特征在于:所述抗性篩選標記物基因為壯觀霉素抗性基因； 所述壯觀霉素抗性基因的核苷酸序列具體為序列表中序列I的第1032-2161位；或 所述含有抗性篩選標記物基因的DNA片段的核苷酸序列為序列表中序列I的第934-2257 位。
4.根據權利要求1-3中任一所述的重組菌，其特征在于:所述炭疽桿菌為炭疽桿菌A16R 株。
5.根據權利要求4所述的重組菌，其特征在于:所述重組菌為如下重組菌株:在所述炭疽桿菌A16R株的基因組序列中，將位于核苷酸序列為序列表中序列I的第1-933位所示的DNA片段和核苷酸序列為序列表中序列I的第2258-3218位所示的DNA片段之間的序列，替換為序列表中序列I的第934-2257位，得到的重組菌株。
6.制備權利要求1-5中任一所述重組菌的方法，包括如下步驟: Ca)將如下核苷酸片段克隆至溫度敏感型穿梭質粒中，得到重組載體； 所述核苷酸片段自5’端至3’端依次為:在權利要求1-5任一中所述炭疽桿菌的基因組序列中位于所述BA5641基因上游的DNA片段1，權利要求1_5任一中所述抗性篩選標記物基因，以及在權利要求1-5任一中所述炭疽桿菌的基因組序列中位于所述BA5641基因下游的DNA片段2 ； (b)將步驟(a)中得到的所述重組載體導入到權利要求1-5任一中所述的炭疽桿菌，并在所述穿梭質粒的非敏感溫度下進行培養，得到重組菌中間體； (C)將步驟(b)中得到的重組菌中間體在所述穿梭質粒的敏感溫度下進行培養，以去除所述重組載體，獲得所述重組菌。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于:所述DNA片段I為序列表中序列I的第1-933位核苷酸所示的DNA片段，所述DNA片段2為序列表中序列I的第2258-3218位核苷酸所示的DNA片段；或 所述核苷酸片段的序列為序列表中序列I ;和/或 所述溫度敏感型穿梭質粒為PKSV7質粒；和/或 所述非敏感溫度為30°C，所述敏感溫度為37°C -40°C。
8.根據權利要求6或7所述的方法，其特征在于:所述方法中，在步驟(a)之前還包括將所述重組載體去甲基化的步驟； 所述將所述重組載體去甲基化的方法，具體包括如下步驟:將所述重組載體導入甲基化酶缺陷的大腸桿菌中，得到重組大腸桿菌；從所述重組大腸桿菌中提取質粒，得到去甲基化的重組載體； 所述大腸桿菌具 體為大腸桿菌SCS110。
9.如下(I)或(2)的生物材料: (I)DNA分子，其核苷酸序列如序列表中序列I所示；(2)含有步驟(1)中所述DNA分子的重組載體、表達盒、重組細胞系或重組菌；所述重組載體具體為將所述DNA分子插入到溫度敏感型穿梭質粒中得到的重組質粒；所述溫度敏感型穿梭質粒具體為PKSV7質粒。
10.權利要求1-5中任一所述重 組菌在制備炭疽疫苗中的應用。
【文檔編號】C12N1/21GK104004696SQ201310062204
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2013年2月27日 優先權日:2013年2月27日
【發明者】王恒樑, 劉先凱, 高飛, 朱力, 馮爾玲 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所