專利名稱：一種可被豬物種NF-κB轉錄因子所識別的DNA片段、重組載體及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于動物基因工程領域，具體而言，涉及一種可被豬物種NF-K B轉錄因子所識別的DNA片段、重組載體及其應用。
背景技術：
NF-κ B信號通路在豬抗病免疫反應中起著至關重要的作用。NF K B存在于絕大多數類型的組織和細胞，是一類非常關鍵的轉錄因子，并組成轉錄因子NF K B家族(Ghoshet al., 1998 ；Miyamoto and Verma, 1995 ；Siebenlist et al., 1994),哺乳動物中此家族的五位成員分別是:NFk BI (p50)，NFk B2(p52, p49, p50B)，RelA (p65)，c-Rel, RelB0 所有成員都含有一個保守的由300個左右氨基酸組成的Rel同源區，該同源區是NFk B蛋白特有的功能域，負責形成 二聚體，并與DNA識別位點及抑制蛋白I K BQnhibitor κ B)結合(Baeuerle and Henkel, 1994 ;Perkins, 2007)。哺乳類動物中 I κ B 家族成員有 7 個,分別是11^0，11^@，11^丫，11^8，Bcl-3, plOO 和 pl05。通常情況下，NF κ B 家族是以同源或異源二聚體形式與I κ B蛋白形成復合物，以非活性形式存在于細胞質中。關于I κ B蛋白與NFk B亞單位結合后阻止NFk B與靶基因調控區結合的機理業已闡明(Brasier，2006 ；DiDonato et al.，1996 ；K1 ement et al.，1996):當 IkB 蛋白與 NF κΒ ρ65 亞基結合時，使ρ65的空間構象改變，ρ65亞基Ig樣結構域的氨基末端旋轉180° ,從而使與祀DNA序列結合的關鍵氨基酸殘基被屏蔽，從而抑制NF κ B與靶基因調控區的特異性結合。而I κ B蛋白N端第32、36位絲氨酸殘基從NF κ B-1 κ B復合物中位置凸出，極易被I κ B蛋白激酶(IkB kinase, IKK)磷酸化,磷酸化的IkB進一步被蛋白酶體泛素化降解,使NF κ B激活，從NF κ B-1 κ B復合物中解離出并轉位于細胞核，與相應的靶基因結合。但同時I κ B在被降解后又可迅速再合成，并能進入細胞核與NF κ B結合，而NF κ B-1 κ B復合物的形成使NF κ B從其所結合的DNA位點上脫離，并重新轉移至細胞質，由此實現NF κ B激活與失活的循環，完成NF κ B作為一種轉錄因子的調控功能。目前國際學術界普遍采用知名生物技術公司(如Stratagene和Clontech)開發的商業化人用NF-κ B報告載體作為各個哺乳動物中通用的研究工具，但其中所隱含的問題仍不容忽視，原因在于:在不同的物種中，NF-κ B轉錄因子所識別并結合的特異DNA序列不盡相同，因此人用NF-κ B報告載體所得數據的靈敏性和穩定性不一定能夠滿足研究者的要求。如果能夠開發出一套適用于豬的NF-κ B報告系統，則可為豬的免疫學研究提供更為精細、可靠的工具。

發明內容
鑒于現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種可被豬物種NF- κ B轉錄因子所識別的DNA片段和重組載體，以及該DNA片段作為調控豬物種NF- κ B信號通路下游基因表達的啟動子的應用、該重組載體作為檢測豬物種NF-κ B轉錄因子轉錄活性強度的報告載體的應用。本發明提供的DNA片段是由豬物種的多個NF- κ B結合位點按不同順序排列而成的核苷酸序列，并且具有啟動子活性。本發明中的術語“啟動子”系指DNA上一段序列，RNA聚合酶結合到該序列上，可以起始基因的轉錄。具體地，本發明的第一個目的是這樣實現的:—種可被豬物種NF-κ B轉錄因子所識別的DNA片段，其核苷酸序列是如下(I)或
(2):(I)序列表中序列1、序列2、序列3、序列4、序列5或序列6所示的核苷酸序列；(2)與所述(I)的核苷酸序列具有90%以上同源性且具有啟動子活性的核苷酸序列。本發明的DNA片段還包括與來自序列1、序列2、序列3、序列4、序列5或序列6所示的核苷酸序列互補的核苷酸序列。這里使用的術語“互補的”系指遵循堿基配對原則產生的之意。本領域普通技術人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進化和點突變的方法，對本發明的啟動子核苷酸序列進行突變。那些經過人工修飾的，具有與本發明分離得到的啟動子核苷酸序列90%或者更高同源性的核苷酸，只要保持了表達靶基因的啟動子活性,均是衍生于本發明的核苷酸序列并且等同于本發明的序列。這里使用的術語“同源性”指與天然核苷酸序列的序列相似性?！巴葱浴卑ㄅc本發明的啟動子核苷酸序列具有優選地95%或更高同一性的核苷酸序列。同源性可以用肉眼或計算機軟件進行評價。使用計算機軟件，兩個或多個序列之間的同源性可以用百分比(% )表示，其可以用來評價相關序列之間的同源性。含有上述的DNA片段的重組載體也屬于本發明的保護范圍之內。上述的重組載體，其中所述的載體是pGL3_bas i c。優選地，上述的重組載體是在pGL3_basic載體的多克隆位點通過Mlul、BglII雙酶切插入上述的DNA片段后得到的重組載體。含有上述DNA片段的轉基因細胞系也屬于本發明的保護范圍之內。含有上述的DNA片段的重組菌也屬于本發明的保護范圍之內。本發明的另一個目的在于提供上述的DNA片段作為啟動子的應用。上述的啟動子為調控豬物種NF-κ B信號通路下游基因表達的啟動子。本發明的又一目的在于提供上述的重組載體作為檢測豬物種NF- κ B轉錄因子轉錄活性強度的報告載體的應用。試驗證明:本發明提供的DNA片段作為豬物種NF-K B轉錄因子的識別核苷酸序列，可作為啟動子調控NF-κ B信號通路下游基因的表達，從而通過下游基因的表達強度來判斷豬細胞內NF-κ B轉錄因子轉錄活性的強度。本發明提供的報告載體是將上述DNA片段插入到pGL3-basic的多克隆位點(即螢火蟲熒光素酶編碼基因的5’端)而獲得的調控型表達載體，該載體可與穩定型表達載體pRL-TK配合使用(以后者海腎熒光素酶表達量作為內對照)，可檢測NF-κ B轉錄因子轉錄活性的強度，為豬的免疫學研究提 供了更為精細、可靠的工具。


圖1為以Stratagene公司的pNF- κ B-Luc載體作為對照報告載體，檢測豬NF- κ Βρ65過表達所致NF- κ B信號通路的激活。圖2為以實施例1的載體A作為報告質粒，檢測豬NF- κ B ρ65過表達所致NF- κ B信號通路的激活。圖3為以實施例1的載體B作為報告質粒，檢測豬NF- κ B ρ65過表達所致NF- κ B信號通路的激活。圖4為以實施例1的載體C作為報告質粒，檢測豬NF- κ B ρ65過表達所致NF- κ B信號通路的激活。

圖5為以實施例1的載體D作為報告質粒，檢測豬NF- κ B ρ65過表達所致NF- κ B
信號通路的激活。圖6為以本實施例1的載體E作為報告質粒，檢測豬NF-kB ρ65過表達所致NF-κ B信號通路的激活。圖7為以實施例1的載體F作為報告質粒，檢測豬NF- κ B ρ65過表達所致NF- κ B信號通路的激活。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為常規生化試劑商購買得到。以下實施例中的定量試驗，均至少設置三次重復實驗，結果取平均值。細胞系PIEC(豬血管內皮細胞):購自中國科學院上海細胞庫，產品目錄號:GN015。pNF-κ B-Luc 載體購自 Stratagene 公司，貨號:#219077。pRL-TK 購自 Promega 公司，貨號:E2241。pcDNA3.1 (+)購自 Invitrogen 公司，貨號:V790_20。pGL3_Basic 購自Promega公司，貨號:E1751。pcDNA3.1 (+) _pp65為本實驗室保存，是豬NF-κ B轉錄因子p65亞基的過表達載體，在以下實施例中作為NF-κ B激活劑使用，其作用已在有關文獻中得到證實(Hegang Li,Guojian Ma,Duan Gui, Shuanping Zhao,Pan Wang,Kongwang He,XueminWang,Jinxue Ruan,Jiyue Cao,Shulin Yang,Kui L1.Characterization of the porcinep65subunit of NF-κ B and its association with virus antibody levels.MolecularImmunology, 48 (2011):914-923)。pcDNA3.1 (+)-pp65 載體序列如序列表所不。實施例1、重組載體的構建按照如下序列合成單鏈寡核苷酸(上海英駿生物技術有限公司合成):AF:cgcg tAGGACTTTCCGGAAATTCCCCGGGAAACCCCGAGAAATCCCCGGGAGTTTCTCGGGAAGTACCaAR: gatctGGTACTTCCCGAGAMCTCCCGGGGATTTCTCGGGGTTTCCCGGGGMTTTCCGGAMGTCCTaBF: cgcgtAGGACTTTCCGGGAMCCCCGGAMTTCCCCGAGAMTCCCCGGGMGTACCGGGAGTTTCTCaBR: gatctGAGAMCTCCCGGTACTTCCCGGGGATTTCTCGGGGMTTTCCGGGGTTTCCCGGAMGTCCTaCF: cgcgtGGGMGTACCGGGAGTTTCTCGAGAMTCCCCGGGAMCCCCGGAMTTCCCCAGGACTTTCCaCR: gatctGGAMGTCCTGGGGMTTTCCGGGGTTTCCCGGGGATTTCTCGAGAMCTCCCGGTACTTCCCaDF: cgcgtGGGAGTTTCTCGGGAMCCCCAGGACTTTCCGAGAMTCCCCGGGMGTACCGGAMTTCCCCa
權利要求
1.一種可被豬物種NF-K B轉錄因子所識別的DNA片段，其核苷酸序列是如下(I)或(2): (1)序列表中序列1、序列2、序列3、序列4、序列5或序列6所示的核苷酸序列； (2)與所述(I)的核苷酸序列具有90%以上同源性且具有啟動子活性的核苷酸序列。
2.含有權利要求1所述的DNA片段的重組載體。
3.根據權利要求2所述的重組載體，其特征在于:所述的載體是pGL3-basic。
4.根據權利要求2所述的重組載體，其特征在于:所述的重組載體是在pGL3-basic載體的多克隆位點通過Mlul、BglII雙酶切插入權利要求1所述的DNA片段后得到的重組載體。
5.含有權利要求1所述的DNA片段的轉基因細胞系。
6.含有權利要求1所述的DNA片段的重組菌。
7.權利要求1所述的DNA片段作為啟動子的應用。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于:所述的啟動子為調控豬物種NF-KB信號通路下游基因表達的啟動子。
9.權利要求2或3或4所述的重組載體作為檢測豬物種NF-K B轉錄因子轉錄活性強度的報告載 體的應用。
全文摘要
本發明公開了一種可被豬物種NF-κB轉錄因子所識別的DNA片段、及其應用。本發明的DNA片段，其核苷酸序列是如下(1)或(2)(1)序列表中序列1、序列2、序列3、序列4、序列5或序列6所示的核苷酸序列；(2)與所述(1)的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有啟動子活性的核苷酸序列。本發明的重組載體為含有該DNA片段的重組載體。試驗證明本發明提供的DNA片段可作為啟動子調控NF-κB信號通路下游基因的表達，從而通過下游基因的表達強度來判斷豬細胞內NF-κB轉錄因子轉錄活性的強度。
文檔編號C12N15/113GK103205426SQ20131007374
公開日2013年7月17日 申請日期2013年3月8日 優先權日2013年3月8日
發明者李和剛, 趙金山, 阮進學, 江科, 侯樂樂, 郝小靜, 李培培, 張寶珣 申請人:青島市畜牧獸醫研究所