專利名稱：一株嗜鉛菌的克隆與培養的制作方法
技術領域：
本發明涉及高效吸附鉛菌株的篩選，PCR方法進行鑒定，目的菌在體內外環境中吸附效率的測定，動物鉛中毒造模，ICP-MS法測定Pb2+含量，所篩選的乳酸菌吸附效率高，檢測方法檢出限低，靈敏度高。
背景技術：
環境持久性污染物尤其是重金屬對空氣、水源及土壤的污染日趨嚴重已成為不爭事實。重度污染區域的飲水，蔬菜、水果和糧食等農作物，以及動物源食品中重金屬含量超標已在所難免。如何阻抗和減少重金屬在動物和人體內的蓄積與危害是亟待解決的重大課題。因此，我們團隊開展了本項研究。目的菌的篩選與鑒定采用傳統的技術和快速鑒定技術相結合，使用乳酸菌選擇性培養基，并在其中添加不同濃度的Pb2+，初步篩選出具有高抗鉛性和高吸附性的菌株，經過生化鑒定試劑盒和16SrDNA序列分析法對篩選的菌株進行鑒定。16SrDNA擴增使用通用引物，PCR擴增片段約為1500bp，命名為Q dk/m-1
所篩選的目的菌在體內外吸附試驗中，吸附效率高，體外吸附試驗模擬胃腸道環境。而體內吸附試驗使用家兔作為試驗對象，首先是鉛中毒造模階段，造模成功后，按照動物體重飼喂鉛清除劑。與原子吸收光譜法、原子熒光光譜法、原子發射光譜法相比，電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)測定Pb2+檢出限低、靈敏度和精密度高、選擇性好以及可以同時檢測多元素，被認為是目前最靈敏的檢測方法，已經廣泛應用于食品、環境、藥品、生物樣品等領域的分析研究
發明內容
本發明要解決的技術問題是篩選出一株具有高效吸附鉛性能的乳酸菌，為研制一種鉛抵抗益生菌制劑，有效減少Pb2+在動物和人體的積累提供技術儲備。本發明的技術方案是從動物的體內篩選出鉛抗性的乳酸菌，經過一系列的生化鑒定，利用通用引物進行PCR擴增鑒定。通過發酵培養添加到動物飼料中，測定其對動物體內鉛的清除作用，用ICP-MS方法測定血液、糞便、肌肉、內臟組織中的Pb2+。


附圖是本發明所述的鉛抗性乳酸菌的克隆及培養流程圖，具體實施方式
:
1.耐鉛乳酸菌的篩選
無菌采集動物腸道及糞便樣品，利用傳統的細菌分離技術在
MRS乳酸菌選擇性培養基中進行分離，首先在含有不同Pb2+濃度的MRS液體培養基中盡心耐鉛性馴化，選擇篩選出耐鉛濃度大于400mg/l的菌株。2.鉛高效吸附菌株的篩選將篩選的耐鉛菌株進行吸附效率測定，將目的菌接種于含Pb2+濃度為100mg/l的MRS液體培養基中37°C，140r/min振蕩6h后測定Pb2+含量。3.目的菌株的生化鑒定
采用乳酸菌生化鑒定試劑盒進行生化鑒定，挑取一環活化的菌 株接種于試劑管中，倒插于泡沫板上，37°C溫箱中培養24h。4.乳酸菌基因組提取
將保存的目的菌于LB中活化，采用CTAB/NaCl法提取乳酸菌 DNA。通過SDS裂解細胞，蛋白酶降解蛋白，CTAB去除多糖成分。5.擴增引物
16SrDNA擴增采用通用引物，正向引物為27f:
5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';反向引物 1541r:5' -AAGGAGGTGATCCAGCC-3'。6.PCR 擴增
在優化的PCR反應條件下進行PCR擴增，得到一段大小為1500bp的DNA產物。反應條件為預變性94°C，5min ;變性:94°C，lmin，退火:58 °C，lmin，延伸:72°C,2min，30 個循環；延伸:72°C，lOmin，4°C保存。25ul PCR反應體 系，IOXPCR Buffer 2.5 μ L, dNTP 終物質的量為 2pmol，Mg2+ 終物質的量為32.5pmol, 1.25U Taq酶、引物1、引物2引物終物質的量均為5pmol。7.體外吸附試驗
模擬人工胃液和人工腸液的吸附環境進行Pb2+吸附試驗。8.動物體內試驗
選擇家兔為試驗對象，先進行鉛中毒造模試驗，造模成功后，
進行鉛拮抗試驗，每天早上9:00飼喂5ml乳酸菌發酵液，菌體濃度達到109cfu/ml，對照組飼喂相同劑量的飲用水。每3天進行耳動脈采血，測定血鉛含量，并采集糞便測定鉛的排泄。飼喂結束后，處死采集血液、糞便、肌肉、骨骼、內臟阻組織測定鉛的含量，判斷乳酸菌發酵液的體內清除效率。9.樣品消解
各個樣品均采用濕法消解，準確稱量樣品0.1000-0.5000g，使用 混合酸(硝酸:高氯酸=5:1)進行消解。10.1CP-MS 測定 Pb2+濃度
7700X電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)靈敏度和精確度高、檢出限低，被認為是目前最靈敏的檢測方法，已經廣泛應用于食品、環境、藥品、生物樣品等領域的分析研究。通過ICP-MS測定染鉛前血鉛濃度為3.1304mg/l，鉛中毒造模成功血鉛濃度為
7.2992mg/l，飼喂本實驗室篩選的乳酸菌后血鉛濃度降低為2.136mg/l，與造模后相比體內清除率為70.74%，而且飼喂拮抗劑后血鉛濃度低于染鉛前的濃度，因此，此株抗鉛菌株可以有效的清除體內的重金屬鉛。此外，內臟器官鉛含量的測定顯示，與對照組相比，肝臟中鉛含量降低最明顯，腎臟中也有所降低，但不明顯。
權利要求
1.篩選鑒定的具有重金屬鉛吸附性的乳酸菌，是通過傳統的細菌篩選方法從雞的腸道及其排泄物中篩選得到的，由于該菌株是從動物腸道中篩選得到的，穩定性好，無致病性，可以在動物腸道內定殖等優點，減少進入腸道內重金屬鉛被機體吸收而蓄積于體內組織臟器； 方法如下: 步驟一，耐鉛菌株的馴化，傳統篩選 步驟二，高效吸附鉛菌株篩選 步驟三，引物設計 步驟四，PCR擴增 步驟五，吸附液的制備 步驟六，動物體內吸附實驗 步驟七，ICP-MS法測定鉛含量 該菌株的特點是耐鉛濃度高、穩定好、吸附效率高、安全性高。
2.根據權利要求1所述馴化及篩選方法，所篩選的目的菌為乳酸菌，所以選擇乳酸菌選擇性培養基MRS瓊脂，其方法是首先在含低濃度(50mg/l)鉛的MRS液體培養基中培養，再依次增加濃度進行馴化100，150，200mg/l，馴化的耐鉛菌株在含鉛的MRS瓊脂平板上為白色圓菌落；分離純化的耐鉛菌株分別接種在含Pb2+ 0，250，300，350，400mg/l的液體培養基中，目的菌株可以耐受的Pb2+彡400mg/l。
3.根據權利要求1所述的篩選方法，通過測定菌株在培養基中 以及模擬胃腸道環境中對鉛的吸附，篩選出高效吸附性的目的菌，其方法是篩選抗鉛菌株按照1%的接種量接種于MRS液體培養基中培養18-24h達到生長對數期，取2ml培養液12000r/min離心IOmin收集菌體，菌體沉淀分別加入到IOmlMRS液體培養基，IOml模擬胃腸道環境的液體中，37°C，140r/min搖床吸附2h后離心取出菌體，上清液定容至50ml后測定鉛的濃度；人工胃液的配制方法:9.5%-10.%的鹽酸16.4ml，加水稀釋使PH達到3.0 ； 每IOOml溶液中加入1.0g胃蛋白酶，混勻，用0.2um無菌濾膜過濾； 人工腸液的配制方法:稱取磷酸二氫鉀6.8g，加水500ml溶解，用0.4%的氫氧化鈉溶液調PH至6.8，加水稀釋至1000ml，每IOOml液體中加入1.0g胰蛋白酶混勻，用0.2um無菌濾膜過濾。
4.根據權利要求1所述的篩選方法，16SrDNA擴增采用通用引物，正向引物為27f:5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';反向引物 1541r:5' -AAGGAGGTGATCCAGCC-3'。
5.根據權利要求1所述的PCR反應條件，其特征是在該反應條件下，目的基因的擴增效果很好，所述反應條件為預變性94°C,5min ;變性:94°C, lmin,退火:58°C, lmin,延伸:72°C，2min，30 個循環；延伸:72°C，lOmin，4°C保存；25ul PCR 反應體系中，IOXPCR Buffer2.5μ L，dNTP終物質的量為2pmol，Mg2+終物質的量為32.5pmol, 1.25U Taq酶、引物1、引物2引物終物質的量均為5pmol。
6.根據權利要求1所述的吸附液的制備，方法是按1%的接種量接種于LB肉湯中，37°C,140r/min搖床培養至菌體的濃度為109cfu/ml，于4°C保存備用。
7.根據權利要求1所述的動物體內吸附實驗，由于家兔適應性強，不易生病，價格合理等因素，故選擇家兔為實驗對象，其體重為2.21 ±0.2kg，飼喂一周觀察健康后隨機分組，每組6只，進行鉛中毒造模，按照3mg/kg體重，飼喂5mg/ml的醋酸鉛溶液，造模過程中每3天耳動脈采血測定血鉛含量，不造成家兔體重明顯變化，不降低其食物利用率，至血鉛水平>600ug/l時停止鉛染毒； 造模成功后，任然飼喂鉛模擬每天通過飲食和飲水攝入體內的鉛，同時，每天早上9:00根據家兔采食量的一半，實驗組飼喂不同劑量的鉛清除劑(乳酸菌吸附液)5ml/d，對照組飼喂相同劑量的飲用水，然后再添加充足的飼料，在清除過程中每一周耳動脈采血測定血鉛濃度，并測定糞便鉛的含量；3周后每組處死一半，采集血液、糞便、肝臟、心臟、腎臟、腦、肌肉、脂肪測定鉛含量。
8.根據權利要求1所述的鉛含量測定中，樣品經過濕法消解后，采用7700X電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)，ICP-MS方法檢出限低、干擾少、靈敏度高；鉛元素校正曲線的相關系數R達到0.9 999，方法檢出限為0.02205ppb。
全文摘要
本發明是從動物的腸道和排泄物中分離篩選出具有鉛抗性和鉛吸附性的乳酸菌，通過體外吸附和體內吸附研究，獲得一株具有吸附鉛性能的益生乳酸菌。獲得的乳酸菌具有吸附鉛性能，通過家兔體內試驗證明該菌能夠減少鉛在體內的蓄積，具有促進血鉛、內臟鉛排泄的排鉛解毒作用，沒有絡合副作用，不會造成鈣、鐵、鋅等微量元素的損失。該菌株為乳酸菌，是腸道正常菌群之一，其生理效益比較明顯，穩定性好，無致病性，可作為飼料或食品添加劑減少動物和人體內鉛的蓄積。
文檔編號C12N1/36GK103146633SQ20131007454
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月8日 優先權日2013年3月8日
發明者趙宏坤, 滿兆紅, 都啟晶, 姜彥君, 范穎華, 李鳳梅 申請人:青島農業大學