專利名稱：曲霉屬菌株與內切殼聚糖酶的編碼基因、制備與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種內切殼聚糖酶CsnW2的基因序列及其制備方法和應用。本發明還提供了該內切殼聚糖酶的重組質粒和重組基因工程菌株。本發明的內切殼聚糖酶CsnW2可廣泛應用于化工、農業、食品、飼料添加及醫藥等領域。
背景技術：
殼聚糖(chitosan)，又名聚氨基葡萄糖、殼多糖、脫乙酰甲殼素、脫乙酰甲殼質、可溶性幾丁質、殼糖胺、甲殼多聚糖和聚甲殼糖等，化學名為聚β - (I — 4) -2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖。殼聚糖是幾丁質經過脫乙 酰基得到的產物，一般幾丁質的脫乙酰度超過50%時被認為是殼聚糖。殼聚糖廣泛存在于蝦、蟹、昆蟲外殼以及藻類和菌類的細胞壁中。由于其分子量較大，水溶性差，使其廣泛應用受到了很大限制。但其降解產物，一系列殼寡糖和氨基葡萄糖具有獨特的生理活性和功能性質，如調節免疫、抗腫瘤、抗菌、降低膽固醇和促進鈣的吸收，且易溶于水，是一種新興的功能性低聚糖，在食品、醫藥、農業和化妝品等領域有廣泛的應用。目前，制備殼寡糖的方法主要有化學法、物理法和生物法。但化學條件苛刻，反應的穩定性和重復性差，產物聚合度不易控制，污染嚴重，不易得到聚合度相對均一的低聚殼寡糖。物理法得到的產物聚合度也不易控制，其重復性也較差，所以溫和、高效、產物易控制和穩定無污染的生物法逐漸引起了人們的關注。生物法制備殼寡糖是利用自然界中存在的生物，特別是微生物產生的各種殼聚糖酶來降解殼聚糖，如何獲得高產殼聚糖酶的微生物菌株和聞酶活的殼聚糖酶的研究備受:關注。殼聚糖酶分布非常廣泛，目前已從細菌(如:Bacillus、Myxobacter>Enterobacter)、放線菌(如:Streptomyces、Nocardioides)、霉菌(如:Aspergillus、Penicillium)、病毒(如chlorella virus PBCV_1、CVK_2)及植物的不同組織中檢測到殼聚糖酶的存在。目前殼聚糖酶的分類有兩種方式。一是根據酶對糖苷鍵的水解分類，根據酶的底物特異性將殼聚糖酶分為3類:第I類主要是可以水解GlcNAc-GlcN和GlcN-GlcN糖苷鍵的殼聚糖酶，如來自Bacillus pumilus BN-262和Streptomyces sp.N174的殼聚糖酶；第2類只能水解GIcN-GIcN鍵，產生這一類酶的菌株目前只有Bacillus sp.N0.7_M ;第3類既可水解GIcN-GIcN鍵，又可水解GlcN-GlcNAc鍵，產酶菌株包括S.gmeus HUT6037和B.circulansMH.Kl等。即殼聚糖酶1、I1、III類。二是根據酶的氨基酸序列分類，殼聚糖酶主要分布在糖苷水解酶家族5、8、46、75和80五個家族。其中細菌來源的殼聚糖酶主要屬于46家族，真菌來源的殼聚糖酶主要屬于75家族。兩族殼聚糖酶同源性差，而目前細菌來源的殼聚糖酶研究較多，對于真菌，尤其是來源于棒曲霉的殼聚糖酶研究較少。目前來源于棒曲霉的殼聚糖酶基因的克隆與表達未見報道
發明內容
本發明的第一個目的是提供一種產殼聚糖酶的曲霉屬菌株，其為棒曲霉W-2，分類命名:棒曲霉 Aspergillus clavatus,保藏編號:CGMCC N0.7018。本發明的第二個目的是提供一種新型高效的內切殼聚糖酶CsnW2及其編碼基因。本發明的第三個目的是提供一種制備新型高效內切殼聚糖酶CsnW2的方法。本發明的第四個目的是提供含有所述的內切殼聚糖酶CsnW2基因的基因工程表達體系。本發明的第五個目的是提供新型高效內切殼聚糖酶CsnW2在殼聚糖降解中的應用。本發明所提供的內切殼聚糖酶CsnW2，來源于土壤中分離純化的曲霉屬菌株Aspergillus clavatus w_2,其氨基酸序列具有如下特征之一:I)序列表中SEQ ID N0.3從氨基端開始的第1_242或第18-242位氨基酸殘基序列；2)將序列表中的SEQ ID N0.3從氨基端開始的第1_242或18-242位氨基酸殘基序列經過氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加后，具有降解殼聚糖活性的蛋白質；3)與序列表中SEQ ID N0.3所限定的氨基酸序列的同源性達到90%及以上且具有降解殼聚糖活性的蛋白質。本發明還提供了內切殼聚糖酶CsnW2的編碼基因(命名為csnW2)，具有下述核苷酸序列特征之一:I)具有序列表中SEQ ID N0.1的核糖核酸(RNA)序列和SEQ ID N0.2的脫氧核糖核酸(DNA)序列；2)編碼SEQ ID N0.3氨基酸序列的脫氧核糖核酸(DNA)序列；3)具有與序列表中SEQ ID N0.2所限定的脫氧核糖核酸(DNA)序列的同源性達到90%及以上，且能編碼降解殼聚糖的蛋白質的脫氧核糖核酸(DNA)序列。本發明的殼聚糖酶CsnW2的氨基酸序列及其核苷酸編碼序列也可以根據預測的Csnff2的氨基酸序列及其核苷酸編碼序列人工合成獲得。制備重組酶CsnW2的方法，是將編碼基因csnW2克隆入重組表達載體，導入宿主細胞，獲得重組表達的內切殼聚糖酶。所述的重組表達內切殼聚糖酶CsnW2的表達載體可以是大腸桿菌表達載體、酵母表達載體、枯草桿菌表達載體、乳酸菌表達載體、鏈霉菌表達載體、噬菌體載體、絲狀真菌表達載體、植物表達載體、昆蟲表達載體、或哺乳動物細胞表達載體等。 用于重組表達內切殼聚糖酶CsnW2的重組菌或轉基因細胞系，可以是大腸桿菌宿主細胞(如 Escherichia coli BL21、Escherichia coli JM109、Escherichiacoli DH5 α 等)、酵母菌宿主細胞(如 Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris、Kluyveromyces Iactis 等)、枯草桿菌宿主細胞(如 Bacillus subtilis R25、Bacillussubtilis9920等)、乳酸菌宿主細胞(如Lactic acid bacteria C0CC101等)、放線菌宿主細胞(如 Streptomyces spp.等)、絲狀真菌宿主細胞(如 Trichoderma viride, Trichodermareesei, Aspergillus niger、Aspergillus nidulans 等)、昆蟲細胞(如 Bombyx mori,Antharaea eucalypti等)或哺乳動物細胞(如中國倉鼠卵巢細胞CH0，幼小倉鼠腎臟細胞BHK、中國倉鼠肺細胞CHL等)。
本發明的CsnW2來源于土壤中分離純化的曲霉屬菌株Aspergillus clavatusw-2。其基因和氨基酸序列通過Race的方法克隆得到。具體方法:(I)內切殼聚糖酶CsnW2其3’端mRNA序列的克隆。真菌18S及形態觀察初步鑒定菌株為棒曲霉。通過對同源性較近的菌株中殼聚糖酶的序列進行同源比對。找出約7個氨基酸的保守序列；再對對應的mRNA進行同源比對，設計一條簡并引物。提取棒曲霉w-2的總RNA，按照Takara RNA PCR Kit (Ver.3.0)說明書進行RT-PCR擴增。經過兩輪PCR擴增的產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的條帶并與PMD19-T載體連接，轉化ToplO，經PCR鑒定后送上海英駿生物技術有限公司北京測序部測序，得到3’端mRNA序列。(2)內切殼聚糖酶CsnW2其5’端mRNA序列的克隆:基于上述方法得到的3’端mRNA,設計兩條反向引物。按照 Clontech SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit 說明書進行5’ RACE。經過兩輪PCR擴增的產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的條帶并與pMD19-T載體連接，轉化ToplO，經PCR鑒定后送上海英駿生物技術有限公司北京測序部測序，得到5’端mRNA序列。(3)將3’和5’ Race結果進行拼接，并進行生物信息學分析。在NCBI上對開放閱讀框分析，進而推導出內切殼聚糖酶CsnW2的氨基酸序列。設計相應的引物，以mRNA為模板進行反轉錄和PCR，PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的條帶并與pMD19-T載體連接，轉化ToplO，經PCR鑒定后送上海英駿生物技術有限公司北京測序部測序，得到全長序列。上述內切殼聚糖酶基因編碼區長729bp，編碼了 262個氨基酸，分子量約29kD，屬于殼聚糖酶家族75。畢赤酵母重組表達獲得的CsnW2，以殼聚糖為底物時，在40°C _60°C、pH3.5-5.0的條件下具有較高活性。本發明提供的殼聚糖酶CsnW2可廣泛應用于化工、農業、食品、飼料添加和醫藥等領域，具有較大的生產潛力和 經濟價值。序列表SEQ ID N0.1 AUGCGCUAUCUUGCAACUGCUGCCGUUUUGGCUGGAGCAGGCCUGGCCUCGGCCUAUAGUGUCCCAGCCAACCUACAGCAAAUCUAUAACAAACACAAGACCGGAACAUGCCAGAACAAGCUGCAAGACGGUUUUUCCGAUGGCAUCAGCGGCCCCGGCACCUCCGCCUACUGCGGCGACAUCCAGGGGGCGAUCUUCCUUCUAGCUCCGCCAAUGGCGGCCA⑶AUGAUAACAUGGACAUUGACUGCGAUGGAGCGAACAACAGCGGCGGCGACUGUGCGAAUGAUCCCUCCGGCCAGAGCAUGACGGC⑶UCAUGGAUACGGUGAAGCAAUACGGCAUUUCGGAUCUGGACGCCAACAUCCACCCGUACGUGGUGUUUGGUAACUCGGGCAGCUCGCCG
ACCUUUGAUCCUCAGCA⑶AUGGAAUGCAGCC⑶UAAGCGUGAUGGCUGUGGUGUGCAAUAAUCAGCUGUUCUAUGGUGUCUGGG⑶GACACCAACG⑶GAUAUCGCUACUGGGGAGGCUUCCAUCUCGCUGGCCAAAU 腳⑶ UUCCCCAAUGAUG ⑶ A
UCACCG ⑶ GACAAUGGCCAUGACCAGGACGA 腳 ACUCUACAUUGGGUUUACGGGGCAGGAUACUGUCCCCGGUGCUAGUGCUGCCUGGACUGCUAGCGACACUUCAACCUUUGAGGAGA⑶AUCAAGG ⑶ CUCG ⑶ GAUCGCCU 腳 UGCUAAGCUUAGCGCUUAASEQ ID N0.2ATGCGCTATCTTGCAACTGCTGCCGTTTTGGCTGGAGCAGGCCTGGCCTCGGCCTATAGTGTCCCAGCCAACCTACAGCAAATCTATAACAAACACAAGACCGGAACATGCCAGAACAAGCTGCAAGACGGTTTTTCCGATGGCATCAGCGGCCCCGGCACCTCCGCCTACTGCGGCGACATCCAGGGGGCGATCTTCCTTCATAGCTCCGCCAATGGCGGCCAGTATGATAACATGGACATTGACTGCGATGGAGCGAACAACAGCGGCGGCGACTGTGCGAATGATCCCTCCGGCCAGAGCATGACGGCGTTCATGGATACGGTGAAGCAATACGGCATTTCGGATCTGGACGCCAACATCCACCCGTACGTGGTGTTTGGTAACTCGGGCAGCTCGCCGACCTTTGATCCTCAGCAGTATGGAATGCAGCCGTTAAGCGTGATGGCTGTGGTGTGCAATAATCAGCTGTTCTATGGTGTCTGGGGTGACACCAACGGTGATATCGCTACTGGGGAGGCTTCCATCTCGCTGGCCAAATTGTGTTTCCCCAATGATGGTATCACCGGTGACAATGGCCATGACCAGGACGATGTACTCTACATTGGGTTTACGGGGCAGGATACTGTCCCCGGTGCTAGTGCTGCCTGGACTGCTAGCGACACTTCAACCTTTGAGGAGAGTATCAAGGGTCTCGGTGATCGCCTTGTTGCTAAGCTTAGCGCTTAASEQ ID N0.3MRYLATAAVLAGAGLASAYSVPANLQQIYNKHKTGTCQNKLQDGFSDGISGPGTSAYC⑶IQGAIFLHSSANGGQYDNMDIDCDGANNS
GGDCANDPSGQSMTAFMDTVKQYGISDLDANIHPYVVFGNSGSSPTFDPQQYGMQPLSVMAVVCNNQLFYGVWGDTNGDIATGEASISLAKLCFPNDGITCDNGHDQDDVLYIGFTGQDTVPGASAAWTASDTSTFEESIKGLGDRLVAKLSA


圖1:重組內切殼聚糖酶CsnW2表達及純化的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖(SDS-PAGE)。各泳道加入的樣品分別是:M:蛋白質標識物(marker),條帶自上至下大小為170kD, 130kD,IOOkD, 70kD, 55kD, 40kD, 35kD, 25kD ;泳道 1:發酵液上清，上樣量 20 μ 1，泳道 2:1OOmmol 的咪唑洗脫收集液，上樣量20 μ I。圖2:ρΗ值對內切殼聚糖酶CsnW2的活性影響曲線。圖3:溫度對內切殼聚糖酶CsnW2的活性影響曲線。 圖4:殼聚糖酶CsnW2降解殼聚糖所得產物的HPLC圖
曲霉屬的菌株,其為棒曲霉W-2,分類命名:棒曲霉Aspergillus clavatus,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，保藏編號=CGMCC N0.7018，保藏日期2012年12月18日。
具體實施例方式本發明制備該新型殼聚糖酶的方法，即利用基因工程的技術方法，將該新殼聚糖酶的基因克隆到畢赤酵母表達載體上，獲得可異源表達該酶的畢赤酵母重組菌株，用該菌株異源表達制備的殼聚糖酶CsnW2在pH3.5-5.0和40°C _60°C下有較高活性，具有降解殼聚糖制備殼寡糖的功能。實施例1曲霉屬菌株Aspergillus clavatus W-2的培養及生產殼聚糖酶所米用的菌種為棒曲霉，挑取Aspergillus clavatus W-2 菌株(CGMCC N0.7018)的單克隆接種到30ml液體培養基中，接著放入溫度為30°C、轉數為150rpmin的搖床培養4
天后，將培養液離心收集上清培養基。使用的液體培養基配方為(g/L):殼聚糖5.0g、酵母浸粉0.5g、NaCl0.5g、MgS04.7Η201.44g、CaC120.lg、KC10.5g、K2HP042.0g、KH2P041.0g，pH 值為 7.0，余量為水。酶活力單位(U)定義:每分鐘催化殼聚糖產生I μ mol還原糖所需要的酶量。根據DNS法測得Aspergillus clavatus ff-2菌株的液體培養基上清中酶活為0.53U/ml。實施例2Aspergillus clavatus ff-2 菌株總 RNA 的提取將菌株進行4天 培養，用紗布過濾，將菌體直接放入液氮保存。從中取約40mg菌體，在液氮下研磨三次。之后加Iml Trizol試劑，待融解后移入1.5ml離心管。向體系中加入200ul氯仿,劇烈震蕩，靜置5min, 12000rpm離心15min。小心取上清到新離心管中，加入等體積的異丙醇，靜置5min, 12000rpm離心lOmin。倒掉上清，向沉淀中加體積濃度為75%的乙醇lml，7500rpm離心5min。最后將沉淀用無核糖核酶活性的水20_50ul融解。放-80°C保存待用。實施例3csnW2基因3’端mRNA序列的克隆按寶生物工程(大連)有限公司3’ -Full RACE Core Set Ver.2.0 (TakaraCode:D314)說明書中操作步驟，以其中的3’ RACEAdaptor為引物，Aspergillusclavatus ff-2菌株總RNA為模板反轉錄合成cDNA的第一條鏈；以3’ RACE OuterPrimer(TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT)和 SP Primer(ATGGAYATCGACTGYGAYGG)為引物進行第一輪 PCR，其反應條件為:94°C 3min,30 個循環(94°C 30sec,55°C 30sec,72°C 1.2min),72°C IOmin ;#3’RACE Inner Primer (CGCGGATCCTACCGTCGTTCCACTAGTGATTTCACTATAGG)和SP Primer(ATGGAYATCGACTGYGAYGG)為引物進行第二輪 PCR，反應條件為:94°C 3min，30 個循環(94°C 30sec，58°C 30sec，72°C 1.2min),72°C IOmin0 將兩輪 PCR 產物用 1% 瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的條帶并與PMD19-T載體連接，轉化入ToplO，經菌落PCR驗證后送上海英駿生物技術有限公司測序。實施例4csnW2基因5’端mRNA序列的克隆按照Clontech SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit 說明書要求，對Aspergillus clavatus W-2菌株總RNA的進行前處理；以3’端序列為參照，設計兩條弓丨物，5RACE Outer sp Wl (GGACACGAACGTATCAAATCGACTA)和 5RACE Inner sp Wl(TCCTGCCCCGTAAACCCAA);以5RACE Outer sp Wl為引物，前處理總RNA為模板進行反轉錄合成cDNA的第一條鏈；以5RACE0uter sp Wl和試劑盒中UPMlOX引物，以上述cDNA第一條鏈為模板進行第一輪PCR，反應條件為:94°C 3min，25個循環(94°C 30sec，68°C 30sec,72°C 1.5min)，72°C IOmin ;以 5RACE Inner sp Wl 和UPMlOX為引物，以一輪PCR產物為模板進行第二輪PCR，反應條件為:94°C 3min，30 個循環(94°C 30sec,58°C 30sec,72°C 1.5min),72°C IOmin0將兩輪PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的條帶與pMD19_T載體(Takara:D102A)連接構成重組質粒pMD19-T_csnW2，轉化入大腸桿菌(ToplO)，經菌落PCR驗證后送上海英駿生物技術有限公司測序。實施例5csnW2基因在大腸桿菌中的重組表達以上述實施例4中的重組質粒pMD19-T_csnW2為模板，用下述引物對進行PCR擴增。引物對如下:正向引物 Nde1-SignalP-F (GCCCATATGTATAGTGTCCCAGCCAACC)，反向引物Xho1-SignalP+ATG-R (AATGAGCTCCACGAACGTATCAATCGACTA),正向引物下劃線標注的是限制性內切酶Ned I位點，反向引物下劃線標注的是限制性內切酶Xho I位點。DNA聚合酶(DRR200A)購自寶生物公司，PCR反應體系按照公司提供的產品說明操作。PCR反應條件:94°C預變性5分鐘，然后94°C變性30sec-50°C退火30sec_72°C延伸lmin，30個循環，最后72°C延伸IOmin。將PCR產物用Ned I和Xho I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收酶切的PCR產物。將購于美國Novagen公司的產物pET_23b載體用Ned I和Xho I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收酶切載體。Ned I和Xho I均購于寶生物公司，酶與底物反應的體系、溫度和時間均按照公司提供的產品說明操作。將經過雙酶切的PCR產物與同樣經過雙酶切pET_23b載體連接，連接產物轉化大腸桿菌(ToplO)菌株后涂布于含有50 μ g/ml氨節西林的Luria-Bertani培養基(胰蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，酵母粉0.5%，瓊脂2%)固體平板上，37°C培養12h，挑取單克隆；將單克隆接入含有50 μ g/ml氨節西林的液 體Luria-Bertani培養基中培養,提取質粒；將質粒用上述正向引物Nde1-SignalP-F和反向引物Xho1-SignalP+ATG-R進行菌落PCR驗證，結果得到大小正確的擴增產物，初步證明構建的重組質粒正確；接著將該重組質粒送去上海英駿生物技術有限公司測序，結果表明，在pET-23b的Ned I和Xho I酶切位點之間插入SEQ IDN02所示的csnW2基因，且插入方向正確，所以進一步證明構建的重組質粒正確。將上述重組質粒轉化大腸桿菌菌株BL21 (DE3)(購自美國Novagen公司),然后按照該公司提供的操作步驟進行殼聚糖酶CsnW2誘導表達及純化。實施例6csnW2基因在畢赤酵母X33中的重組表達以實施例4中的重組質粒pMD19-T_csnW2為模板，用下述引物對進行PCR擴增。引物對如下:正向引物 Xho 1-S i g-F: (GACCTCGAGAAAAGATATAGTGTCCCTGCCAACC )，反向引物Xbal-Sig+His-R: (GACTCTAGAAGCGCTAAGTTTAGCAAC)，正向引物下劃線標注的是限制性內切酶Xho I位點，反向引物下劃線標注的是限制性內切酶Xba I位點。DNA聚合酶(DRR200A)購自寶生物公司，PCR反應體系按照公司提供的產品說明操作。PCR反應條件:94°C預變性5分鐘，然后94°C變性30sec-5(TC退火30sec_72°C延伸lmin，30個循環，最后72°C延伸IOmin0將PCR產物用Xho I和XbaI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收酶切的PCR產物。將購于美國Invitrogen公司的產物pPICZ a A載體用Xho I和Xba I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收酶切載體。Xho I和Xba I均購于寶生物公司，酶與底物反應的體系、溫度和時間均按照公司提供的產品說明操作。將經過雙酶切的PCR產物與同樣經過雙酶切pPICZ a A載體連接，連接產物轉化大腸桿菌ToplO菌株后涂布于含有50 μ g/ml氨節西林的Luria-Bertani培養基固體平板上，37°C培養12h，挑取單克隆；將單克隆接入含有50 μ g/ml氨芐西林的液體Luria-Bertani培養基中培養，提取質粒；將質粒用正向引物Xho1-Sig-F (GACCTCGAGAAAAGATATAGTGTCCCTGCCAACC)和反向引物 Xbal-Sig+His-R (GACTCTAGAAGCGCTAAGTTTAGCAAC)進行菌落 PCR 驗證，結果得到大小正確的擴增產物，初步證明構建的重組質粒正確；接著將該重組質粒送去上海英駿生物技術有限公司測序，結果表明，在pPICZ a A的Xho I和Xba I酶切位點之間插入SEQ IDN02所示的csnW2基因，且插入方向正確，所以進一步證明構建的重組質粒正確。將上述重組質粒用 SacI進行線性化,然后按照Invitrogen公司畢赤酵母表達手冊進行電轉入X33和篩選，得到高拷貝的轉化株。用該公司提供的操作步驟進行殼聚糖酶CsnW2誘導表達及純化，結果如圖1所示，純化后的殼聚糖酶CsnW2在電泳膠上呈單一條帶，且位置與預測的分子量相吻合。實施例7殼聚糖酶CsnW2的酶學性質分析(I) pH和溫度對酶活性的影響將質量為Ig的殼聚糖(脫乙酰度90%)底物溶于IOOml不同pH值的50mM醋酸鈉-醋酸緩沖液(pH范圍為3.6-6.0),配制成質量濃度為1%底物，并與純化的CsnW2酶液按1000:1 (體積比)的比例混合后，在40°C反應30分鐘，按前述的DNS法測酶活力。結果顯示CsnW2在pH4.0時達到最大活力，表明CsnW2的最適反應pH為4.0 (如圖2)在最適pH下，將質量濃度為1%殼聚糖底物與純化的CsnW2酶液按1000:1 (體積t匕)的比例混合，分別在不同溫度(30°C -70°C)反應30分鐘，按前述的DNS法測酶活力。結果顯示CsnW2在50°C時達到最大活力，表明CsnW2的最適反應溫度為50°C (如圖3)。在最適pH和最適溫度下，將質量濃度為1%殼聚糖底物與純化的CsnW2酶液按1000:1 (體積比)的比例混合后反應30分鐘，按前述的DNS法測酶活力。用購于北京索萊寶公司的蛋白質定量試劑盒測定CsnW2酶液的蛋白含量，結果表明重組CsnW2對殼聚糖的比活為1852U/g。(2) pH和溫度對酶穩定性的影響將在不同溫度(30°C -70°C )下熱處理30分鐘后的CsnW2酶液與質量濃度為1%的殼聚糖底物溶液(PH4.0)按1000:1(體積比)的比例混合，然后在最適溫度下測定剩余酶活，以不經過熱處理的酶液酶活定義為100%相對活力(relativie activity),結果表明CsnW2在低于40°C的溫度下具有較好的熱穩定性。將在30°C，不同的pH (PH3-10)預孵育24h后的CsnW2酶液與質量濃度為1%殼聚糖底物溶液(PH4.0)按1000:2(體積比)的比例混合，然后在最適溫度下測定剩余酶活，以不經過pH處理的酶液酶活定義為100%相對活力(relativie activity),結果顯示在pH4
10的范圍內，Csnff2酶活仍保持60%以上，表明CsnW2對pH值耐受范圍較廣。(3) Csnff2的底物偏好性將純化的CsnW2分別與質量濃度為1%的殼聚糖、膠體幾丁質和羧甲基纖維素三種不同底物按1000:1 (體積比)的比例混合，然后在50°C，pH5.0條件下反應30分鐘，按前述DNS法測反應液中是否有還原糖產生來確定其活性。結果表明以羧甲基纖維素為底物沒有明顯的活性。實施例8金屬離子對CsnW2活性的影響向質量濃度為1%殼聚糖底物(pH4.0)中添加終濃度IOmM的不同的金屬離子，如:Na+，K+，Mg2+，Ca2+，Co2+，Mn2+，Fe3+，Cu2+or Ag+ (AgN03)，然后與純化的 CsnW2 酶液按1000:1 (體積比)的比例混合，并在40°C反應30分鐘，按前述的DNS法測酶活力。對照組為不加任何金屬離子時CsnW2的活性(設定為100%)。結果顯示Mg2+和Mn2+能增加CsnW2活性(約1-2倍)；Fe3+, Cu2+和Ag+對酶活呈現抑制作用。實施例9CsnW2降解殼聚糖所得產物的高效液相色譜(HPLC)分析將質量濃度為1%的殼聚糖(ρΗ4.0)與純化的CsnW2按1000:1 (體積比)的比例混合，然后在50°C下反應，選取不同酶解時間(111，211，511，1011)的產物進行高效液相色譜分析。高效液相色譜采用離子交換色譜柱:CarboPac PAl (DIONEX, ColumnN0.35391，4X250mm, 1.D.with particle size of10 μ m);檢測器:Coulochem
II(ESA, USA);柱溫:30 °C ;流動相:90mM NaOH ;流速:0.4mL/min。其中酶解10小時的高效液相色譜圖如圖4所示。色譜圖顯示CsnW2降解殼聚糖10小時的產物中有一系列不同聚合度的殼寡糖，該結果充分證明了 CsnW2屬于內切殼聚糖酶。因此，內切殼聚糖酶CsnW2可被用于殼寡糖的制備以及與殼聚糖降解相關的領域，包括化工、農業、食品、飼料添加 、醫藥及海藻遺傳工程等。
權利要求
1.曲霉屬的菌株，其為棒曲霉W-2,分類命名:棒曲霉Aspergillusclavatus,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，保藏編號=CGMCC N0.7018，保藏日期2012年12月18日。
2.—種來源于權利要求1所述菌株(Aspergillus clavatus)的內切殼聚糖酶基因csnW2，其核苷酸序列具有如下特征之一: 1)具有序列表中SEQID N0.1的核糖核酸(RNA)序列或SEQ ID N0.2的脫氧核糖核酸(DNA)序列； 2)編碼SEQID N0.3氨基酸序列的脫氧核糖核酸(DNA)序列； 3)具有與序列表中SEQID N0.2所限定的脫氧核糖核酸(DNA)序列的同源性達到90%及以上，且能編碼降解殼聚糖的蛋白質的脫氧核糖核酸(DNA)序列。
3.按照權利要求2所述的內切殼聚糖酶基因編碼的內切殼聚糖酶，其編碼的氨基酸序列具有如下特征之一: 1)序列表中SEQID N0.3從氨基端開始的第1_262或第18-262位氨基酸殘基序列； 2)將序列表中的SEQID N0.3從氨基端開始的第1-262或18-262位氨基酸殘基序列經過氨基酸殘基的取代、缺失、添加中的一種或二種以上后，具有降解殼聚糖活性的蛋白質； 3)與序列表中SEQID N0.3所限定的氨基酸序列的同源性達到90%及以上且具有降解殼聚糖活性的蛋白質。
4.一種制備如權利要求3所述的內切殼聚糖酶的方法，其特征在于:是將權利要求2所述的內切殼聚糖酶基因克隆入重組表達載體，導入宿主細胞，獲得重組表達的內切殼聚糖酶； 所述的重組表達內切殼聚糖酶的表達載體，是指大腸桿菌表達載體、酵母表達載體、枯草桿菌表達載體、乳酸菌表達載體、鏈霉菌表達載體、噬菌體載體、絲狀真菌表達載體、植物表達載體、昆蟲表達載體、或哺乳動物細胞表達載體； 所述的重組表達內切殼聚糖酶的宿主細胞，是指大腸桿菌宿主細胞(如Escherichiacoli BL21、Escherichia coli JM109、Escherichia coli DH5 α 等)、酵母菌宿主細胞(如Saccharomyces cerevisiae>Pichia pastoris>Kluyveromyces Iactis 等)、枯草桿菌宿主細胞(如Bacillus subtilis R25、Bacillus subtilis9920等)、乳酸菌宿主細胞(如Lacticacid bacteria C0CC101等)、放線菌宿主細胞(如Streptomyces spp.等)、絲狀真菌宿主細胞(如 Trichoderma viride, Trichoderma reesei, Aspergillus niger、Aspergillusnidulans等)、昆蟲細胞(如Bombyx mori, Antharaea eucalypti等)，哺乳動物細胞(如中國倉鼠卵巢細胞CH0，幼小倉鼠腎臟細胞BHK、中國倉鼠肺細胞CHL等)中的一種。
5.一種如權利要求3所述的內切殼聚糖酶在殼聚糖降解中的應用，其特征在于:具有如下用途之一或二種以上； 1)用于斷裂殼聚糖或幾丁質的糖苷鍵，獲得殼寡糖或幾丁寡糖； 2)用于降解蝦蟹殼或昆蟲外殼中的幾丁質和殼聚糖組分，抽提色素或其中的蛋白，色素和其中的蛋白可以應用于食品及其他研究。
6.如權利要求5所述的應用，其特征在于:所述內切殼聚糖酶CsnW2與其他殼聚糖酶、脫乙酰酶及幾丁質結合蛋白混合后，用于協同斷裂殼聚糖糖苷鍵方面的應用。
全文摘要
本發明公開了一種內切殼聚糖酶CsnW2的基因序列及其制備方法與應用。本發明所涉及的內切殼聚糖酶CsnW2來源土壤新分離菌株Aspergillus clavatus。本發明還提供了一種制備該新型殼聚糖酶的方法，即利用基因工程的技術方法，將該新殼聚糖酶的基因克隆到畢赤酵母表達載體上，獲得可異源表達該酶的畢赤酵母重組菌株，用該菌株異源表達制備的殼聚糖酶CsnW2在pH3.5-5.0和40℃-60℃下有較高活性，具有降解殼聚糖制備殼寡糖的功能。本發明提供的殼聚糖酶CsnW2可廣泛應用于化工、農業、食品、飼料添加和醫藥等領域，具有較大的生產潛力和經濟價值。
文檔編號C12P19/26GK103215192SQ20131007471
公開日2013年7月24日 申請日期2013年3月8日 優先權日2013年3月8日
發明者杜昱光, 張建平, 曹海龍, 岳敏, 黃李淑馨, 李曙光, 趙勇, 劉航 申請人:中國科學院大連化學物理研究所