專利名稱：一種高特異高敏感檢測結核菌群的方法
技術領域：
本發明涉及疾病檢測技術領域，具體的說，是一種高特異高敏感檢測結核菌群的方法。
背景技術：
結核病是結核桿菌導致的嚴重危害人類健康的傳染病，全球每年發病人數超過1000萬人，我國是結核重災國之一，每年新發病例達到一百萬人，嚴重危害國民健康，結核菌生長緩慢，培養時間長達41周，而PCR、基因芯片等核酸檢測技術需要昂貴的設備和熟練的操作，不易在基層醫療機構推廣，本發明提供廉價的簡便的高特異性檢測感染人類的結核菌群的引物序列和方法，以提高基層醫療機構的結核防治工作需要。環介導等溫擴增技術是由日本榮研(EIKEN)株式會社開發的高特異性敏感度的核酸檢測系統，無須昂貴的設備，已經成為核酸快速檢測法的良好手段，本發明結合環介導等溫擴增技術，設計針對結核菌群rpoB基因序列的一對外引物(Tr-F3和Tr_B3)和一對內引物(Tr-FIP和Tr-ΒΙΡ)進行環介導等溫擴增。

發明內容
本發明公開了一種高特異高敏感檢測結核菌群的方法，提高了它的檢測和診斷效率。樣處理廠的告知系統為實現上述技術目的，達到上述技術效果，本發明通過以下技術方案實現:
一種高特異高敏感檢測結核菌群的方法，包括以下步驟:
步驟I)制備反應液 反應液組成及含量為
8u/ul Bst核酸聚合酶8u
IOX耐熱聚合酶反應緩沖液lX，MgS04 2mM
4M甜菜堿IM
IOmM d-NTP 混合液400 μ M
內引物
Tr-FIP40umol
Tr-BIP40umol
外引物
Tr_F35umol
Tr_B35umol
標本核酸20ng
添加焦碳酸二乙酯處理水至總量達到25ul ；
步驟2)將上述反應液放入63°C烘箱進行反應30-60min，渾濁為陽性；步驟3)使用臨床分離結核菌菌株核酸，以及臨床分離非結核分枝桿菌以及若干臨床分離頭皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草綠色鏈球菌、大腸桿菌、克雷伯菌的核酸，多次進行反應，觀察它們的陰陽性。進一步的，所述外引物Tr-F3的序列為GAGCGGGGTGATGTCAAC。進一步的，所述外引物Tr-B3的序列為GTGACGAACAGTGGAGCC。
進一步的，所述內引物Tr-FIP的序列為 CAACGACATCGACCCGGAGAAGCAGTGGGTGGCCTGGA。進一步的，所述內引物Tr-BIP 的序列為 TCTCTGACCCTCGTTTCGACGAGCGTACGTCATGTCCTTGT。進一步的，所述反應液中加入熒光顯示物質溴化乙錠、鈣黃綠素進行實時檢查。本發明的有益效果是:
本發明通過配制反應液，設計引物序列，能快速、準確的檢測結核菌群，并及時采取相應的措施，減少了疾病的發生率。
具體實施例方式下面將結合實施例，來詳細說明本發明。

一種高特異高敏感檢測結核菌群的方法，包括以下步驟:
步驟I)制備反應液
反應液組成及含量為
8u/ul Bst核酸聚合酶8u
IOX耐熱聚合酶反應緩沖液lX，MgS04 2mM
4M甜菜堿IM
IOmM d-NTP 混合液400 μ M
內引物
SA-FIP40umol
SA-BIP40umol
外引物
SA-F35umol
SA-B35umol
標本核酸20ng
添加焦碳酸二乙酯處理水至總量達到25ul。選取結核菌群(MTB)的基因(基因序列來源美國國立生物技術信息中心-NCBI)中高度保守的l_1407bp段，設計引物序列。所述外引物Tr_F3的序列為GAGCGGGGTGATGTCAAC,所述外引物 Tr_B3 的序列為 GTGACGAACAGTGGAGCC，所述內引物Tr-FIP的序列為
CAACGACATCGACCCGGAGAAGCAGTGGGTGGCCTGGA，所述內引物 Tr-BIP 的序列為 TCTCTGACCCTCGTTTCGACGAGCGTACGTCATGTCCTTGT。進一步的，所述反應液中加入熒光顯示物質溴化乙錠、鈣黃綠素進行實時檢查。步驟2)將上述反應液放入63°C烘箱進行反應30-60min，渾濁為陽性；步驟3)使用臨床分尚結核菌菌株103株核酸，以及臨床分尚非結核分枝桿菌67株以及若干臨床分離頭皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草綠色鏈球菌、大腸桿菌、克雷伯菌的核酸，多次進行反應，觀察它們的陰陽性。結果顯示:結核菌核酸均呈現陽性反應，其余標本為陰性。以上所述僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明，對于本領域的技術人員來說，本發明可以有各種更改和變化。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等， 均應包含在本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種高特異高敏感檢測結核菌群的方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟I)制備反應液 反應液組成及含量為 8u/ul Bst核酸聚合酶8u IOX耐熱聚合酶反應緩沖液lX，MgS04 2mM4M甜菜堿IM IOmM d-NTP 混合液400 μ M 內引物 Tr-FIP40umol Tr-BIP40umol 外引物Tr_F35umol Tr_B35umol標本核酸20ng 添加焦碳酸二乙酯處理水至總量達到25ul ； 步驟2)將上述反應液放入63°C烘箱進行反應30-60min，渾濁為陽性； 步驟3)使用臨床分離結核菌菌株核酸，以及臨床分離非結核分枝桿菌以及若干臨床分離頭皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草綠色鏈球菌、大腸桿菌、克雷伯菌的核酸，多次進行反應，觀察它們的陰陽性。
2.根據權利要求1所述的高特異高敏感檢測結核菌群的方法，其特征在于:所述外引物 Tr-F3 的序列為 GAGCGGGGTGATGTCAAC。
3.根據權利要求2所述的高特異高敏感檢測結核菌群的方法，其特征在于:所述外引物 Tr-B3 的序列為 GTGACGAACAGTGGAGCC。
4.根據權利要求3所述的高特異高敏感檢測結核菌群的方法，其特征在于:所述內引物Tr-FIP的序列為CAACGACATCGACCCGGAGAAGCAGTGGGTGGCCTGGA。
5.根據權利要求4所述的高特異高敏感檢測結核菌群的方法，其特征在于:所述內引物 Tr-BIP 的序列為 TCTCTGACCCTCGTTTCGACGAGCGTACGTCATGTCCTTGT。
6.根據權利要求5所述的高特異高敏感檢測結核菌群的方法，其特征在于:所述反應液中加入熒光顯示物質溴化乙錠、鈣黃綠素進行實時檢查。
全文摘要
本發明公開了一種高特異高敏感檢測結核菌群的方法，包括以下步驟步驟1)制備反應液；步驟2)將上述反應液放入63℃烘箱進行反應30-60min，渾濁為陽性；步驟3)使用臨床分離結核菌菌株核酸，以及臨床分離非結核分枝桿菌以及若干臨床分離頭皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草綠色鏈球菌、大腸桿菌、克雷伯菌的核酸，多次進行反應，觀察它們的陰陽性。本發明通過配制反應液，設計引物序列，能快速、準確的檢測結核菌群，并及時采取相應的措施，減少了疾病的發生率。
文檔編號C12Q1/04GK103205492SQ20131008056
公開日2013年7月17日 申請日期2013年3月14日 優先權日2013年3月14日
發明者吳妹英, 孫頤, 金京勛, 沈永林, 賈宇玲, 趙靜, 酈芳華 申請人:蘇州市第五人民醫院