專利名稱：一種基于整合生物標志物法的海洋溢油污染的貝類監測方法
一種基于整合生物標志物法的海洋溢油污染的貝類監測方法技術領域
本發明屬于生物監測環境技術領域，具體涉及一種海洋溢油污染的貝類監測方法。
背景技術：
21世紀是“海洋的世紀”。如何有效地保護海洋環境，維護近海海域生態平衡己成為各國制定本國可持續發展戰略的重要組成部分。引起海洋污染的途徑很多，其中海洋溢油被認為是最嚴重、最廣泛的海洋污染類型之一，已引起當前世界各國的普遍關注。近年來，世界各地油田漏油、油船泄露等重大溢油事故頻發，如2010年墨西哥灣溢油事件，2011年渤海的“蓬萊19-3”溢油事件等。我國海洋環境質量監測表明，石油類是我國海洋環境中三種主要超標污染物中唯一的有機污染物；部份站位沉積物中的石油類含量劣于第三類海洋沉積物質量標準；受石油烴等的影響，12%監測站位的生物質量劣于第三類海洋生物質量標準。石油污染不僅會影響海洋生物的生長、發育和繁殖，而且會通過食物鏈進入人體對人類健康造成潛在威脅。嚴重的溢油事故會對局部海域的生態系統造成毀滅性破壞。因此，加強海洋溢油污染的有效監測體系的建設，深入研究石油污染的生物累積效應及毒性影響，對于保護海洋漁業資源的健康和可持續發展具有重要的意義。
目前，對海洋溢油污染進行監測，主要采用物理化學分析的方法。但是低劑量的石油污染化學方法常常無法檢出，并且理化監測只能代表取樣期間的石油污染情況，而生物監測更加敏感，可以將長期的污染狀況反映出來。石油烴污染進入水生生物體內后經過生物轉化，在氧化還原循環中產生大量活性氧自由基(ROS)，這些ROS具有很高的活性，可攻擊各種生物大分子，造成酶失活、蛋白質變性、脂質過氧化、DNA損傷等氧化損傷。而抗氧化酶在ROS的產生和消除過程中起著重要的作用，而且對于這些可能產生ROS的污染物的暴露，既可由于適應性反應而被誘導，也可由于中毒反應而受到抑制。因此抗氧化系統可以作為監測海洋溢油污染的生物標志物。
超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase, S0D)、過氧化氫酶(Catalase,CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione pe`roxidase, GSH-Px)、谷胱甘肽轉硫酶(Glutathiones-transferase, GST)和過氧化物酶(Peroxidase, POD)是生物體重要的抗氧化酶，能夠控制機體代謝的活性氧，在防御過氧化損害方面起到重要作用，能較全面地反映機體受氧化脅迫和生物的應激響應程度。這些抗氧化酶活性在石油污染條件下，既有抑制，又有誘導，而且各種酶在生物毒性暴露響應的不同步性，表明不同的酶對污染物刺激的敏感程度有所差異，若將各種酶活性用于海洋環境監測還不能很好地定量評價污染狀況，我們發現應該將這幾種酶結合起來分析，才能較準確客觀的評估海洋環境的污染狀況。因此，建立一種方法將一系列不同量綱的生物標志物進行整合，反映污染的綜合效應，以此來比較不同污染狀況間的差異。
Beliaeff 和Burgeot(Beliaeff B,Burgeot T.1ntegrated biomarker response:A useful tool for ecological risk assessment.Environmental Toxicology andChemistry,2002,21 (6):1316-1322)將所測定的所有生物標志物整合為統一的參數——整合生物標志物響應指數(IBR)。IBR的大小能夠直接指示一定暴露狀況下多個生物標志物的綜合響應。該方法最近已經開始用于河流海域生物效應評價。但是基于IBR法進行海洋溢油污染評價的貝類生物監測方法尚未見報道。海洋雙殼貝類，棲息在在沿海或河口地區，移動能力差，活動范圍小，容易暴露于各種海洋污染物中，并且由于其獨特的濾食習性，對污染物的富集能力更強和敏感性更高，在世界范圍內被廣泛用作海洋和河口污染的指示生物。所以，合適指示生物的選擇和先進監測方法的建立是本發明的關鍵所在。

發明內容
本發明的 目的是在于克服已有技術使用化學分析方法對海洋溢油污染進行檢測時精確度不高，尤其是低劑量長期石油污染常常無法檢出，不能真實全面的反映海洋溢油對海洋環境的污染狀況，同時單一生物分子指標與石油污染的劑量-效應關系不理想等問題，從而提供一種先進全面準確的海洋溢油污染的生物監測方法，使用我國典型雙殼貝類如菲律賓蛤仔、櫛孔扇貝，測定貝類內臟團抗氧化酶活性，并將這些酶活進行整合形成整合生物標志物響應指數(IBR)，建立IBR與石油濃度之間的劑量-效應關系，采用一維方差分析法(ANOVA)進行顯著差異性分析，確定石油污染對生物的脅迫程度，最終判定海洋溢油的污染水平。本發明的目的是由如下技術方案實現的:一種用于判斷海洋溢油污染水平的貝類監測方法，其特征在于包括如下步驟:(I)貝類生物培養:受試生物貝類實驗前洗刷干凈，取回后置實驗室內水族箱中暫養5 7d備用；(2)石油烴暴露實驗:配置一定濃度梯度的石油烴試驗液，采用半靜水接觸染毒法，將暫養過的貝類分成7組，其中I組為對照組，另外6組為試驗組，同時每組設定3個平行組，分別放入玻璃缸中，在整個實驗過程中持續充氣，每隔24h換相同濃度的新鮮試驗液，于第15d取樣；(3)抗氧化酶活性的測定:將貝類活體解剖，取出內臟團，于液氮中研磨后稱重，經滅菌生理鹽水潤洗，用濾紙吸干表面水分，迅速稱取適量加入組織塊重9倍體積的生理鹽水中，冰浴勻漿后于4°C條件下3000r/min離心lOmin，然后取上清用生理鹽水配成體積比10%組織勻漿，直接用于超氧化物歧化酶、谷胱甘肽轉硫酶和過氧化物酶活性的測定，然后分別稀釋成體積比5%組織勻漿用于谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶活性的測定；1%組織勻漿用于蛋白含量的測定；(4)整合生物標志物響應與石油烴濃度的劑量-效應關系:將超氧化物歧化酶、谷胱甘肽轉硫酶、過氧化物酶、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶活性進行整合，形成整合生物標志物響應指數IBR:計算每個試驗水平生物標志物3次重復樣的平均值X ；數據標準化:X標準化得到Y, Y = (X-m) /s,其中m和s是計算每一個生物標志物所有試驗水平的總體平均值和標準偏差；
當生物標志物的響應為受活化時，Z = Y ;當生物標志物的響應為受抑制時，Z=-Y；對于每一個生物標志物所有試驗水平的Z值最小值為Min，將其絕對值與Z相加得到得分S，S = Z+|Min|，S彡O;利用星狀圖表示生物標志物的結果，星狀圖的每個半徑坐標對應每次試驗水平的一個生物標志物的得分S ;以Si和Si+Ι代表星狀圖中順時針方向上的兩個連續得分，η為半徑的數目，也就是測定的生物標志物的個數;Ai為第i個和
第i+Ι個半徑相連形成的面積，可通過下式計算:
權利要求
1.一種用于判斷海洋溢油污染水平的貝類監測方法，其特征在于包括如下步驟: (1)貝類生物培養:受試生物貝類實驗前洗刷干凈，取回后置實驗室內水族箱中暫養5 7d備用； (2)石油烴暴露實驗:配置一定濃度梯度的石油烴試驗液，采用半靜水接觸染毒法，將暫養過的貝類分成7組，其中I組為對照組，另外6組為試驗組，同時每組設定3個平行組，分別放入玻璃缸中，在整個實驗過程中持續充氣，每隔24h換相同濃度的新鮮試驗液，于第15d取樣； (3)抗氧化酶活性的測定:將貝類活體解剖，取出內臟團，于液氮中研磨后稱重，經滅菌生理鹽水潤洗，用濾紙吸干表面水分，迅速稱取適量加入組織塊重9倍體積的生理鹽水中，冰浴勻漿后于4°C條件下3000r/min離心lOmin，然后取上清用生理鹽水配成體積比10%組織勻漿，直接用于超氧化物歧化酶、谷胱甘肽轉硫酶和過氧化物酶活性的測定，然后分別稀釋成體積比5%組織勻漿用于谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶活性的測定；1%組織勻漿用于蛋白含量的測定； (4)整合生物標志物響應與石油烴濃度的劑量-效應關系:將超氧化物歧化酶、谷胱甘肽轉硫酶、過氧化物酶、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶活性進行整合，形成整合生物標志物響應指數IBR: 計算每個試驗水平生物標志物3次重復樣的平均值X ； 數據標準化:X標準化得到Y, Y = (X_m)/s,其中m和s是計算每一個生物標志物所有試驗水平的總體平均值和標準偏差；當生物標志物的響應為受活化時，Z = Y ;當生物標志物的響應為受抑制時，Z = -Y5對于每一個生物標志物所有試驗水平的Z值最小值為Min，將其絕對值與Z相加得到得分S，S = Z+|Min|，S彡O;利用星狀圖表示生物標志物的結果，星狀圖的每個半徑坐標對應每次試驗水平的一個生物標志物的得分S ;以Si和Si+Ι代表星狀圖中順時針方向上的兩個連續得分，η為半徑的數目，也就是測定的生物標志物的個數;Ai為第i個和第i+Ι個半徑相連形成的面積，可通過下式計算:A =Cos^ + Si+1 sinβ);其中 ^ S sina 、β = Arctan -~~一 , α =2π/η, Sn+1 = S1 ;總面積即為整合生物標志物響應(IBR)， ~Λ +1 COS^JIBR = YjAi ’.i=l 繪制IBR與石油烴含量的劑量-效應關系，結果呈現出顯著的線性關系； (5)海洋溢油污染貝類監測評價:海洋溢油事故發生后，根據溢油擴散的范圍設置一定數量的站位SI，S2，....St,同時在清潔海域設定對照站位S0，將已經暫養馴化的貝類轉移至溢油海域的站位SI，S2，....St和對照站位S0，放置15d后取出，迅速測定溢油海域站位SI，S2，....St和對照站位SO貝類生物體超氧化物歧化酶、谷胱甘肽轉硫酶、過氧化物酶、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶活性，并將這些抗氧化酶整合形成IBR，進行方差分析，并用均值多重比較分析法分析對照組SO與溢油站位SI，S2，....St貝類IBR的差異顯著性，當P > 0.05為差異不顯著，表明溢油污染對貝類沒有產生明顯脅迫，基本沒有石油污染；當P < 0.05為差異顯著，表明溢油污染對貝類中度脅迫，石油污染程度較重；當P<0.0l為差異極顯著，表明溢油污染對貝類重度脅迫，石油污染程度嚴重。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟(I)實驗用水為沿海自然海水，經砂濾處理，鹽度為29.08±0.18，pH為7.85±0.03，溫度為21.05±0.43°C，暫養期間連續充氣，每24h換水一次；投喂小球藻2次/日。
3.如權利要求1或2任一所述的方法，其特征在于步驟(3)中谷胱甘肽過氧化物酶活性定義每毫克蛋白質每分鐘扣除非酶反應的作用，使反應體系中谷胱甘肽濃度降低Iμ mol/L為一個酶活性單位；谷胱甘肽轉硫酶活性定義每毫克組織蛋白在37°C反應I分鐘扣除非酶促反應，使反應體系中谷胱甘肽濃度降低I μ mol/L為一個酶活性單位；超氧化物歧化酶活性定義每毫克組織蛋白在ImL反應液中超氧化物歧化酶抑制率達50%時所對應的超氧化物歧化酶量為一個酶活性單位；過氧化氫酶活性定義每毫克組織蛋白每秒鐘分解Ipmol的H2O2的量為一個酶活性單位；過氧化物酶活性定義37°C條件下每毫克組織蛋白每分鐘催化產生I μ g的底 物的酶量為一個酶活性單位。
全文摘要
本發明屬于生物監測環境技術領域，具體涉及一種海洋溢油污染的貝類監測方法，使用我國典型雙殼貝類如菲律賓蛤仔、櫛孔扇貝，測定貝類內臟團抗氧化酶活性，包括超氧化物歧化酶、谷胱甘肽轉硫酶、過氧化物酶、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶活性等，并將這些酶活進行整合形成整合生物標志物響應指數(IBR)，建立IBR與石油濃度之間的劑量-效應關系，采用一維方差分析法(ANOVA)進行顯著差異性分析，確定石油污染對生物的脅迫程度，最終判定海洋溢油的污染水平。
文檔編號C12Q1/30GK103146805SQ20131008917
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月7日 優先權日2013年3月7日
發明者夏斌, 陳碧鵑, 辛福言, 孫雪梅, 崔毅 申請人:中國水產科學研究院黃海水產研究所