一株高產葡萄糖-6-乙酸酯的菌種及合成葡萄糖-6-乙酸酯的方法
【專利摘要】本發明公開了一株高產葡萄糖-6-乙酸酯的菌種及合成葡萄糖-6-乙酸酯的方法。一種芽孢桿菌(Bacillus?sp.)GXU-011，保藏號為:CGMCC?No.7031，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2012年12月24日，保藏地址：中國科學院北京微生物研究所。以碳源、氮源、無機鹽等有機營養素加以培養，得到反應液葡萄糖-6-乙酸酯；再經分離純化后得到葡萄糖-6-乙酸酯。本發明所取得的技術進步在于：本發明與現有菌株ATCC10778相比，具有發酵時間短，工藝步驟簡單，產量高，傳代穩定性高的優點。
【專利說明】—株高產葡萄糖-6-こ酸酯的菌種及合成葡萄糖-6-こ酸酯的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生化工程領域，具體是ー株高產葡萄糖-6-こ酸酯的菌種及合成葡萄糖-6-こ酸酯的方法。
【背景技術】
[0002]本發明涉及利用生物發酵制備用于生產三氯蔗糖的關鍵中間體葡萄糖-6-こ酸酷。匍萄糖_6_こ酸酯是生廣4，I’，6’ - ニ氯-4，I’ ,6，- ニ脫氧半乳鹿糖即ニ氯鹿糖的關鍵中間體。三氯蔗糖是蔗糖的氯衍生物，其甜度是蔗糖的600-800倍，其ロ感醇和、濃郁、穩定性能好、熱量低，它可以和傳統的甜味劑配合使用，也可以單獨使用，其甜味ロ感不受影響，有利于消費者健康。葡萄糖-6-こ酸酯是合成三氯蔗糖的關鍵中間體。目前常用的葡萄糖-6-こ酸酯的生產方法是使用微生物發酵方法所得，所用菌種為ATCC10778，但該菌種產量不高、發酵時間長且傳代穩定性差，不適于大規模エ業化生產。

【發明內容】

[0003]發明人為克服現有技術存在的發酵時間長達120h，最大產量僅為15g/L，且傳代6代后產量降為4.8g/L等缺點，進行了廣泛的研究。提供一株芽孢桿菌(Bacillussp.GXU-011)新菌種，該菌具有發酵時間短，產量高，傳代穩定性高的優點。使用該菌作為發酵菌種發酵葡萄糖-6-こ酸酷，發酵時間僅為72h，最大產量達到31.71g/L，且傳代穩定性高，分離純化后純度達92%以上，更適合于エ業生產。
[0004]本發明解決上述技術問題的技術方案是:
[0005]1.一株芽孢桿菌(Bac`illus sp.)GXU_011，保藏號為:CGMCC N0.7031，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2012年12月24日，保藏地址:中國科學院北京微生物研究所。
[0006]2.芽孢桿菌GXU-Oll菌落特征和生理生化特征為:細胞形態為直桿狀，無孢子形成，革蘭氏染色為陽性；平板培養基中30°C培養36h，菌落直徑為2-3mm，菌落為圓形，凸起，邊緣整齊，淡黃色，表面光滑。通過電鏡掃描如圖1所示，可以看出菌株Bacillussp.GXU-011無鞭毛，染色后未顯示有莢膜存在。有接觸酶反應；V-P實驗陰性；能夠利用葡萄糖產酸，不能利用阿拉伯糖、木糖、甘露醇產酸；明膠液化:緩慢；能夠水解淀粉；能夠利用檸檬酸鹽；能夠還原硝酸鹽；不能利用丙ニ酸；最適生長溫度為20-30°C。
[0007]3.芽孢桿菌GXU-Oll序列測定與系統發育樹分析:
[0008]根據已知的16S rDNA上保守序列設計寡核苷酸引物:
[0009]Fff:5 ; -CAGAGTTTGATCCTGGCT-3 ; , RV:5 ; -AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3 ;以GXU-Oll細菌基因組DNA為模板，使用引物進行PCR擴增16S rDNA序列基因，16S rDNA的擴增反應程序:PCR反應程序設定為:先95°C預變性5min ;然后94°C變性30s，50°C退火lmin，72°C延伸2min，循環30個周期；然后72°C延伸IOmin ;最后4°C保持lOmin。[0010]擴增結束后瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，結果正確則使用PCR產物純化試劑盒純化基因片段，再將其連入PMD18-T載體上，PCR驗證后送出測序，所得到的測序結果與Genbank數據庫中的序列進行比對，從而初歩鑒定菌株種屬。利用BLAST將所測得序列與GenBank數據庫中的16SrDNA基因序列進行同源性比較分析，選取1400bp左右的長度進行比對[ClustelxQ.81)]，釆用鄰位連接(Neighbour Joining, NJ)法進行系統學分析(MEGA)，確定了菌株GXU-Oll與其它幾株Bacillus sp.菌株的系統發育樹，如圖2所不，結果顯不菌種GXU-011的16S rDNA基因序列與GenBank中許多芽抱桿菌(Bacillussp.)的16S rDNA基因序列的同源性在99%以上，所以將菌種GXU-Oll命名為芽孢桿菌GXU-011(Bacillus sp.) ?
[0011]4.芽孢桿菌GXU-011，其特征在于所述的芽孢桿菌GXU-Oll的16Sri)NA序列為:
【權利要求】
1.一株芽孢桿菌(Bacillus sp.)GXU-OlI，保藏號為:CGMCC N0.7031，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2012年12月24日，保藏地址:中國科學院北京微生物研究所。
2.如權利要求1的芽孢桿菌GXU-011，其特征在于，所述的芽胞桿菌GXU-Oll菌落特征和生理生化特征為:細胞形態為直桿狀，無孢子形成，革蘭氏染色為陽性；平板培養基中30°C培養36h，菌落直徑為2-3mm，菌落為圓形，凸起，邊緣整齊，淡黃色，表面光滑。有接觸酶反應；V_P實驗陰性；能夠利用葡萄糖產酸，不能利用阿拉伯糖、木糖、甘露醇產酸；明膠液化:緩慢；能夠水解淀粉；能夠利用檸檬酸鹽；能夠還原硝酸鹽；不能利用丙ニ酸；最適生長溫度為20-30°C。
3.如權利要求1所述的芽孢桿菌(Bacillussp.) GXU-011,其特征在于，所述的芽孢桿菌GXU-Oll序列測定與系統發育樹分析: 根據已知的16S rDNA上保守序列設計寡核苷酸引物:FW:5 ; -CAGAGTTTGATCCTGGCT-3 ; ,RV:5 ; -AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3 ;以 GXU-011 細菌基因組DNA為模板，使用引物進行PCR擴增16S rDNA序列基因，16S rDNA的擴增反應程序:PCR反應程序設定為:先95°C預變性5min ;然后94°C變性30s，50°C退火lmin，72°C延伸2min，循環30個周期；然后72 °C延伸IOmin ;最后4°C保持IOmin ； 擴增結束后瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，結果正確則使用PCR產物純化試劑盒純化基因片段，再將其連入PMD18-T載體上，PCR驗證后送出測序，所得到的測序結果與Genbank數據庫中的序列進行比對，從而初歩鑒定菌株種屬。利用BLAST將所測得序列與GenBank數據庫中的16SrDNA基因序列進行同源性比較分析，選取1400bp左右的長度進行比對[ClustelxQ.81)],采用鄰位連接(Neighbour Joining, NJ)法進行系統學分析(MEGA)，確定了菌株GXU-Oll與其它幾株Bacillus sp.菌株的系統發育樹，結果顯示菌種GXU-Oll的16S rDNA基因序列與GenBank中許多芽孢桿菌(BaciIIus sp.)的16SrDNA基因序列的同源性在99 %以上，所以將菌種GXU-011命名為芽孢桿菌GXU-011 (Baci I Ius sp.)。
4.如權利要求1所述的芽孢桿菌(Bacillussp.) GXU-011,其特征在于所述的芽胞桿菌GXU-Oll的16SrDNA序列為:
5.如權利要求1的芽孢桿菌GXU-011的培養方法，其特征在于:用權利要求1所述的芽孢桿菌GXU-Oll生產葡萄糖-6-こ酸酷，生產步驟如下: 1)將芽孢桿菌(Bacillussp.)菌株GXU-011菌種接種到試管中的斜面培養基制成斜面菌種；エ藝條件為PH6.5~7.5、溫度25~35°C、培養時間24~36小時； 2)將斜面菌株擴大培養作為種子液，所述種子液由以下重量份組分組成:葡萄糖20~60份、酵母粉I~4份、氯化鉀0.5~2份、碳酸鈣0.5~2份、磷酸氫二鉀2~6份、磷酸二氫鉀2~6份、硫酸鎂2~6份和水1000份； 3)將種子液接入發酵罐中進行發酵: 所述發酵液由以下重量份組分組成:葡萄糖20~60份、酵母粉I~4份、氯化鉀0.5~2份、碳酸鈣0.5~2份、磷酸氫二鉀2~6份、磷酸二氫鉀2~6份、硫酸鎂2~6份和水1000 份； 發酵的エ藝條件為發酵液接種量為5%~10%，pH值為6.5~7.5，培養溫度25~35°C，攪拌速率為150~200轉/分鐘，發酵時間為48~72小時，得到葡萄糖_6_こ酸酯反應液； 4)將葡萄糖-6-こ酸酯的分離純化，包括以下2個步驟: (I)將步驟3)葡萄糖-6-こ酸酯反應液經過硅膠柱進行分離純化，所述硅膠柱為硅膠G柱；(2)把經過步驟(I)的發酵液真空干燥，真空干燥度為0.1Mpa，溫度為65°C，即得淡黃色粉末純度為92%的葡萄 糖-6-こ酸酷。
【文檔編號】C12P19/02GK103451125SQ201310274299
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年7月2日 優先權日:2013年7月2日
【發明者】李群良, 張欣, 鄧子明 申請人:廣西大學