一種利用甘草次酸發(fā)酵廢液制備葡萄糖醛酸內(nèi)酯的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種利用甘草次酸發(fā)酵廢液制備葡萄糖醛酸內(nèi)酯的方法：將含高活性β-葡萄糖醛酸苷酶的菌種培養(yǎng)物，接種到含有甘草酸鹽的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，獲得甘草次酸沉淀的同時，發(fā)酵液中的葡萄糖醛酸用離子交換樹脂回收，再內(nèi)酯化制備得到葡萄糖醛酸內(nèi)酯。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：(1)實現(xiàn)了發(fā)酵甘草酸的綜合利用，在得到甘草次酸的同時，得到副產(chǎn)物葡萄糖醛酸內(nèi)酯；(2)該制備葡萄糖醛酸內(nèi)酯的工藝，能耗低，不適用污染環(huán)境的強氧化劑；(3)工藝步驟簡單，沒有副產(chǎn)物，省去脫色的工藝，產(chǎn)品質(zhì)量好。
【專利說明】一種利用甘草次酸發(fā)酵廢液制備葡萄糖醛酸內(nèi)酯的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用甘草次酸發(fā)酵廢液制備葡萄糖醛酸內(nèi)酯的方法，屬于醫(yī)藥化工領(lǐng)域范疇。

【背景技術(shù)】
[0002]葡萄糖醛酸內(nèi)酯，簡稱葡醛內(nèi)酯，制劑名為肝泰樂(俗稱肝通)，其化學(xué)成分為:D_(+)_呋喃葡萄糖醛酸Y-內(nèi)酯[3]，分子式為C6H806。其作用機理是在體內(nèi)酶的作用下變?yōu)槠咸烟侨┧幔云咸烟侨┧猁}或配合物的形式存在的葡萄糖醛酸能與含有羥基、羧基、巰基等有毒物質(zhì)結(jié)合，形成無毒或低毒的葡糖醛酸結(jié)合物而由尿排出，起到保護肝臟及解毒作用，因此可作為一種肝臟解毒劑和免疫功能調(diào)節(jié)劑，是常規(guī)的保肝護肝良藥。除在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用外，葡醛內(nèi)酯及其后續(xù)產(chǎn)品還是功能性飲料和食品、減肥藥、化妝品等的主要添加齊U，具有補充體能、改善缺氧、滋養(yǎng)肌膚、延緩衰老的功效，其市場需求量已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過在醫(yī)藥領(lǐng)域的需求。
[0003]現(xiàn)行工業(yè)生產(chǎn)方法主要是以淀粉、海藻糖或者葡萄糖為原料，化學(xué)氧化法氧化為葡萄糖醛酸，再經(jīng)過內(nèi)酯化獲得葡萄糖醛酸內(nèi)酯。以目前普遍采用的硝酸氧化淀粉制備葡醛酸及其內(nèi)酯的生產(chǎn)工藝為例，其生產(chǎn)流程為淀粉經(jīng)硝酸氧化、加壓水解，在酸性條件下將葡醛酸水溶液內(nèi)酯化。酯化液經(jīng)結(jié)晶脫水即得粗品，然后再經(jīng)溶解、脫色、過濾、結(jié)晶，烘干后得到葡醛內(nèi)酯成品。該工藝反應(yīng)體系比較復(fù)雜，氧化選擇性差，副反應(yīng)多、氧化程度無法有效控制，產(chǎn)物分離困難，產(chǎn)品收率10%左右，但試劑和能耗成本高，生產(chǎn)一噸葡萄糖醛酸，就需要20噸濃硝酸，環(huán)境污染嚴(yán)重。
[0004]近幾年來，人們研究在糖類化合物的催化氧化技術(shù)中，通過負(fù)載貴金屬鉬催化劑對其伯羥基進行催化氧化具有較高的活性和選擇性，但使用鉬成本昂貴，又需要添加鈀等重金屬助劑，這些改進都無法從根本上解決葡萄糖醛酸內(nèi)酯制備中存在的不足，也無法真正解決生產(chǎn)過程中由于無機氧化劑的使用和重金屬作為催化劑所造成的對環(huán)境的嚴(yán)重污染。隨著對葡萄糖醛酸內(nèi)酯市場需求的不斷擴大，必然進一步加劇環(huán)境污染。我們提供一種清潔環(huán)保的獲得葡萄糖醛酸內(nèi)酯的方法，該方法是利用甘草次酸發(fā)酵廢液制備葡萄糖醛酸內(nèi)酯，其原理是甘草酸含有兩個葡萄糖醛酸基，占分子量的48%。利用微生物β-葡萄糖醛酸苷酶水解，去掉甘草酸的兩個葡萄糖醛酸基，沉淀生成甘草次酸，剩余發(fā)酵液中含有大量葡萄糖醛酸，通過回收發(fā)酵廢液中的葡萄糖醛酸，再內(nèi)酯化獲得葡萄糖醛酸內(nèi)酯。制備過程無需強酸強堿，酶催化反應(yīng)調(diào)節(jié)溫和，純化工藝簡單，成本低，而且沒有環(huán)境污染。此制備方法制備得到的葡萄糖醛酸內(nèi)酯，不會產(chǎn)生環(huán)境污染，而且實現(xiàn)了發(fā)酵制備甘草次酸的綜合利用。總之，利用甘草次酸發(fā)酵廢液制備葡萄糖醛酸內(nèi)酯的方法具有非常現(xiàn)實的意義，該制備方法目前國內(nèi)未見相關(guān)報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是為了提供一種制備葡萄糖醛酸內(nèi)酯的新方法，該方法可以在一定程度上替代傳統(tǒng)制備葡萄糖醛酸內(nèi)酯的工藝，減輕資源消耗和環(huán)境污染，同時與傳統(tǒng)方法相比，工藝簡單，成本更低，而且實現(xiàn)了甘草酸發(fā)酵的綜合利用。
[0006]為實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明以微生物酶催化甘草酸，沉淀甘草次酸后，回收發(fā)酵液中的葡萄糖醛酸，再內(nèi)酯化獲得葡萄糖醛酸內(nèi)酯，包括以下步驟下:
[0007](I)制備含高活性β -葡萄糖醛酸苷酶的菌種培養(yǎng)物:可以是液體種子培養(yǎng)物，也可以是固體斜面培養(yǎng)物:以固體斜面培為例，將含有高活性β葡萄糖醛酸苷酶的菌種接種到PDA斜面培養(yǎng)基，于30°C恒溫培養(yǎng)5天；
[0008](2)發(fā)酵轉(zhuǎn)化:將新鮮菌種培養(yǎng)物接種到含甘草酸底物的發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制溫度25°C?37°C，溶氧量為15% -20%，攪拌轉(zhuǎn)速200?220rpm/min條件下，發(fā)酵4?6天至甘草酸底物轉(zhuǎn)化完全；
[0009](3)過濾去除菌體和甘草次酸沉淀的發(fā)酵液流過預(yù)先處理過的OH型弱堿性陰離子交換樹脂，流速為2?3BV/h交換吸附葡萄糖醛酸；用濃度為0.5?I %的氨水洗脫獲得葡萄糖醛酸。
[0010](4)向洗脫液加入無水乙醇在50°C?60°C減壓濃縮至無可見水蒸餾出，獲得濃縮物；
[0011](5)向濃縮物中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%的冰醋酸和3%的醋酸酐。溫度保持在55°C?60°C進行內(nèi)酯化反應(yīng)2h ;加入無水乙醇，析出葡萄糖醛酸內(nèi)酯粗品；
[0012](6)葡萄糖醛酸內(nèi)酯粗品加入重量比為1: 4的80% (V/V)的乙醇水溶液重結(jié)晶。無水乙醇洗滌結(jié)晶，獲得葡萄糖醛酸內(nèi)酯精品，按中國藥典(05版)方法檢測，含量為99%?102%。
[0013](7)本發(fā)明步驟(I)中微生物菌株可以是野生型的，或者是遺傳性狀改變了的，例如一種重組微生物或微生物的一種突變體。該菌株能表達(dá)高活性的高活性β葡萄糖醛酸苷酶，能水解甘草酸產(chǎn)生一分子甘草次酸和兩分子葡萄糖醛酸，所述微生物選自曲霉屬、糖酵母屬、接合糖酵母屬、畢赤氏酵母屬、克魯維氏酵母屬、假絲酵母屬、漢遜氏酵母屬、德巴利氏酵母屬、毛霉屬、球擬酵母屬、甲基細(xì)菌屬、沙門氏菌屬、芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬和假單胞菌屬的成員；斜面培養(yǎng)基優(yōu)選PDA培養(yǎng)基；
[0014](8)本發(fā)明步驟(I)中發(fā)酵培養(yǎng)基中的甘草酸底物可以是甘草酸銨鹽，甘草酸鉀鹽和甘草酸鈉鹽幾種的一種或多種的混合物，發(fā)酵培養(yǎng)基成分還包括一定濃度的無機鹽和一定濃度的氮源，其他碳源為非必須成分，發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)選為:
[0015]2 ?4%甘草酸單銨鹽，0.1 ?0.5%尿素 3，0.01 ?0.05% KH2PO4,0.01 ?0.025%MgSO4,121°C滅菌15min后冷卻到室溫。
[0016](9)本發(fā)明步驟(3)中過濾后含有菌體和甘草次酸沉淀的濾餅用乙醇提取甘草次酸，稀醇反復(fù)結(jié)晶獲得符合藥典要求的HPLC含量為97%甘草次酸成品。濾液中的葡萄醛酸為綜合利用的副產(chǎn)物。
[0017](10)本發(fā)明步驟(3)弱堿性陰離子交換樹脂包括D301型、D318型、D311型、D941型、D345型，優(yōu)選D301型；
[0018]與現(xiàn)有技術(shù)比，本發(fā)明利用甘草次酸發(fā)酵廢液制備葡萄糖醛酸內(nèi)酯方法的優(yōu)點如下:
[0019]1.葡萄糖醛酸是發(fā)酵制備甘草次酸的副產(chǎn)物，內(nèi)酯化制備葡萄糖醛酸內(nèi)酯實現(xiàn)了發(fā)酵甘草酸的的綜合利用，能耗低，不適用污染環(huán)境的強氧化劑。
[0020]2.該方法的工藝步驟簡單，沒有副產(chǎn)物，省去脫色的工藝，產(chǎn)品質(zhì)量好。

【具體實施方式】
[0021]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進一步描述，但本發(fā)明要求保護保護的范圍絕不局限于下列實施方式。
[0022]實施例一:
[0023]配發(fā)酵培養(yǎng)基:3 %甘草酸單銨鹽，0.2 %尿素，0.025 % KH2PO4,0.01 % MgSO4,121°C滅菌15min后冷卻到室溫；取含有高活性β葡萄糖醛酸苷酶轉(zhuǎn)化菌株的新鮮PDA斜面，用接種勺接種發(fā)酵培養(yǎng)基；制溫度28°C，攪拌5天至底物轉(zhuǎn)化完全；發(fā)酵液過濾去除菌體和甘草次酸沉淀；過濾后的發(fā)酵液流過預(yù)先處理過的OH型D311弱堿性陰離子交換樹脂，流速為2BV/h交換吸附葡萄糖醛酸；用0.5%的氨水洗脫獲得葡萄糖醛酸；向洗脫液加入無水乙醇在50°C?60°C減壓濃縮至無可見水蒸餾出；向濃縮物中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%的冰醋酸和3%的醋酸酐。溫度保持在55°C?60°C進行內(nèi)酯化反應(yīng)2h ;加入無水乙醇，析出葡萄糖醛酸內(nèi)酯，過濾后獲得粗品。葡萄糖醛酸內(nèi)酯粗品加入重量比為1: 4的80% (V/V)的乙醇水溶液重結(jié)晶。無水乙醇洗滌結(jié)晶，獲得葡萄糖醛酸內(nèi)酯精品，含量為99.5%。
[0024]實施例二:
[0025]配發(fā)酵培養(yǎng)基:2%甘草酸單銨鹽，0.2%淀粉，0.4%尿素3，0.05% KH2PO4,0.02%MgS04，121°C滅菌15min后冷卻到室溫；取含有高活性β葡萄糖醛酸苷酶轉(zhuǎn)化菌株的新鮮PDA斜面，用接種勺接種發(fā)酵培養(yǎng)基；制溫度30°C，攪拌4天至底物轉(zhuǎn)化完全；發(fā)酵液過濾去除菌體和甘草次酸沉淀；過濾后的發(fā)酵液流過預(yù)先處理過的OH型D301弱堿性陰離子交換樹脂，流速為2BV/h交換吸附葡萄糖醛酸；用0.8%的氨水洗脫獲得葡萄糖醛酸；向洗脫液加入無水乙醇在50°C?60°C減壓濃縮至無可見水蒸餾出；向濃縮物中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%的冰醋酸和3%的醋酸酐。溫度保持在55°C?60°C進行內(nèi)酯化反應(yīng)2h ;加入無水乙醇，析出葡萄糖醛酸內(nèi)酯，過濾后獲得粗品。葡萄糖醛酸內(nèi)酯粗品加入重量比為1: 4的80% (V/V)的乙醇水溶液重結(jié)晶。無水乙醇洗滌結(jié)晶，獲得葡萄糖醛酸內(nèi)酯精品，含量為101.0%。
[0026]實施例三:
[0027]配發(fā)酵培養(yǎng)基:4%甘草酸單銨鹽，0.4% NaN03，0.05% KH2PO4,0.02% MgSO4,121°C滅菌15min后冷卻到室溫；取含有高活性β葡萄糖醛酸苷酶轉(zhuǎn)化菌株的新鮮PDA斜面，用接種勺接種發(fā)酵培養(yǎng)基；制溫度28°C，攪拌6天至底物轉(zhuǎn)化完全；發(fā)酵液過濾去除菌體和甘草次酸沉淀；過濾后的發(fā)酵液流過預(yù)先處理過的OH型D301弱堿性陰離子交換樹脂，流速為3BV/h交換吸附葡萄糖醛酸；用0.8%的氨水洗脫獲得葡萄糖醛酸；向洗脫液加入無水乙醇在50°C?60°C減壓濃縮至無可見水蒸餾出；向濃縮物中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%的冰醋酸和3%的醋酸酐。溫度保持在55°C?60°C進行內(nèi)酯化反應(yīng)2h ;加入無水乙醇，析出葡萄糖醛酸內(nèi)酯，過濾后獲得粗品。葡萄糖醛酸內(nèi)酯粗品加入重量比為1: 4的80% (V/V)的乙醇水溶液重結(jié)晶。無水乙醇洗滌結(jié)晶，獲得葡萄糖醛酸內(nèi)酯精品，含量為100.5%。
【權(quán)利要求】
1.一種利用甘草次酸發(fā)酵廢液制備葡萄糖醛酸內(nèi)酯的方法，其特征在于所述方法是將含高活性β-葡萄糖醛酸苷酶的菌種培養(yǎng)物，接種到含有甘草酸鹽的發(fā)酵培養(yǎng)基中，進行發(fā)酵獲得葡萄糖醛酸，再內(nèi)酯化制備得到葡萄糖醛酸內(nèi)酯。
2.如權(quán)利要求1所述的一種利用甘草次酸發(fā)酵廢液制備葡萄糖醛酸內(nèi)酯的方法，其特征在于所述的微生物菌株是野生型的，或者是遺傳性狀改變了的，例如一種重組微生物或微生物的一種突變體。該菌株能表達(dá)高活性的葡萄糖醛酸苷酶，在含有甘草酸的發(fā)酵培養(yǎng)基中可以將甘草酸鹽，水解產(chǎn)生甘草次酸沉淀和兩分子葡萄糖醛酸，所述微生物選自曲霉屬、糖酵母屬、接合糖酵母屬、畢赤氏酵母屬、克魯維氏酵母屬、假絲酵母屬、漢遜氏酵母屬、德巴利氏酵母屬、毛霉屬、球擬酵母屬、甲基細(xì)菌屬、沙門氏菌屬、芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬和假單胞菌屬的成員。
3.如權(quán)利要求1所述的一種利用甘草次酸發(fā)酵廢液制備葡萄糖醛酸內(nèi)酯的方法，其特征在于所述的菌種培養(yǎng)物可以是液體種子培養(yǎng)物，也可以是固體斜面培養(yǎng)物。
4.如權(quán)利要求1所述的一種利用甘草次酸發(fā)酵廢液制備葡萄糖醛酸內(nèi)酯的方法，其特征在于以甘草酸鹽為碳源，其他碳源為非必須營養(yǎng)成分。發(fā)酵培養(yǎng)基中的甘草酸鹽可以是甘草酸銨鹽、甘草酸鉀鹽和甘草酸鈉鹽幾種的一種或多種的混合物，發(fā)酵培養(yǎng)基成分還包括一定濃度的無機鹽和一定濃度的氮源。發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)選為:2?4%甘草酸單銨鹽，0.1?0.5%尿素 3,0.01 ?0.05% KH2PO4,0.01 ?0.025% MgSO4,121°C滅菌 15min 后冷卻到室溫。
5.如權(quán)利要求1所述的一種利用甘草次酸發(fā)酵廢液制備葡萄糖醛酸內(nèi)酯的方法，其特征在于所述的發(fā)酵過程需要控制以下參數(shù):溫度25V?37°C，攪拌轉(zhuǎn)速200?220rpm/min，溶氧量為15% -20%，發(fā)酵時間4?6天。
6.如權(quán)利要求1所述的一種利用甘草次酸發(fā)酵廢液制備葡萄糖醛酸內(nèi)酯的方法，其特征在于發(fā)酵結(jié)束后，按照以下步驟進行內(nèi)酯化制備葡萄糖醛酸內(nèi)酯: (1)發(fā)酵液過濾去除菌體和甘草次酸沉淀，流過預(yù)先處理過的OH型弱堿性陰離子交換樹脂，流速為2?3BV/h交換吸附葡萄糖醛酸，所述的弱堿性陰離子交換樹脂包括D301型、D318 型、D311 型、D941 型、D345 型，優(yōu)選 D301 型。 (2)用濃度為0.5?I %的氨水洗脫獲得葡萄糖醛酸洗脫液，向洗脫液加入無水乙醇在50°C?60°C減壓濃縮至無可見水蒸餾出。 (3)向濃縮物中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%的冰醋酸和3%的醋酸酐。溫度保持在55°C?60°C進行內(nèi)酯化反應(yīng)2h ;加入無水乙醇，析出葡萄糖醛酸內(nèi)酯粗品； (4)葡萄糖醛酸內(nèi)酯粗品加入重量比為1: 4的80% (v/v)的乙醇水溶液重結(jié)晶。無水乙醇洗滌結(jié)晶，獲得葡萄糖醛酸內(nèi)酯精品，按中國藥典(05版)方法檢測，含量為99%?102%。
【文檔編號】C12P19/00GK104250271SQ201310274330
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2013年6月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月28日
【發(fā)明者】魏元剛, 楊永安, 湯文建, 朱海亮, 季浩 申請人:江蘇天晟藥業(yè)有限公司