一種基于趨化因子富集效應的微流控芯片裝置及制備方法
【專利摘要】本發明提出一種基于趨化因子富集效應的微流控芯片裝置及制備方法，由PDMS基底層、兩對應的微流控芯片模塊A和模塊B、置于兩微流控芯片模塊之間的半透膜、頂層蓋片和相應進、出樣管道組成。微流控芯片模塊A用于待處理細胞樣本注入及富集分選，模塊A中的樣品池連接2進樣口和2出樣口，實現待處理細胞樣本的注入和富集于半透膜上的組織干細胞的分選；模塊B用于注入趨化因子，借助半透膜在模塊A樣品池靠近半透膜區域形成趨化效應。注入模塊A內部的細胞樣本中的多種組織干細胞將在趨化效應下向半透膜運動，并實現與其它細胞的分離，分離后的干細胞和其它細胞樣本經不同的出樣口收集。
【專利說明】一種基于趨化因子富集效應的微流控芯片裝置及制備方法【技術領域】
[0001]本發明涉及干細胞生物學、細胞移植及藥物篩選【技術領域】，具體涉及用于干細胞富集分選的微流控裝置?！颈尘凹夹g】
[0002]干細胞是一類具有多向分化潛能和自我復制能力的原始的未分化細胞；近十余年的研究已經證實多種組織器官內存在成體組織干細胞，它們具有自我更新和定向分化潛能，是組織更新及損傷后再生修復的種子細胞。干細胞的研究對再生醫學和一些組織器官退行性疾病的防治具有極為重要的意義，是當前生命科學及醫學的熱點之一。對不同組織干細胞進行分離純化培養也成為該領域的基本技術。
[0003]基質細胞衍生趨化因子SDF_1(stromalcell-derived factor-1)與其受體CXCR4(CXC chemokine receptor4)分別屬于CXC類趨化因子和CXCR類G蛋白偶聯受體超家族，它們在進化過程中高度保守。近十余年來的研究表明，SDF-1除了由骨髓基質細胞、內皮細胞等持續產生外，在多種組織的干細胞微環境特別是一些低氧區域內高表達；其趨化作用由受體CXCR4介導，兩者結合后共同啟動靶細胞下游信號通路。
[0004]CXCR4最早是作為愛滋病病毒(HIV)感染攻擊靶細胞的共受體為人類所認識，其后研究發現它在多種組織干細胞如間充質干細胞(MSC)、造血干細胞(HSC)、表皮干細胞及骨骼肌干細胞等也呈現高表達，趨化因子SDF-1與靶細胞CXCR4受體間快速的相互作用正是多種組織干細胞遷移趨化的重要驅動軸。如研究發現在皮膚組織更新、創傷后創面修復中SDF-1對于表皮干細胞具有很強的趨化作用，CXCR4受體在靠近基底層的細胞表達水平最高，通過誘導信號蛋白PKC-ζ的磷酸化，SDF-1影響表皮干細胞肌動蛋白的極化及其定向遷移。使用SDF-1能促進骨髓間充質干細胞向損傷脊髓等組織的遷徙；在離在體缺氧環境下促進血管內皮細胞增殖和血管形成。
[0005]此外近年研究證實，應用CXCR4拮抗劑AMD3100等能顯著增加HSCs自骨髓向外周血的動員(HSC因高表達CXCR4被大量黏附于骨髓微環境)，從而有助于由外周血采集HSC，也進一步支持SDF-1/CXCR4軸在HSCs等遷移趨化中的關鍵作用。
[0006]離體培養條件下的多種組織干細胞常需要進行純化分離，同時一類干細胞自身也存在不同功能表型的異質性群體；已有的一些動物移植實驗如造血干細胞移植等顯示遷移能力越強的干細胞群體，其功能活性及植入后存活越好。因此分選純化特定的組織干細胞成分、特別是具有良好功能狀態的干細胞群體對功能和相關移植實驗等具有重要意義。
[0007]目前對不同組織干細胞的檢測分選主要是使用以流式細胞儀為代表的手段進行，原理是基于干細胞表達的一些特異蛋白標記分子(抗原)，應用對應的熒光標記抗體進行抗原抗體結合，最終檢測分選出表達特異蛋白的特定干細胞成分；此類方法的不足是材料設備相對昂貴且耗時，一種或多種蛋白標記分子反映的僅僅是細胞的表型而非功能狀態，同時由于經過抗原抗體結合，對后續的應用包括培養、移植等造成不確定的影響。
[0008]國內外相關專利如下:[0009]CN200480004361.8,2005年，艾菲克特細胞研究所股份有限公司(日本)，金崎士朗
[0010]CN200580025365.9，2005年，克里夫蘭診所基金會(美國)，馬克.S.佩恩等
[0011]CN200680007351.9，2008年，埃莫里大學(美國)，H.施;DC.利奧塔等
[0012]CN200810229391.9,2008年，中國科學院大連化學物理研究所，秦建華等
[0013]CN201010252513.3,2010年，清華大學博奧生物有限公司，謝蘭等。

【發明內容】

[0014]本發明提供一種基于趨化因子富集效應的離體肝細胞微流控芯片裝置，是一種基于干細胞功能特性(特異性趨化)的組織干細胞富集分選平臺。其通過在芯片上集成合適尺寸的微流控裝置，樣品(細胞)池及相連通道中的干細胞成分能對半透膜分隔的液體池中的特定趨化因子發生趨化遷移作用，從而在一定空間距離實現對混合樣本中特定組織干細胞的有效富集和分離。與經典流式細胞儀抗原抗體結合的分選原理不同，本微流控體系可實現基于干細胞功能即遷移趨化能力的分選。
[0015]本發明的具體技術方案如下:
[0016]一種基于趨化因子富集效應的微流控芯片裝置，它包括:
[0017]—基底層。
[0018]—微流控芯片模塊A,位于基底層之上,微流控芯片模塊A上微加工形成有樣品池、混合細胞樣本進樣通道和進樣口、壓力流控制進樣通道和進樣口、混合細胞樣本出樣通道和出樣口以及造血干細胞出樣通道和出樣口，上述各進樣口和出樣口分別通過各自的進樣或出樣通道與樣品池連通，所述樣品池設計在微流控芯片模塊A的中部靠一邊位置，其靠邊的一側面開敞，通至模塊A邊緣`。
[0019]一微流控芯片模塊B，位于基底層之上，與微流控芯片模塊A并排相對，微流控芯片模塊B微加工形成有趨化因子儲樣池、趨化因子緩沖液進樣通道和進樣口、趨化因子緩沖液出樣通道和出樣口 ；上述各進樣口和出樣口分別通過各自的進樣或出樣通道與趨化因子儲樣池連通，所述趨化因子儲樣池設計在微流控芯片模塊B的中部靠一邊位置，其靠邊的一側面開敞，通至模塊B邊緣；所述微流控芯片模塊A的樣品池與微流控芯片模塊B的趨化因子儲樣池位置正對并相鄰，趨化因子儲樣池的長度小于對應的樣品池的長度。
[0020]一半透膜，被夾于微流控芯片模塊A和B之間，隔開樣品池和趨化因子儲樣池，形成兩池之間的隔膜，半透膜下端與基底層連接并密封。
[0021 ] 一頂層蓋片，蓋于微流控芯片模塊A和B之上，其上開有與模塊A和模塊B上進樣和出樣口對應的進樣和出樣孔，并裝有進樣和出樣管，所述半透膜上端與頂層蓋片連接并密封。
[0022]所述基底層、微流控芯片模塊A和B、頂層蓋片之間的組裝采用對位與鍵合工藝。
[0023]操作中首先在微流控芯片模塊B的趨化因子儲樣池內注入趨化因子SDF-1，然后向細胞樣品池加入填充用無細胞緩沖液，其后再注入待分選混合細胞樣本，為保證干細胞群體在半透膜樣品池一側充分富集，除合適的SDF-1濃度(根據文獻報道為10~50ng/ml)外，采用合適壓力以使單個細胞流經Icm長度儲樣池的時間不短于I分鐘，最終使絕大部分HSC成分緊鄰半透膜趨化富集，并經最下游的出樣通道收集。
[0024]本發明提出的干細胞分選用微流控系統在原理上是基于干細胞的運動趨化特性，不同于傳統流式細胞儀抗原抗體結合的分選原理。設計上，細胞池及流動管道和液體池之間使用合適半透膜分隔，通過應用特定趨化因子可實現對混合細胞樣本中多種組織干細胞成分的趨化吸引及分選，含趨化因子液體可多次重復使用，細胞收集池收集的活性干細胞群體可進一步用于免疫染色驗證、培養及在體移植等研究。因此，本裝置不僅簡易高效，能用于多種混合細胞群體中干細胞的分選，獲取高功能活性的干細胞成分；同時芯片本身可重復使用，結合適當的清潔消毒手段，能滿足培養條件下的無菌要求，可廣泛用于干細胞生物學、細胞移植及藥物篩選等研究領域。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖1是本裝置的外形示意圖；
[0026]圖2是本裝置的結構組裝示意圖；
[0027]圖3是微流控芯片模塊A的結構示意圖；
[0028]圖4是微流控芯片模塊B的結構示意圖。
【具體實施方式】
[0029]以下結合附圖詳細說明本發明的結構:
[0030]參見圖1和圖2，本裝置在構成上，為了便于半透膜4的放置，微流控芯片以PDMS(聚二甲基硅氧烷polydimethylsiloxane)為基底層1，分別由微流控芯片模塊A2和B3兩個模塊構成，模塊A2具有樣品池14、混合細胞樣本進樣通道11和進樣口 10、壓力流控制進樣通道16和進樣口 15、混合細胞樣本出樣通道13和出樣口 12以及造血干細胞出樣通道17和出樣口 18。模塊B3具有趨化因子儲樣池21、趨化因子緩沖液進樣通道20和進樣口 19、趨化因子緩沖液出樣通道22和出樣口 23，主要用于注入趨化因子，在A、B兩模塊微加工完成后進行組裝，在樣品池和趨化因子儲樣池之間置入半透膜4，使用PDMS使其封固鍵合并加頂層蓋片5，基底層和頂層蓋片上均設置有與半透膜長度匹配，寬度為0.2mm的矩形孔，半透膜的下端和上端分別置入其中，并密封固定。以上微流控芯片模塊A和微流控芯片模塊B都采用厚度為2~5mm的PDMS材料，基底層和頂層蓋片為厚度為3~5mm的PDMS材料。
[0031]為了實現混合細胞樣本中造血干細胞的分選，依據HSC在趨化因子作用下的趨化遷移速度(每分鐘數十微米)，與半透膜4相對的趨化因子儲樣池21長度設計在0.5~lcm，樣品池14對應長度更長以保證樣品液體流穩定及干細胞分離，細胞樣本進出通道寬200 μ m,深50 μ m,能滿足機體各種混合細胞群體的注入和流動，并在一定流動時間內(分鐘)實現HSC向半透膜的趨化靠近。
[0032]具體如圖3和圖4所示，微流控芯片模塊A的樣品池14的水平面方向上形狀近似為梯形，長邊長度為I~3cm,短邊長度為0.5~2cm,寬度(長邊至短邊的距離)為2~5mm,該長邊即為通至模塊A邊緣的開敞側面。其進樣口 10、15和出樣口 12、18的直徑為1_，出樣通道13、17和進樣通道11、16的寬度為200 μ m，深度為50 μ m。
[0033]微流控芯片模塊B的趨化因子儲樣池21的水平面方向上形狀也為梯形，長邊長度為0.5~Icm,短邊長度為0.2~0.6cm,寬度(長邊至短邊的距離)為100~300 μ m,所述長邊即為所述通至模塊B邊緣的開敞側面。其進樣口 19和出樣口 23的直徑為400 μ m，出樣通道22和進樣通道20的寬度為100 μ m,深度為50 μ m。
[0034]用于構建形成趨化因子濃度梯度的半透膜4選用截留分子量大于8KD的纖維素透析膜，如采用商品化的再生纖維素膜，這是一種不帶電荷的均質膜，膜孔徑小于I μ m，根據SDF-1的分子量大小(8KD)，選用分子截留量為大于8KD的半透膜(MWC08000，上海源葉生物科技有限公司等)，這樣既能在靠近半透膜的樣品池一側形成趨化因子SDF-1濃度梯度，又能防止其過快流失。
[0035]實施例1:
[0036]參見圖1、圖2，一種基于趨化因子富集效應的微流控芯片裝置由PDMS基底層1、兩左右對應布置的微流控芯片模塊A2和模塊B3、置于兩微流控芯片模塊之間的半透膜4、頂層蓋片5和相應進、出樣管道6組成。
[0037]各功能部件和模塊及組裝過程如下:
[0038]1、將半透膜4下端置入PDMS基底層I的矩形孔7中，并使用PDMS從底部固定半透膜4和封堵半透膜和矩形孔7間的縫隙，避免儲樣池14中的細胞流到另一側儲樣池21，或儲樣池21中趨化因子的快速擴散。
[0039]2、將固定好半透膜4的PDMS基底層I和模塊A2、模塊B3、PDMS頂層蓋片5采用等離子處理待用。
[0040]3、將模塊A2和模塊B3緊臨半透膜4置于PDMS基底層I上，模塊B3的儲樣池正對模塊A2的樣品池的中間，并從兩端擠壓模塊A2和模塊B3，使兩模塊緊密接觸，使半透膜
4、模塊A2、模塊B3以及PDMS基底層 I相互間緊密鍵合，并利用PDMS固定。
[0041]4、將PDMS頂層蓋片5置入模塊A2和模塊B3上，半透膜4上端需通過蓋片5的矩形孔8穿過，并用PDMS固封，避免儲樣池14中的細胞流到另一側儲樣池21，或儲樣池21中趨化因子的快速擴散。同時，PDMS頂層蓋片5上進樣/出樣孔9與模塊A2和模塊B3上進樣/出樣孔15、10、19/12、18、23 —一對應，使各模塊之間緊密鍵合。
[0042]5、將進樣、出樣管道6置入PDMS蓋片5上進樣和出樣孔9中，使用PDMS固封進樣、出樣管道6與進樣和出樣孔9之間縫隙。
[0043]樣品篩選過程如下:
[0044]從進樣口 19中注入趨化因子緩沖液，經進樣通道20進入趨化因子緩沖液儲樣池21，并流動力作用下經出樣通道22和出樣口 23流出，可借助外圍管道形成連續回路。由于半透膜4兩側趨化因子濃度的差異，趨化因子會由高濃度(儲樣池21)—側向低濃度一側(儲樣池14)擴散，進而形成濃度梯度。同時，從進樣口 10中，使用微量泵注入混合細胞懸浮液，從進樣口 15注入緩沖液，；當細胞懸浮液經混合細胞進樣通道11進入混合細胞儲樣池14與經進樣通道15進入的緩沖液混合，由于層流作用的影響，細胞將主要在靠近進樣口10 一側(遠離半透膜4)流動；在趨化因子所形成的濃度梯度的影響下，特定組織干細胞將在趨化效應作用下向半透膜4方向(高趨化因子濃度區域)運動，進而在靠近半透膜4區域形成組織干細胞富集區；富集的細胞在從進樣口 15注入的緩沖液的帶動下，從干細胞出樣通道17流出，并在干細胞出樣口 18收集；混合細胞儲樣池14內其余細胞從出樣通道13流出，在出樣口 12收集，從而達到利用趨化效應分離富集組織干細胞的目的。
【權利要求】
1.一種基于趨化因子富集效應的微流控芯片裝置，其特征在于它包括: 一基底層； 一微流控芯片模塊A，位于基底層之上，微流控芯片模塊A上微加工形成樣品池、混合細胞樣本進樣通道和進樣口、壓力流控制進樣通道和進樣口、混合細胞樣本出樣通道和出樣口以及造血干細胞出樣通道和出樣口，上述各進樣口和出樣口分別通過各自的進樣或出樣通道與樣品池連通，所述樣品池設計在微流控芯片模塊A的中部靠一邊位置，其靠邊的一側面開敞，通至模塊A邊緣； 一微流控芯片模塊B，位于基底層之上，與微流控芯片模塊A并排相對，微流控芯片模塊B微加工形成有趨化因子儲樣池、趨化因子緩沖液進樣通道和進樣口、趨化因子緩沖液出樣通道和出樣口；上述各進樣口和出樣口分別通過各自的進樣或出樣通道與趨化因子儲樣池連通，所述趨化因子儲樣池設計在微流控芯片模塊B的中部靠一邊位置，其靠邊的一側面開敞，通至模塊B邊緣；所述微流控芯片模塊A的樣品池與微流控芯片模塊B的趨化因子儲樣池位置正對并相鄰，趨化因子儲樣池的長度小于對應的樣品池的長度； 一半透膜，被夾于微流控芯片模塊A和B之間，隔開樣品池和趨化因子儲樣池，形成兩池之間的隔膜，半透膜下端與基底層連接并密封； 一頂層蓋片，蓋于微流控芯片模塊A和B之上，其上開有與模塊A和模塊B上進樣和出樣口對應的進樣和出樣孔，并裝有進樣和出樣管，所述半透膜上端與頂層蓋片連接并密封； 所述基底層、微流控芯片模塊A和B、頂層蓋片之間的組裝采用對位與鍵合工藝。
2.根據權利要求1所述的基于趨化因子富集效應的微流控芯片裝置，其特征在于:所述半透膜選用截留分子量大于8KD的纖維素透析膜。
3.根據權利要求1或2所述的基于趨化因子富集效應的微流控芯片裝置，其特征在于:所述微流控芯片模塊A和微流控芯片模塊B都采用厚度為2~5_的PDMS材料。
4.根據權利要求1或2所述的基于趨化因子富集效應的微流控芯片裝置，其特征在于:基底層和頂層蓋片為厚度為3~5mm的PDMS材料。
5.根據權利要求3所述的基于趨化因子富集效應的微流控芯片裝置，其特征在于:所述微流控芯片模塊A的進樣口和出樣口的直徑為1_，出樣和進樣通道的寬度為200 μ m，深度為50 μ m ;微流控芯片模塊B的進樣口和出樣口的直徑為400 μ m,出樣和進樣通道的寬度為100 μ m,深度為50 μ m。
6.根據權利要求3所述的基于趨化因子富集效應的微流控芯片裝置，其特征在于:所述微流控芯片模塊A的樣品池的水平面方向上形狀近似為梯形，長邊長度為I~3cm，短邊長度為0.5~2cm，寬度(長邊至短邊的距離)為2~5mm，所述長邊即為所述通至模塊A邊緣的開敞側面；所述微流控芯片模塊B的趨化因子儲樣池的水平面方向上形狀也為梯形，長邊長度為0.5~Icm,短邊長度為0.2~0.6cm,寬度(長邊至短邊的距離)為100~300 μ m,所述長邊即為所述通至模塊B邊緣的開敞側面。
7.根據權利要求4所述的基于趨化因子富集效應的微流控芯片裝置，其特征在于:所述基底層和頂層蓋片上設置有與半透膜長度匹配，寬度為0.2mm的矩形孔，半透膜的下端和上端分別置入其中，并密封固定。
8.權利要求1-7之任一項所述的微流控芯片裝置的制備方法，其特征在于:裝置的組裝采用對位與鍵合工藝，制備過程如下: A.將半透膜下端置入PDMS基底層的矩形孔中，并使用PDMS從底部固定半透膜和封堵半透膜和矩形孔間的縫隙，避免兩池的緩沖液漏液以及相互間的緩沖液交換； B.將固定好半透膜的PDMS基底層和模塊A、模塊B、PDMS頂層蓋片采用等離子處理待用； C. 將模塊A和模塊B緊臨半透膜放置到PDMS基底上，模塊B的儲樣池正對模塊A的樣品池的中間，從兩端擠壓模塊A和模塊B，使兩模塊緊密接觸，使模塊A、模塊B以及PDMS基層相互間緊密鍵合，并利用PDMS固定； D.將TOMS頂層蓋片放置到模塊A和模塊B上，半透膜上端穿過頂層蓋片的矩形孔，并用PDMS固封，避免兩池的緩沖液漏液以及相互間的緩沖液交換，使PDMS頂層蓋片上進樣和出樣孔與模塊A和模塊B上進樣和出樣孔一一對應，使各模塊之間緊密鍵合； E.將進樣和出樣管道置入PDMS頂層蓋片上進樣和出樣孔中，使用PDMS固封進樣和出樣管道。
【文檔編號】C12M1/00GK103571738SQ201310274879
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年7月2日 優先權日:2013年7月2日
【發明者】楊忠, 劉濤, 張曉麗, 司維柯, 胡寧, 楊軍 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學