一種來源于黑葡萄穗霉的葡糖淀粉酶的制作方法
【專利摘要】本發明的目的是提供一種新型葡糖淀粉酶及其應用。所述葡糖淀粉酶來源于黑葡萄穗霉（Stachybotrys chartarum），本發明通過基因工程手段，將葡糖淀粉酶的基因轉化入黑曲霉（Aspergillus niger）中，從而構建了能高效表達葡糖淀粉酶的黑曲霉工程菌株，以彌補現有技術的不足。本發明首次公開了黑葡萄穗霉的葡糖淀粉酶基因，并通過構建黑曲霉工程菌株，能在體外高效重組表達葡糖淀粉酶，搖瓶發酵酶活高達664U/mL。本發明所述葡糖淀粉酶能從糖鏈的非還原端高效分解α-1,4-糖苷鍵，水解出葡萄糖，可廣泛應用于淀粉糖工業。
【專利說明】一種來源于黑葡萄穗霉的葡糖淀粉酶

【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因工程【技術領域】，具體涉及一種來源于黑葡萄穗霉的葡糖淀粉酶及 其應用。

【背景技術】
[0002] 葡糖淀粉酶（Glucoamylase，EC3. 2. 1. 3)，是水解淀粉的外切作用糖酶。它能把淀 粉從非還原性未端水解a-1. 4葡萄糖苷鍵產生葡萄糖，也能緩慢水解a-1. 6葡萄糖苷鍵， 轉化為葡萄糖。同時也能水解糊精，從糖原的非還原末端釋放P-D-葡萄糖。
[0003] 多種細菌、真菌、酵母和植物都生產葡糖淀粉酶。特別有趣且商業上重要的 葡糖淀粉酶是在細胞外產生的真菌的酶，例如來自下列的菌株：曲霉屬（Aspergillus) (Svenssonetal.,CarlsbergRes.Commun. 48:529-544(1983);Boeletal. ,EMBO J.3:1097-1102(1984);Hayashidaetal.，Agric.Biol.Chem. 53: 923-929(1989);美 國專利號 5,024,941;美國專利號 4,794，175和1088/09795);藍狀菌屬（1&131'〇11^〇68) (美國專利號4, 247, 637;美國專利號6, 255, 084;和美國專利號6, 620, 924);根霉屬 (Rhizopus)(Ashikarietal. ,Agric.Biol.Chem. 50: 957-964 (1986);Ashikari etal.,App.Microbio.Biotech. 32: 129-133 (1989)和美國專利號 4,863,864);腐 質霉屬（Humicola) (W0 05/052148和美國專利號4, 618, 579);以及毛霉屬（Mucor) (Houghton-Larsenetal.，Appl.Microbiol.Biotechnol. 62:210-217(2003)。已在酵 母、真菌和/或細菌細胞中克隆和表達了許多編碼這些酶的基因。
[0004] 到目前為止，尚未有關于黑葡萄穗霉（Stachybotryschartarum)中葡糖淀粉酶基 因的研究報道。本發明對葡萄穗霉進行全基因組分析得到編碼葡糖淀粉酶的基因，并將該 基因在黑曲霉中表達，篩選得到高效表達葡糖淀粉酶的生物工程菌株，從而為高密度發酵 和工業化生產奠定基礎。


【發明內容】

[0005] 本發明的目的是提供一種新型葡糖淀粉酶及其應用。所述葡糖淀粉酶來源于黑葡 萄穗霉（Stachybotryschartarum),本發明通過基因工程手段，將葡糖淀粉酶的基因轉化 入黑曲霉（Aspergillusniger)中，從而構建了能高效表達葡糖淀粉酶的黑曲霉工程菌株， 以彌補現有技術的不足。
[0006] 本發明一個方面提供一種新型的葡糖淀粉酶，其特征在于：
[0007] 1)其氨基酸序列為SEQIDNO: 1的葡糖淀粉酶；
[0008] 2)在1)中的氨基酸上發生取代、缺失或添加一個或數個氨基酸得到的，具有1)中 葡糖淀粉酶活性的酶。
[0009] 本發明另一方面提供了編碼上述葡糖淀粉酶的基因，其一種核苷酸序列為SEQID NO: 2。
[0010] 本發明提供了一種用于表達氨基酸序列為SEQIDNO: 1的葡糖淀粉酶的重組表 達載體，
[0011] 本發明另一方面提供了一種重組工程菌，其攜帶有表達上述葡糖淀粉酶基因的重 組表達載體的宿主細胞。
[0012] 上述表達宿主細胞為黑曲霉。
[0013] 本發明的葡糖淀粉酶及上述的重組工程菌用于制備葡萄糖。
[0014] 本發明首次公開了黑葡萄穗霉的葡糖淀粉酶基因，并通過構建黑曲霉工程菌株， 能在體外高效重組表達葡糖淀粉酶，搖瓶發酵酶活高達664U/mL。本發明所述葡糖淀粉酶能 從糖鏈的非還原端高效分解a-1，4-糖苷鍵，水解出葡萄糖，可廣泛應用于淀粉糖工業。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖1:本發明構建的pGm_Gla573重組表達載體質粒圖譜。
[0016] 圖2:黑曲霉XUJ-1發酵上清液SDS-PAGE電泳分析圖，其中箭頭所指95kD處為重 組表達的葡糖淀粉酶。
[0017] 圖3:重組表達的葡糖淀粉酶相對酶活-溫度曲線圖。
[0018] 圖4:重組表達的葡糖淀粉酶相對酶活-pH曲線圖。

【具體實施方式】
[0019] 本發明用到了遺傳工程和分子生物學領域使用的常規技術和方法，例如 MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL, 3ndEd. (Sambrook, 2001)和CURRENT PROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(Ausubel, 2003)中所記載的方法。這些一般性參考文 獻提供了本領域技術人員已知的定義和方法。但是，這并不意味著將本發明限定于所述的 任何具體方法、實驗方案和試劑，因為它們可以改變。
[0020] 除非在本文中另作限定，本文所用的全部技術術語和科學術語具有本發明所屬領 域的普通計數人員通常所理解的相同含義。DICTIONARYOFMICROBIOLOGYANDMOLECULAR BIOLOGY, 3ndEd.(Singletonetal.，2006)和COLLINSDICTIONARYBIOLOGY(Haleet al.，2003)為技術人員提供了本發明中所使用的許多術語的一般性解釋。
[0021] 除非另作說明，核酸是按5'至3'方向從左至右書寫；氨基酸是按氨基至羧基的 方向從左至右書寫。
[0022] 如本文所用，術語"重組"當被用于指代細胞、核酸、蛋白或載體時，表示該細胞、核 酸、蛋白或載體已通過導入異源核酸或蛋白或者通過改變天然核酸或蛋白而被修飾。因此， 例如，重組細胞是表達在天然（非重組）形式的該細胞中不曾發現的基因，或者表達天然基 因。
[0023] 術語"蛋白質"和"多肽"在本文中可以互換使用。本文使用氨基酸殘基的傳統的 單字母或三字母代碼。
[0024] 如本文所用，術語"基因"指參與生產多肽的DNA片段，包括編碼區之前和之后的 區域，以及各編碼片段（外顯子）之間的插入序列（內含子）。
[0025] 術語"核酸"包括DNA、RNA，單鏈或雙鏈的，以及它們的化學修飾物。
[0026] 術語"核酸"和"多核苷酸"在本文中可以互換使用。
[0027] 術語"載體"指被設計用來將核酸導入一種或多種細胞類型的多核苷酸序列。載 體包括克隆載體、表達載體、穿梭載體、質粒、噬菌粒、序列盒以及類似物。
[0028] 術語"表達載體"表示包含DNA序列的DNA構建物，所述DNA序列被可操縱的連接 于能夠影響該DNA在合適宿主中表達的合適的控制序列。此類控制序列可以包括完成轉錄 的啟動子、可選的控制轉錄的操縱子序列、編碼mRNA上合適的核糖體結合位點的序列、增 強子以及控制轉錄和翻譯的終止的序列。
[0029] 術語"啟動子"表示參與結合RNA聚合酶以啟動基因轉錄的的調控序列。啟動子 可以是誘導型啟動子或組成型啟動子。
[0030] 與另一序列具有某一百分比的序列同一性的多核苷酸或多肽是指，在比較這兩個 序列時所述百分比的堿基或氨基酸殘基是相同的。
[0031] 由于遺傳密碼是簡并的，所以可以使用一種以上的密碼子來編碼特定的氨基酸， 本發明包括編碼特定的氨基酸序列的多核苷酸。
[0032] 術語"宿主菌株"或"宿主細胞"是指表達載體或DNA構建物的合適宿主，所述表 達載體或DNA構建物包含本發明的編碼脂肪酶的多核苷酸。具體而言，宿主菌株優選地是 絲狀真菌細胞。該宿主細胞可以是野生型絲狀真菌宿主細胞或者經遺傳修飾的宿主細胞。 術語"宿主菌株"或"宿主細胞"指由絲狀真菌菌株細胞所產生的細胞核原生質體。
[0033] 在本發明中，宿主細胞為曲霉屬某種（Aspergillussp.)(例如棒曲霉（A. clavatus)、煙曲霉（A.fumigatus)、泡盛曲霉（A.awamori)、黃曲霉（A.flavus)，土 曲霉（A.terreus)和米曲霉（A.oryzae))、青霉屬某種（Penicilliumsp.)(例如產黃 青霉（P.chrysogenum))、新薩托菌屬某種（Neosartoryasp.)(例如費希新薩托菌（N. fischeri))、粘帚霉菌屬某種（Gliocladiumsp.)(例如粉紅粘帚霉（G.roseum))、木霉屬 某種（Trichodermasp.)(例如里氏木霉（T.reesei)、綠色木霉（T.viride)、康寧木霉 (T.koningii)、哈茨木霉（T.harzianum))、腐質霉屬某種（Humicolasp.)(例如特異腐質 霉（H.insolens)和灰腐質霉（H.grisea))、金孢霉屬某種（Chrysosporiumsp.)、鐮刀菌 屬某種（Fusariumsp.)、脈孢霉屬某種（Neurosporasp.)、肉座菌屬某種（Hypocreasp.) 和裸孢殼屬某種（Emericellasp.)的細胞。
[0034] 下面結合具體實施例對本發明進行詳細的描述。
[0035] 實施例1:葡糖淀粉酶基因的克隆
[0036] 使用真菌基因組DNA提取試劑盒（Omega)從黑葡萄穗霉過夜培養物中提取基因組 DNA。
[0037] 以黑葡萄穗霉基因組DNA為擴增模板擴增黑葡萄穗霉中的葡糖淀粉酶基因，其中 所用到的正向引物P573-F序列為（下劃線所示序列為Aflll酶切位點）；
[0038]5' -AACTTAAGATCATGCTGACTTCGAACCTCGT-3，，
[0039] 反向引物P573-R序列為（下劃線所示序列為Xbal酶切位點）：
[0040]5' -TGCTCTAGATTATGCCCTGGACATGAC-3，
[0041] 將該基因用PhusionDNA聚合酶（Thermoscientific)從黑葡萄穗霉基因組DNA 中擴增出來。
[0042] 使用凝膠純化試劑盒（Fermentas)將上述PCR產物純化。用限制性內切酶 Aflll和Xbal(Fermentas)對純化后的PCR產物進行酶切；同時，用限制性內切酶Aflll 和Xbal對質粒pGm進行酶切。使用凝膠純化試劑盒將酶切產物純化，并用T4DNA連 接酶（Fermentas)將上述兩個酶切產物連接。將連接產物轉化進Trans5a大腸桿菌 (Transgen)，用氨節青霉素進行選擇。為確保準確，對若干克隆進行測序（Invitrogen)。測 序結果顯示，黑葡萄穗霉中葡糖淀粉酶的基因序列為SEQIDNO:2，，其編碼的氨基酸序列 為SEQIDNO: 1 ;多個克隆的測序結果都一致。
[0043] 通過NCBI中的BLAST進行蛋白質序列比對發現，本發明的葡糖淀粉酶為一新的等 位基因，與現有的葡糖淀粉酶序列有明顯的區別。
[0044] 使用質粒中量制備試劑盒（Axygen)從測序結果正確的大腸桿菌克隆中純化質 粒。所得1個重組質粒為pGm-Gla573 (見圖1)，
[0045] 實施例2 :PEG介導的原生質體融合轉化黑曲霉及驗證
[0046] 吸取黑曲霉GAP1孢子懸浮液于CMA平板中心（9cm培養皿），待菌落長滿整個培 養皿，切1/4大小的培養基于200mLCMA液體培養基中，在30°C、200rpm的條件培養14~16 h〇
[0047] 用無菌Miracloth濾布收集菌絲體，并用溶液A清洗一次，在無菌條件下將清洗過 的菌絲體轉移到40mL原生質體化溶液，在30°C、200rpm的條件下溫浴1~2h，用顯微鏡觀 察檢測原生質體轉化進展。
[0048] 用無菌Miracloth濾布過濾上述溫浴液體，所得濾液即為原生質體溶液。將原生 質體溶液分裝于兩個50mL無菌的一次性離心管中，并將每管的體積用溶液B定容至45 mL，在4000rpm條件下離心8min以獲得沉淀并棄去上清液。用20mL溶液B再清洗沉淀 兩次。將沉淀重懸浮于10mL溶液B中，并用血球計數板對原生質體計數。將原生質體再 次離心并棄去上清液，根據血球計數板計數結果，加入適量溶液B重懸沉淀，使得原生質體 數目在1X107個/mL左右。
[0049] 在冰上，將100UL上述原生質體溶液加入預冷的無菌15mL離心管中，每個轉化 反應用1管，加入10Ug重組質粒pGm-Gla573,加入12. 5iiL溶液C，溫和混勻后再冰上 放置20min。
[0050] 將麗SA頂層瓊脂試管熔化并保持在55°C。從冰中移出上述15mL離心管，并向管 中加入1mL溶液C和2mL溶液B，溫和混勻各管，所得混合物即為原生質體混合物。向3 個頂層瓊脂試管中的每一個中加入1mL上述原生質體混合物，并立即傾倒與MMSA平板上， 并將平板在30°C下培養疒10d至有轉化子長出。
[0051] 按照實施例1中的方法提取轉化子基因組DNA，以此為模板，利用實施例1中引物 進行PCR擴增目的基因。PCR擴增條件為98°C30S;98°C10S，53°C30S，72°C120S，30個 循環；72°C10min。利用凝膠回收試劑盒回收PCR擴增產物并進行測序分析，經過PCR反 應選育和測序驗證陽性轉化子。所獲得的陽性工程菌命名為黑曲霉XUJ-1(Aspergillus nigerXUJ-1)。
[0052]溶液A:2. 5mL1MK2HP04,2. 5mL1MKH2P04,48. 156gMgS04,加入dlH20 至終體 積500mL，用0. 22ym的微孔濾膜過濾除菌。
[0053]溶液B:5mL1MTris(pH7.5)，2.77gCaCl2，109.32g山梨醇，加入(111120至 終體積500mL，用0. 22ym的微孔濾膜過濾除菌。
[0054]溶液C:250gPEG4000,2. 77gCaCl2,5mL1MTris(pH7. 5)，加入dlH20 至終 體積500mL，用0. 22ym的微孔濾膜過濾除菌。
[0055]原生質體化溶液：將 0? 6g裂解酶（LysingEnzymefromTrichoderma harzianum，Sigma)溶解于40mL溶液A中，用0. 22iim的微孔濾膜過濾除菌。
[0056]MMSA平板：0?59g乙酰胺（Sigma)，3.4gCsCl(Sigma)，0.52gKC1，1.52g KH2P04,218.5g山梨醇，1ml微量元素（見下），20g瓊脂，加入dlH20至終體積972.5mL， 高壓蒸汽滅菌后加入用〇. 22ym的微孔濾膜過濾除菌的25mL40%葡萄糖和2. 5mL20% MgS04。
[0057]MMSA頂層瓊脂試管：0?59g乙酰胺（Sigma)，3. 4gCsCl(Sigma)，0?52gKC1, 1.52gKH2P04,218.5g山梨醇，1ml微量元素（見下），10g低熔點瓊脂糖，加入dlH20至 終體積972. 5mL，高壓蒸汽滅菌后，在培養基未凝固時，加入用0. 22ym的微孔濾膜過濾除 菌的25mL40%葡萄糖和2. 5mL20%MgS04，之后立即分裝于無菌試管中，每管10mL。
[0058]微量元素：在 250mLdlH20 中加入 1gFeS04 ? 7H20,8. 8gZnS04 ? 7H20,0? 4g CuS04 ? 5H20,0. 15gMnS04 ? 4H20,0. 1gNa2B407 ? 10H20,50mg(NH4)6M〇7024 ? 4H20,0. 2mL 濃HC1，完全溶解后用dlH20定容至1L，用0. 22ym的微孔濾膜過濾除菌。
[0059]CMA平板：20g葡萄糖，20g麥芽浸出物，1g蛋白胨，15g瓊脂，加入dlH20至終 體積1000mL，高壓蒸氣滅菌。
[0060]CMA液體培養基：20g葡萄糖，20g麥芽浸出物，1g蛋白胨，加入dlH20至終體積 1000mL，高壓蒸氣滅菌。
[0061] 實施例3:黑曲霉工程菌的發酵和酶的表達
[0062] 挑取實施例2獲得的陽性轉化子黑曲霉XUJ-1，接種于30mLTSB發酵培養基中， 在30°C，200rpm的條件下培養5d;所得發酵液用8層紗布過濾，濾液在14000g條件下 離心10min，收集上清液；將上清液在濃度為12%的SDS-PAGE膠上進行電泳。結果如圖2 所示，泳道1、泳道2所示均為黑曲霉宿主蛋白表達情況；泳道3所示為本發明黑曲霉XUJ-1 蛋白表達情況，其中箭頭所指95kDa處有目的蛋白條帶，與預期相符，說明本發明的葡糖淀 粉酶在黑曲霉中得到成功表達，利用BCA蛋白濃度測定試劑盒（Solarbio)測定顯示其表達 量約為6g/L。
[0063]TSB發酵培養基：12gNaN03,0. 5gKC1，1. 5gKH2P04,2 . 05gMgS04.7H20,3. 5g NaH2P04*H20,45g胰蛋白大豆肉湯，70g檸檬酸鈉，1g吐溫80，1mL微量元素（見下）， 加入dlH20至終體積700mL，高壓蒸氣滅菌后加入300mL用0. 22ym的微孔濾膜過濾除 菌的40%麥芽糖。
[0064]微量元素：在 250mLdlH20 中加入 1gFeS04 ? 7H20,8. 8gZnS04 ? 7H20,0? 4g CuS04 ? 5H20,0. 15gMnS04 ? 4H20,0. 1gNa2B407 ? 10H20,50mg(NH4)6M〇7024 ? 4H20,0. 2mL 濃HC1，完全溶解后用dlH20定容至1L，用0. 22ym的微孔濾膜過濾除菌。
[0065] 實施例4:葡糖淀粉酶酶活測定
[0066] 1、酶活測定方法
[0067]甲、乙兩支50mL比色管，分別加入25mL的2%可溶性淀粉溶液和5mL的0. 1M乙 酸-乙酸鈉緩沖溶液（pH4. 6);于40±0. 2°C的恒溫水浴中預熱5?lOmin。在甲管中加入 酶制備液2.OmL搖勻并立即記時；反應lh后，立即在甲、乙兩管各加0. 2mL的20%氫氧化 鈉溶液，立即搖勻并將兩管取出迅速用水冷卻；然后于乙管中補加酶制備液2. 0mL(作為對 照）。取兩管中上述反應液各5mL放入碘量瓶中，準確加入0. 1N碘液10mL，再加0. 1N氫氧 化鈉溶液15mL(邊加邊搖晃），放置暗處15min，加入2N硫酸2mL;最后用0. 05N硫代硫酸 鈉溶液滴定至無色為終點。
[0068]酶活X= (A-B)XNX90.05Xn[0069]其中：X-酶活力單位，U/g(mL);
[0070]A--空白試驗消耗硫代硫酸鈉溶液的毫升數；
[0071] B--樣品消耗硫代硫酸鈉溶液的毫升數；
[0072]N--硫代硫酸鈉溶液的當量濃度；
[0073] n--稀釋倍數；
[0074] 90. 05--lmLIN硫代硫酸鈉相當葡萄糖毫克數；
[0075] 2、酶活測定
[0076] 按照上述測定方法，取1ml上述發酵上清液進行酶活測定。結果顯示其酶活為 664U/mL，說明葡糖淀粉酶基因在黑曲霉中得到高效表達。
[0077]實施例5葡糖淀粉酶酶學性質分析
[0078]在pH4. 6 條件下，分別在 30°C、35°C、40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、 75°C條件下測定上述發酵上清液的酶活，以最高酶活為100%，計算相對酶活。結果如圖3所 示，本發明的葡糖淀粉酶的最適作用溫度為50°C。
[0079]在 40°C條件下，分別用pH為 2. 0、2. 5、3. 0、4. 0、5. 0、5. 5、6. 0、6. 5、7. 0、8. 0 的緩 沖液稀釋上述發酵上清液，測定酶活，以最高酶活為100%，計算相對酶活。結果如圖4所示， 本發明的葡糖淀粉酶的最適作用pH為5. 5。
[0080] 實施例6:轉糖實驗
[0081] 取l〇ml液化淀粉，加入2ml上述搖瓶發酵的上清液，即葡糖淀粉酶，50°C，pH5. 5條 件下作用30分鐘后，測定反應液的DE值(還原性糖值)，結果達到91%。實驗結果表明，本發 明的葡糖淀粉酶能從糖鏈的非還原端高效分解a-1，4-糖苷鍵來水解出葡萄糖。因此，本 發明篩選的葡糖淀粉酶，以及構建的重組表達工程菌可廣泛應用于淀粉糖工業。
【權利要求】
1. 一種葡糖淀粉酶，其特征在于，所述的葡糖淀粉酶包含有： 1) 氨基酸序列為SEQ ID NO: 1的葡糖淀粉酶； 2) 在1)中的氨基酸上發生取代、缺失或添加一個或數個氨基酸得到的，具有1)中葡糖 淀粉酶活性的酶。
2. -種基因，其特征在于，所述的基因用于編碼權利要求1所述的葡糖淀粉酶。
3. 如權利要求2所述的基因，其一種核苷酸序列為SEQ ID NO: 2。
4. 重組表達載體，所說的重組表達載體用于表達權利要求1所述的葡糖淀粉酶。
5. -種重組工程菌，所述的重組工程菌為攜帶有權利要求4所述的重組表達載體的宿 主細胞。
6. 如權利要求5所述的重組工程菌，其特征在于所述的宿主細胞為黑曲霉。
7. 權利要求1所述的葡糖淀粉酶在制備葡萄糖中的應用。
8. 權利要求5所述的重組工程菌在制備葡萄糖中的應用。
【文檔編號】C12N9/30GK104342419SQ201310337807
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年8月6日 優先權日:2013年8月6日
【發明者】王華明, 徐娟, 黃亦鈞 申請人:青島蔚藍生物集團有限公司