一種副溶血弧菌vp核酸恒溫擴增方法
【專利摘要】本發明公開了一種副溶血弧菌VP核酸恒溫擴增方法，具體地，本發明方法包括步驟：在反應體系中進行擴增，所述的反應體系中含有擴增副溶血弧菌VP的特異性引物對。本發明方法能夠高特異性、高靈敏度、低污染、避免假陽性、快速（常規50分鐘完成檢測）地對含有VPRNA的待測樣品進行擴增，具有檢測效率高，準確度高的特點，具有廣闊的應用前景。
【專利說明】—種副溶血弧菌VP核酸恒溫擴增方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及食源致病性微生物的生物檢測【技術領域】，具體涉及將特異性靶標捕獲技術和實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術結合的副溶血弧菌(VP)的實時熒光核酸恒溫擴增檢測中使用的引物、探針及相關試劑盒。
【背景技術】
[0002]副溶血性弧菌(Vibrio Parahaemolyticus,VP)是一種革蘭氏陰性嗜鹽桿菌,該菌是引起食源性疾病的重要病原之一，可導致患者腹瀉、腸痙攣、惡心、嘔吐、發燒等典型胃腸炎反應。在多種食物如水產品、腌制品中常會發生副溶血性弧菌污染。1998年以來的資料顯示，副溶血弧菌引發的食物中毒的發生規模及人群暴露規模呈明顯上升趨勢，均己超過沙門氏菌食物中毒，躍居首位。
[0003]目前副溶血弧菌檢測方法主要有分離培養方法及分子生物學方法。分離培養法操作步驟繁瑣，檢測周期長，一般需要5~7天完成，不能滿足快速檢測的要求。分子生物學方法有PCR方法和LAMP方法。PCR方法具有特異性強、靈敏度高等特點，但這類方法通常檢測成本高，需要比較昂貴的PCR儀，對實驗環境和操作者技術要求也比較高。LAMP方法不需要昂貴儀器，操作也簡便。但以上兩種方法檢測靶標均為DNA，不能區分活菌與死菌，容易發生假陽性結果。
[0004]實時突光核酸恒溫擴增檢測技術(SimultaneousAmplification and Testing,簡稱SAT)是一種直接快速檢測RNA的方法，與檢測DNA的實時熒光PCR相比，不同之處，前者檢測體系多了一個逆轉錄反應的步驟，核酸擴增在一個溫度下進行(42°C)，無需熱循環。SAT技術直接以病原微生物特異性RNA為擴增靶標，以擴增產物RNA為檢測靶標，在自然界中病原微生物死亡后靶`標RNA會快速降解，而DNA會存在一段時間，通過對目標RNA的檢測，可實現食品致病菌活菌檢測，降低假陽性。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是提供一種快速，高準確度，污染易控，避免假陽性，設備簡單，成本低的VP RNA檢測方法。
[0006]本發明的第一方面，提供了一種副溶血弧菌VP的擴增方法，所述擴增方法包括步驟:在反應體系中進行擴增，所述的反應體系中含有副溶血弧菌VP的特異性引物對，所述引物對包括:
T7引物:序列如SEQ ID NO: 3所示；和 nT7引物:序列如SEQ ID NO: 4所示。
[0007]在另一優選例中，所述反應體系中還包括M-MLV反轉錄酶和Τ7 RNA聚合酶。
[0008]在另一優選例中，所述反應體系還包括副溶血弧菌VP的捕獲探針。
[0009]在另一優選例中，所述反應體系還包括副溶血弧菌VP的檢測探針。
[0010]在另一優選例中，所述的捕獲探針的一端標記熒光基團，另一端標記淬滅基團。[0011]在另一優選例中，所述的檢測探針的5’端標記FAM熒光基團，且檢測探針的3’端標記DABCYL淬滅基團。
[0012]在另一優選例中，所述檢測探針的核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所示。
[0013]在另一優選例中，所述的捕獲探針可與副溶血弧菌VP的靶標核酸(VP RNA)序列特異結合。
[0014]在另一優選例中，所述方法還包括:在另一陽性(對照)反應體系或陰性(對照)反應體系中進行擴增反應。
[0015]在另一優選例中，所述的對照反應體系中含有所述特異性引物對、VP內標(VP ICRNA)、所述捕獲探針和所述檢測探針。
[0016]在另一優選例中，所述捕獲探針的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
[0017]在另一優選例中，所述的檢測探針用于與在T7 RNA聚合酶作用下根據所述VP靶標核酸(VP RNA)的DNA拷貝產生的RNA拷貝特異結合。
[0018]在另一優選例中，所述方法還包括步驟:在擴增反應過程之中或之后，檢測副溶血弧菌VP的特異性探針發出的熒光信號。
[0019]在另一優選例中，所述方法為實時熒光核酸恒溫擴增法。
[0020]在另一優選例中，所述反應體系中還含有待測的副溶血弧菌或衍生自所述副溶血弧菌核酸。
[0021]在另一優選例中，所述的待測核酸是來自各類鮮凍水產品及腌制食品。
[0022]本發明的第二方面，提供了一種副溶血弧菌VP的非診斷性檢測方法，其特征在于，所述檢測方法包括:
用如本發明第一方面中所述的擴增方法擴增待測樣品；和
在擴增反應過程之中或之后，檢測副溶血弧菌VP的特異性探針發出的熒光信號。
[0023]在另一優選例中，所述方法還包括設置一個或多個對照組。
[0024]在另一優選例中，所述對照組包括:VP陽性對照組、VP陰性對照組、VP內標對照組。
[0025]本發明的第三方面，提供了一種副溶血弧菌VP的檢測試劑盒，所述試劑盒包括: (a)第一容器，以及位于所述容器內的擴增副 溶血弧菌的特異性引物對，所述引物對
包括:
T7引物:序列如SEQ ID NO: 3所示；和 nT7引物:序列如SEQ ID NO: 4所示;
以及使用說明書。
[0026]在另一優選例中，所述的試劑盒還含有選自下組的一種或多種組分:
(b)捕獲探針；
(C)檢測探針；
(d)EV內標序列；和/或
(e)內標檢測探針。
[0027]在另一優選例中，所述試劑盒中還包括一種或多種酶。
[0028]在另一優選例中，所述的酶是M-MLV反轉錄酶和T7 RNA聚合酶。
[0029]在另一優選例中，所述M-MLV反轉錄酶和T7 RNA聚合酶存在于一酶液中，所述捕獲探針存在于一核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和EV檢測探針存在于一檢測液中。
[0030]在另一優選例中，所述的內標檢測探針存在于VP檢測液中。
[0031]在另一優選例中，所述VP內標為競爭性內標，并與VP靶標核苷酸(VP RNA)使用同一對引物(Τ7和ηΤ7)。
[0032]在另一優選例中，所述試劑盒中還包括VP陽性對照和/或VP陰性對照。
[0033]在另一優選例中，所述捕獲探針是與副溶血弧菌的靶標核酸(VP RNA)序列特異結合的捕獲探針；和/或
所述檢測探針是與根據所述VP靶標核酸(VP RNA)的DNA拷貝產生的RNA拷貝特異結合的VP檢測探針。
[0034]在另一優選例中，所述的捕獲探針和/或所述的檢測探針還可與副溶血弧菌VP的靶標核酸(VP RNA)序列特異結合。
[0035]在另一優選例中，所述的試劑盒還包括選自下組的一個或多個特征:
所述檢測探針包括如SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列；和/或
所述的捕獲探針包括如SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列；和/或 所述的VP內標序列包括如SEQ ID NO: 7所示的核苷酸序列；和/或 所述的內標檢測探針包括如S EQ ID NO: 6所示的核苷酸序列。
[0036]在另一優選例中，所述試劑盒包含以下組分:裂解液、核酸提取液、洗滌液、VP反應液、VP檢測液、SAT酶液、VP陽性對照、VP陰性對照和VP內標；
其中，
所述裂解液包括硫酸銨((NH4)2SO4)和HEPES ；
所述核酸提取液包括捕獲探針和磁珠；
所述洗滌液包括NaCl和SDS ；
所述VP反應液包括dNTP和NTP ；
所述VP檢測液包括T7引物、nT7引物、EV檢測探針和內標檢測探針；
所述SAT酶液包括M-MLV反轉錄酶、Τ7 RNA聚合酶；
所述VP陽性對照包括副溶血弧菌5’端的toxR基因的體外轉錄RNA稀釋物；
所述的VP陰性對照是不含有副溶血弧菌靶標核酸(VP RNA)序列或不含有副溶血弧菌的溶液，較佳地，所述的陰性對照是生理鹽水；
VP內標:含VP內標RNA(VP IC RNA,序列如序列表中SEQ ID NO: 7所示)稀釋物。
[0037]在另一優選例中，所述試劑盒包括A盒和B盒，其中，
A盒為標本處理單元，包括所述裂解液、所述核酸提取液和所述洗滌液；
B盒為核酸擴增檢測單元，包括所述VP反應液、VP檢測液、SAT酶液、VP陽性對照、VP陰性對照及VP內標。
[0038]本發明的第四方面，提供了一種擴增腸道病毒的特異性引物對，所述引物對 包括:
T7引物:序列如SEQ ID NO: 3所示；和 nT7引物:序列如SEQ ID NO: 4所示。
[0039]本發明的第五方面，提供了一種如本發明第三方面所述的試劑盒或如本發明第四方面所述的引物對的用途，其特征在于，對鮮凍水產品及腌制食品樣品中是否存在副溶血弧菌VP進行定性檢測，和對是否存在副溶血弧菌VP活菌進行判定。
[0040]在另一優選例中，所述的鮮凍水產品樣品包括貝類、魚類、蝦類、蟹類、海草等及其相應加工產品等；所述的腌制產品包括各類蔬菜、禽肉蛋類腌制后的食品。
[0041]應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0042]圖1為副溶血弧菌的靈敏度Fl通道檢測結果 圖2為副溶血弧菌的靈敏度F2通道檢測結果
圖3為實施列4中SAT檢測B管VP的檢測結果 圖4為實施列4中PCR檢測B管VP的檢測結果 圖5為實施列4中SAT檢測A管VP的Fl通道檢測結果 圖6為實施列4中SAT檢測A管VP的F2通道檢測結果 圖7為實施列4中PCR檢測A管VP的檢測結果 【具體實施方式】
本發明人經過長期而深入的研究，經過大量篩選和驗證，開發了高特異性，高靈敏的專用引物對。使用該特定的引物序列對副溶血弧菌VP的核酸進行擴增時，具有高特異性，高靈敏等優異優點，可以用于準確地檢測副溶血弧菌VP。基于上述發現，發明人完成了本發明。
[0043]引物和探針
如本文所用，術語“擴增引物和探針副溶血弧菌VP的特異性引物”指這樣的引物(對)，它擴增出的擴增產物具有副溶血弧菌VP的互補鏈序列。
`[0044]在引物設計上，為了能夠更好地滿足目前對副溶血弧菌VP檢測的需要，本發明人選擇了 VP病毒5’端的toxR基因中無二級結構且高度保守區段作為擴增靶序列區域(其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)。優選的引物序列包括如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4組成的引物對。
[0045]在本發明的擴增方法中，除引物外，反應體系中還可以包括一個或多個探針，如檢測探針，捕獲探針等。
[0046]如本文所用，術語“副溶血弧菌VP的捕獲探針”指可與副溶血弧菌VP的靶標核酸(VP RNA)序列特異結合的核苷酸序列。本發明的一種優選的捕獲探針具有如SEQID NO:2所示的核苷酸序列。更佳地，所述的捕獲探針特異結合于副溶血弧菌VP的靶標核酸(VPRNA)序列。在另一優選例中，當所述副溶血弧菌VP含有VP內標(VP IC RNA)時，所述捕獲探針還可以與所述VP內標序列特異結合，用于設計陰性對照組。
[0047]VP檢測探針為分子信標，是一類高特異性、高敏感性的分子探針，由兩端分別共價標記有熒光染料和淬滅劑的單鏈核酸分子組成，呈發夾型或莖環結構，分子信標的環部分和靶標互補，兩頭由于互補而成為莖，分子信標探針與線性的TaqMan探針相比，因其發夾結構的打開需要一定的力，因而特異性要好于線性探針。本發明的一種優選的檢測探針具有如SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列。[0048]本發明的引物序列和探針序列根據引物探針設計原理，使用DNAStar、DNAMAN軟件和人工設計用于實時熒光核酸恒溫擴增檢測副溶血弧菌VP的專用引物和檢測探針序列。通過大量實驗篩選比對靶標檢測探針，選取靈敏度較優者。在內標檢測探針設計中，需選取與靶標RNA無交叉反應的競爭性內標(VP RNA)及相應內標探針，確保該內標檢測探針與靶標檢測探針分別對VP RNA與VP IC RNA無交叉信號，且對內標RNA檢測靈敏度較優者。本發明的一種優選的內標檢測真具有如SEQ ID NO: 6所示的核苷酸序列，5’端標記HEX熒光基團，3’端標記DABCYL淬滅基團。
[0049]對照物
由于SAT擴增易受多種因素影響而使擴增失敗，使試劑盒使用人員判斷失誤得出錯誤的結論，因此，在本發明的試劑盒中還可以設置對照物，以排除檢測結果失真的情況。
[0050]本發明中可以設置的參照物包括:VP陽性對照、VP陰性對照和VP內標中的一個或多個對照物。 [0051]VP陽性對照可以是為體外轉錄的RNA，不具有生物學活性。通過檢測陽性對照，可證明試劑盒檢測方法及材料無誤，保證檢測的準確性，同時可以監測每次檢測的重復性和穩定性及試劑盒批次間的差異。
[0052]此外，通過陽性對照品可制備臨界弱陽對照(以生理鹽水和裂解液按1:1混合成為稀釋液，稀釋陽性對照100倍作為臨界弱陽對照)，可以提示處于臨界值狀態時的檢驗操作情況，通過臨界弱陽對照定期檢測SAT實驗室，可進行室內質量控制，以防止檢測過程出現漏檢(假陰性)的情況。
[0053]VP內標可以是體外轉錄的RNA，不具有生物學活性。VP內標作為VP RNA的競爭性內標，可以作為參照物，用于防止假陰性結果的發生，通過檢測加入有內標的樣本，可了解整個擴增反應體系是否受抑制，更好的提示假陰性。
[0054]陰性對照可排除假陽性，在正確使用試劑盒檢測方法和材料情況下，可保證檢測的特異性。
[0055]在另一優選例中，所述體外轉錄的VP RNA通過以下述方法制備:
(1)用化學合成法合成VP5’端的iwR基因片段(VP陽性片斷，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 8所示)；
(2)將VP5’端的iozR基因片段插入到pGEM?-T載體中，構建VP陽性對照質粒；
(3)VP陽性對照質粒轉化到大腸桿菌DH5 α中，命名為pGEM?_T_VP菌株，貯存于-70。。；
(4)從pGEM?-T-VP菌株中提取pGEM?-T-VP質粒，將質粒進行轉錄RNA，純化去除DNA，并定量、鑒定RNA。
[0056]在另一優選例中，所述VP內標中的體外轉錄的VP IC RNA以下述方法制備:
(I)用化學合成法合成一段除探針檢測區域序列不同，其他序列基本同VP靶標序列區域(VP內標片斷，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 9所示)；
(2)將片段克隆到pGEM?-T載體中，構建VP內標質粒；
(3)EV內標質粒轉化到大腸桿菌DH5a中，命名為pGEM?_T_ VP IC菌株，貯存于_70°C;
(4)從pGEM?-T-VP IC菌株中提取pGEM?_T_VP IC質粒，將質粒進行轉錄RNA純化去除DNA，并定量、鑒定內標RNA。[0057]檢測方法
本發明還提供了副溶血弧菌VP的檢測方法，包括用本發明所述的特異性引物對待測樣品進行擴增；和
在擴增反應過程中或之后，檢測副溶血弧菌VP的擴增產物，例如通過檢測特異性探針發出的突光信號。
[0058]所述方法還可以任選地包括設置一個或多個對照組，如VP陽性對照組、VP陰性對照組、VP內標組等。
[0059]在本發明中，檢測方法可以用常規的PCR方法，也可用實時熒光檢測法等不同的方法。一種特別優選的方法是實時熒光核酸恒溫擴增法。
[0060]實時熒光核酸恒溫擴增技術(SAT)
核酸恒溫擴增實時熒光檢測技術，其原理是將RNA恒溫擴增和實時熒光檢測相結合的一種新型核酸檢測技術。首先通過M-MLV反轉錄酶、T7 RNA多聚酶和優化探針(optimalprobe, patent pending)技術來同時實現。反轉錄酶用于產生祀標核酸(RNA)的一個DNA拷貝，T7 RNA多聚酶從DNA拷貝上產生多個RNA拷貝，帶有熒光標記的優化探針和這些RNA拷貝特異結合，從而產生熒光，該熒光信號可由檢測儀器捕獲。檢驗結果根據實時熒光信號的出現時間和強度，結合陽性對照、陰性對照和內標信號對檢驗結果進行判定。
[0061]在本發明中，副溶血弧菌VP檢測技術通過使用高特異性和高靈敏度的專用引物對，并配合使用專用的捕獲探針，可高效、特異性捕獲VP的RNA。核酸擴增使用M-MLV反轉錄酶和T7 RNA聚合酶來同時實現，反轉錄酶用于產生5靶標核酸RNA的一個DNA拷貝，T7RNA聚合酶從DNA拷貝上產生多個RNA拷貝，帶有熒光標記的優化檢測探針和擴增后產生的RNA拷貝特異結合，從而產生熒光，該熒光信號可由檢測儀器捕獲。
[0062]試劑盒
本發明提供了一種副溶血弧菌VP的檢測試劑盒，包括:
(a)擴增副溶血弧菌的特異性引物對，所述引物擴增出的擴增產物具有副溶血弧菌VP的互補鏈序列；
(b)捕獲探針；和 (b)檢測探針。
[0063]所述的引物對是一對用于在M-MLV反轉錄酶作用下產生VP靶標核酸(VP RNA)的DNA拷貝的VP擴增引物，在本發明的一個優選例中，所述的VP擴增引物包括:T7引物:SEQID NO: 3;和 nT7 引物:SEQ ID NO: 4。
[0064]所述的捕獲探針是與副溶血弧菌的靶標核酸(VP RNA)序列特異結合的捕獲探針；所述的檢測探針是與根據所述VP靶標核酸(VP RNA)的DNA拷貝產生的RNA拷貝特異結合的VP檢測探針。在另一優選例中，所述的捕獲探針和/或所述的檢測探針還可與副溶血弧菌VP的靶標核酸(VP RNA)序列特異結合。
[0065]所述的副溶血弧菌VP還可以被設計為含有VP內標(VP IC RNA)，較佳地，當副溶血弧菌含有VP內標時，所述捕獲探針和檢測探針被設計為還可以與所述VP內標序列特異結合，形成VP內標對照組。在另一優選例中，所述VP內標為競爭性內標，并與VP靶標核苷酸(VP RNA)使用同一對引物(T7和nT7)。
[0066]所述試劑盒中還可以包括一種或多種酶。如M-MLV反轉錄酶和Τ7 RNA聚合酶。在另一優選例中，所述M-MLV反轉錄酶和T7 RNA聚合酶存在于一酶液中，所述捕獲探針存在于一核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和VP檢測探針存在于一檢測液中。
[0067]在另一優選例中，所述試劑盒包含以下組分:裂解液、核酸提取液、洗滌液、VP反應液、VP檢測液、SAT酶液、VP陽性對照、VP陰性對照和VP內標；其中，所述裂解液包括硫酸銨((NH4)2SO4)和 HEPES ；
所述核酸提取液包括捕獲探針和磁珠；
所述洗滌液包括NaCl和SDS ；
所述VP反應液包括dNTP和NTP ；
5所述VP檢測液包括T7引物、nT7引物、VP檢測探針和內標檢測探針；
所述SAT酶液包括M-MLV反轉錄酶、Τ7 RNA聚合酶；
所述VP陽性對照包括副溶血弧菌5’端的iwR基因的體外轉錄RNA稀釋物；
所述的VP陰性對照是不含有副溶血弧菌靶標核酸(VP RNA)序列或不含有副溶血弧菌的溶液，較佳地，所述的陰性對照是生理鹽水；
VP內標:含VP內標RNA (VP IC RNA，序列如序列表中SEQ ID NO: 7所示)的體外轉錄RNA稀釋物。
[0068]在另一優選例中，所述試劑盒的一個反應單位中各種試劑組成如下:
(1)裂解液:HEPES25-250mM, (NH4)2SO4 5-50mM ；
(2)核酸提取液:HEPES50-400mM, EDTA 40-200mM, LiCl 400-2000mM,捕獲探針1-50 μ M (優選為 5-25 μ Μ),磁珠 50_500mg/L (優選為 50-250mg/L)；
(3)洗滌液:HEPES5-50mM, NaCl 50-500 mM, lwt% SDS, EDTA 1-1OmM ；
(4)VP 反應液:Tris 10-50mM, MgCl2 10-40mM, dNTP 0.1-1OmM(優選為 0.5_5mM)，NTP
l-20mM (優選為 1-1OmM)，PVP40 1-10%, KCl 5-40mM ；
(5)VP檢測液:將VP擴增引物和VP檢測探針溶解在TE溶液(IOmM Tris和I mM EDTA的混合液)中配制而成，各引物和探針濃度在5-lOpmol/反應均可；
其中T7引物濃度優選為5pmol/反應，nT7引物濃度優選為7.5pmol/反應，VP檢測探針濃度優選為5pmol/反應’內標檢測探針濃度優選為5pmol/反應；
(6)SAT 酶液=M-MLV 反轉錄酶 400-4000U/ 反應(優選為 500-1500U/ 反應)、T7 RNA聚合酶 200-2000U/反應(優選為 500-1000U/反應)、2_10mM ΗΕΡΕ、ρΗ7.5、10-100 mMN-acetyl_L-cysteine、0.04-0.4 mM zinc acetate、10-100 mM trehalose>40-200 mMTris-HCl pH 8.0、40_200mM KCU0.01-0.5mM EDTA、0.1-1% (v/v) Triton X-100 和20-50% (v/v) glycerol ；
(7)VP陽性對照；含IO5-1O8拷貝/mL副溶血弧菌(VP) toxR基因的體外轉錄RNA稀釋
物；
(S)VP陰性對照:不含有副溶血弧菌(VP)靶標核酸(EV RNA)序列或不含有副溶血弧菌(VP)的溶液；
(9)EV內標:含IO5-1O8拷貝/mL VP IC RNA(序列如序列表中SEQ ID NO: 7所示)。
[0069]在另一優選例中，所述的試劑盒還包括一個或多個容器，且上述的各個組分可分別位于一個或多個容器中，在另一優選例中，所述試劑盒包括A盒和B盒，其中，
A盒為標本處理單元，包括所述裂解液、所述核酸提取液和所述洗滌液；B盒為核酸擴增檢測單元，包括所述VP反應液、VP檢測液、SAT酶液、VP陽性對照、VP陰性對照及VP內標。
[0070]在另一優選例中，所述的檢測探針包括如SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列,和/或所述的捕獲探針包括如SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列。
[0071]利用以上試劑盒對副溶血弧菌進行實時熒光核酸恒溫擴增檢測，包括以下步驟:
1)用裂解液裂解待測樣品中的副溶血弧菌，得到含有副溶血弧菌核酸的裂解液；
2)向步驟I)的裂解液中加入核酸提取液和和VPIC RNA，使捕獲探針與靶標或內標核酸特異結合后再 與磁珠結合，用洗滌液洗滌，除去未與磁珠結合的核酸，得到副溶血弧菌的核酸(RNA)和 VP IC RNA ；
3)將步驟2)提取的副溶血弧菌的核酸(RNA)和VPIC RNA加入由VP反應液和VP檢測液組成的第一階段反應物中，在60°C下溫育10分鐘后，再在42°C下溫育5分鐘，然后加入第二階段酶反應物SAT酶液，由此開始在42°C下繼續溫育50分鐘，用檢測儀同步記錄熒光信號的變化；所述第一階段反應物與第二階段酶反應物的體積比為3:1 ；
4)根據熒光信號產生的時間和強度參照VP陽性對照、VP陰性對照和VP內標檢測結果對待測樣品進行定性檢測。
[0072]與現有的VP檢測相比，本發明具有以下優點:
(I)高特異性、高純度、低污染:針對VP靶核酸設計的優選捕獲探針，可高效、特異性捕獲VP的RNA。同時，由于采取封閉式的恒溫放大檢測系統，整個反應過程中無需打開反應體系，因而避免了擴增子的污染。
[0073](2)快速檢測:將核酸的擴增與檢測在同一封閉體系中同步進行，而且整個過程中沒有溫度的升降及循環，因而所需時間大大縮短，擴增檢測只需要50分鐘。
[0074](3)污染易控:與實時熒光PCR相比，本發明的擴增產物是RNA，RNA在自然界中極易降解，所以污染控制較容易。
[0075](4)能有效區別檢測物中的死菌和活菌，檢測更準確，更科學，避免假陽性。
[0076](5)設備簡單，成本低:與實時熒光定量PCR相比，本發明所用的儀器無需升降溫循環，因而設計和生產成本大幅降低。
[0077]綜上所述，本發明試劑盒能夠檢測鮮凍水產品及腌制食品中的VP RNA，具有特異性高、靈敏度高(可達1000CFU/mL)、污染低(擴增產物RNA在自然環境下易于降解)、避免假陽性及快速檢測(50分鐘完成擴增檢測)的特點，將在副溶血弧菌快速檢測中發揮重要作用，應用前景廣闊。
[0078]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆:實驗室手冊(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數是重量百分比和重量份數。
[0079]實施例中所用主要原料SAT酶液、陽性對照及內標的體外轉錄RNA由美國RDBiosciences公司提供，7500型PCR儀為美國ABI公司產品，NTPs, dNTPs等試劑和其他儀器均為常規可商購產品。
[0080]實施例1、用于實時熒光核酸恒溫擴增檢測副溶血弧菌(VP)的專用引物和探針的設計
本發明選擇VP toxR基因中無二級結構且高度保守區段作為擴增靶序列區域(其核苷酸序列如序列表中序列I所示)，根據引物探針設計原理，使用DNA ATAR、DNAman軟件和人工設計用于實時熒光核酸恒溫擴增檢測副溶血弧菌(VP)的專用引物和探針序列，得到如下具體序列:
(1)一條可與如序列表中序列I所示的副溶血弧菌(VP)的靶標核酸(VP RNA)序列特異結合的捕獲探針(TCO, Target Capture Oligo),所述捕獲探針的核苷酸序列為5’_aucyuccagucucugcgcgaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa-3’(Y 為簡并喊基，代表 C/T,序列表中序列2)； (2)—對用于在M-MLV反轉錄酶作用下產生VP靶標核酸(VPRNA)的DNA拷貝的VP檢測引物，所述VP檢測引物由T7引物和nT7引物組成，Τ7引物序列為5，- aatttaatacgactcactatagggagacagtacgcaaatcggtagta-3，(序列表中序列 3), nT7 引物序列為5’ -gtagtagtacctgaaaaagca _3’(序列表中序列 4)；
(3)—條用于與在T7 RNA聚合酶作用下根據所述VP靶標核酸(VP RNA)的DNA拷貝產生的RNA拷貝特異結合的VP檢測探針，所述VP檢測探針的核苷酸序列為5’-cguccugcugugaauccuuggacg_3’(序列表中序列 5), 5’端用 FAM 突光標記，3’端用 DABCYL突光標記。
[0081](4)為便于進行結果分析，還配合試劑盒中增加的競爭性VP內標(序列7)，設計了競爭性內標檢測探針，VP內標與VP靶標核苷酸(VP RNA)擁有相同的引物結合區，兩引物之間的核酸序列或排列不同，使其不能與檢測探針結合，但能與內標探針結合，所述VP內標可通過VP靶標模板定點突變構建獲得，可與捕獲探針特異性結合，所述內標檢測探針為與VP檢測探針序列、突光標記不同，但堿基數一致的探針，所述的內標檢測探針的核苷酸序列為5’ -ccagGUAAUUCGGCACGUGGccugg-3’(序列表中序列6), 5’端標記HEX突光基團，3’端標記DABCYL淬滅基團。
[0082]實施例2制備副溶血弧菌VP的實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒
利用實施例1所提供的專用引物和探針，得到本發明副溶血弧菌VP的實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒。該試劑盒包含有捕獲探針(TC0，Target Capture Oligo)、T7引物、nT7引物、VP檢測探針、內標檢測探針、內標、M-MLV反轉錄酶和Τ7 RNA聚合酶等組分。
[0083]其中，捕獲探針序列如SEQ ID NO: 2 ；
Τ7引物序列如SEQ ID NO: 3 ；
ηΤ7引物序列如SEQ ID NO: 4 ；
EV檢測探針序列如SEQ ID NO: 5 ；
內標檢測探針序列如SEQ ID NO: 6 ；
內標序列如SEQ ID NO: 7 ；
所述捕獲探針存在于核酸提取液中，所述Τ7引物、ηΤ7引物和VP檢測探針、內標檢測探針存在于VP檢測液中，所述M-MLV反轉錄酶和Τ7 RNA聚合酶存在于SAT酶液中，具體來講，所述試劑盒分為2-30°C儲存的A盒(標本處理單元)和-15- _35°C儲存的B盒(核酸擴增檢測單元)，A盒包括裂解液、核酸提取液和洗滌液，B盒包括VP反應液、VP檢測液、SAT酶液、VP陽性對照、VP陰性對照和VP內標，主要成分如下:A盒(標本處理單元)組成為:
裂解液；含硫酸銨((NH4)2SO4)和HEPES ；
核酸提取液:含捕獲探針1-50 μ M (優選為5-25 μ Μ)和磁珠50_500mg/L (優選為50-250mg/L)；
洗滌液:主要含lwt% SDS0
[0084]B盒(核酸擴增檢測單元)組成為:
VP 反應液:含 dNTP 0.1-1OmM (優選為 0.5_5mM)，NTP l-20mM (優選為 1-lOmM)；
VP檢測液:含引物和探針，各引物和探針的濃度在5-lOpmol/反應均可，其中T7引物濃度優選為5pmol/反應，nT7引物濃度優選為7.5pmol/反應，VP檢測探針濃度優選為5pmol/反應’內標檢測探針濃度優選為5pmol/反應；
SAT酶液:含M-MLV反轉錄酶400-4000U/反應(優選為500-1500U/反應)，T7 RNA聚合酶200-2000U/反應(優選為500-1000U/反應)；
VP陽性對照；含IO5-1O8拷貝/mL副溶血弧菌(VP) toxR基因的體外轉錄RNA稀釋物；VP陰性對照:不含有副溶血弧菌(VP)靶標核酸(VP RNA)序列或不含有副溶血弧菌的溶液,如生理鹽水；
VP 內標:含 IO5-1O8 拷貝 /mL VP IC RNA 稀釋物(SEQ ID NO: 7)。
[0085]試劑盒中所包含的所有試劑均可按提示以常規方法制備取得或商業購買得到。
·[0086]具體來講，每一反應單位中，所述試劑盒各種試劑的具體組配如下:
(1)裂解液:為裂解和保存食品樣本中的副溶血弧菌(VP)，含有硫酸銨和HEPES緩沖液的溶液，具體包含 HEPES 25-250mM, (NH4)2SO4 5-50mM ；
(2)核酸提取液:為提取副溶血弧菌(VP)RNA的含有oligo (dT)包被的磁珠和特異結合靶標核酸(VP RNA)的一段RNA序列的溶液，具體包含HEPES 50-400mM, EDTA 40-200mM,LiCl 400-2000mM，捕獲探針 1-50 μ M (優選為 5-25 μ M )，磁珠 50_500mg/L (優選為50-250mg/L)；
(3)洗滌液:為含SDS、NaCl 的溶液，具體包含 HEPES 5-50mM, NaCl 50-500Mm, 1% SDSImM, EDTA 1-1OmM ；
(4)VP反應液:為含dNTPs和NTPs擴增所需組份，具體包含Tris 10-50mM, MgCl210-40mM, dNTP 0.1-1OmM (優選為 0.5_5mM)，NTP l-20mM (優選為 1-lOmM)，PVP40 1-10%,KCl 5-40mM ；
(5)VP檢測液:將恒溫擴增時必需的VP檢測引物和VP檢測探針溶解在TE溶液(IOmMTris和ImM EDTA的混合液)中配制而成，引物和探針濃度在5-10pmol/反應均可，其中T7引物濃度優選為5pmol/反應，nT7引物濃度優選為7.5pmol/反應，VP檢測探針濃度優選為5pmol/反應’內標檢測探針濃度優選為5pmol/反應；
(6)SAT酶液:為恒溫擴增時必需的多酶組分體系，含M-MLV反轉錄酶400-4000U/反應(優選為500-1500U/反應)、T7 RNA聚合酶200-2000U/反應(優選為500-1000U/反應)、
2-10mM HEPES ρΗ7.5、10_100 mM N-acetyl-L_cysteine、0.04_0.4 mM zinc acetate、10-100 mM trehalose、40-200 mM Tris-HCl pH 8.0、40_200mM KC1、0.01-0.5mM EDTA、0.1-1% (v/v) Triton X-100 和 20-50% (v/v) glycerol ；
(7)VP陽性對照；含IO5-1O8拷貝/mL副溶血弧菌(VP) idR基因的體外轉錄RNA稀釋物；
(8)VP陰性對照:不含有副溶血弧菌(VP)靶標核酸(VP RNA)序列或不含有副溶血弧菌的溶液；
(9)VP 內標:含 IO5-1O8 拷貝 /mL VP 內標 RNA。
[0087]VP陽性對照中的體外轉錄的VP RNA，可以通過多種方法制備所得，其中一種制備方法如下:
(I)用化學合成法合成VP toxR基因中無二級結構且高度保守區段作為擴增靶序列區域(其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:8所示)；
(2)將片段克隆到pGEM?-T載體中，構建VP陽性對照質粒；
(3)VP陽性對照質粒轉化到大腸桿菌DH5a中，命名為PGEM?_T_VP菌株，貯存于-70。。；
4)從pGEM?-T-VP菌株中提取pGEM?-T-VP質粒，將質粒進行轉錄RNA，純化去除DNA，并定量、鑒定RNA。
[0088]VP內標中的體外轉錄的VP IC RNA，可以通過多種方法制備所得，其中一種制備方法如下:
(1)用化學合成法合成一段除探針檢測區域序列不同，其他序列基本同VP靶標序列區域(其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:9所示)；
(2)將片段克隆到pGEM?-T載體中，構建VP內標質粒；
(3)VP內標質粒轉化到大腸桿菌DH5a中，命名為pGEM?_T_VP IC菌株，貯存于_70°C;
(4)從pGEM?-T-VPIC菌株中提取pGEM?_T_VP IC質粒，將質粒進行轉錄RNA，純化去除DNA，并定量、鑒定內標RNA。
[0089]實施例3純菌靈敏度檢測
用本發明試劑盒(組成見實施例2)檢測濃度為IO2 CFU/mL、103 CFU/mL、104CFU/mL、IO5 CFU/mL、106CFU/mL、107CFU/mL的食品樣品中的副溶血弧菌(VP)，另設一個陰性對照。具體方法包括以下步驟:
(I)菌液培養，計數和稀釋
取副溶血弧菌標準菌株劃線堿性蛋白胨水(APW)平板，37°C培養12h后，比濁法計數，生理鹽水稀釋定量到107CFU/mL，并用生理鹽水10倍倍比稀釋到102CFU/mL。
[0090](2)核酸提取
2.1在樣品處理管(1.5mL離心管)中加入200 μ I裂解液(含HEPES 35mM, (NH4) 2S0420mM),200yl樣品溶液，用裂解液裂解待測樣品中的副溶血弧菌(VP)，得到含有副溶血弧菌(VP)核酸的裂解液。
[0091]2.2在樣品處理管(1.5mL離心管)中加入100 μ I核酸提取液(含HEPES IOOmM,EDTA 50mM, LiCl 500mM，捕獲探針20μΜ，磁珠250mg/L)，加入10 μ I內標溶液，混勻，60°C保溫5分鐘，室溫放置10分鐘。
[0092]2.3將樣品處理管置于磁珠分離裝置上，靜置5-10分鐘。待磁珠吸附于管壁后，保持樣品處理管于磁珠分離裝置上，吸棄液體，保留磁珠。加入ImL洗滌液(含HEPES 50mM,NaCl IOOmM, I % SDS, EDTA 5mM)振蕩均勻后靜置5_10分鐘，棄液體，保留磁珠，反復2次。
[0093]2.4將樣品處理管移離磁珠分離裝置，管中為磁珠-核酸復合物，備用(此步應清晰可見磁珠)。
[0094](3) SAT核酸擴增檢測
3.1向樣品處理管中加入40μ I反應檢測液(40μ I VP反應液+2.5μ1 VP檢測液)洗滌磁珠。VP 反應液具體包含 Tris 30mM, MgCl2 IOmM, dNTP 4mM, NTP 8mM, PVP40 5%,KCl 25mM ；VP檢測液中T7引物濃度為5pmol，nT7引物濃度為7.5pmol,VP檢測探針濃度為5pmolο
[0095]3.2取振蕩混勻的上述反應檢測液30 μ I加至潔凈微量反應管，用7500型PCR儀(美國ABI公司產品)60°C保溫10分鐘，42°C保溫5分鐘；向微量反應管中加入10 μ I已預熱至42°C的SAT酶液，1200rpm振蕩15秒鐘混勻。SAT酶液中含M-MLV反轉錄酶1200U，T7RNA 聚合酶 1200U/ 反應，IOmM HEPES ρΗ7.5,20 mM N-acetyl-L-cysteine (N-乙酰-L-半胱氨酸)，0.4 mM zinc acetate (乙酸鋒)、30 mM trehalose (海藻糖)、100 mM Tris-HClpH 8.0, 200mM KC1,0.1mM EDTA,0.8% (v/v)Triton X-100 和 40% (v/v) glycerol (丙二醇)；
3.3將微量反應管快速轉至恒溫熒光檢測儀器(FAM通道)，42°C反應50分鐘，設定每I分鐘檢測一次熒光，共檢測50次。
[0096](4)結果判定
根據PCR擴增結果得到的曲線，設定閥值線，讀取dt值，判定結果。
[0097]閾值設定:以閾值線剛好超過正常陰性對照擴增曲線的最高點。dt表示樣本曲線與閾值線交點的橫坐標讀數 (與一般實時熒光PCR實驗結果的Ct值類似)。
[0098]陽性結果判定:
Fl通道(FAX通道):dt ( 45的樣本為陽性；45 < dt < 50的樣本建議重新檢測，檢測結果Fl通道:dt < 50的樣本為陽性。
[0099]陰性結果判定:
Fl通道dt無數值或為50，同時F2通道(VIC通道，ABI儀器只可選VIC通道，但VIC與HEX波長相近):dt≤45，則為陰性。
[0100]質量控制:每次檢測均設置陽性對照和陰性對照，且結果應同時滿足陽性對照Fl通道:dt < 45 ;陰性對照Fl通道:dt無數值或為50，同時F2通道:dt < 45，否則此次檢測結果視為無效。
[0101](5)結果
從圖1(F1熒光通道)、圖2(F2熒光通道)可看到，本發明試劑盒最低檢出限為IO3 CFU/mL，各濃度均可檢出內標，表示反應體系沒有受抑制影響。
[0102]實施例4 SAT與PCR對活菌死菌的檢測比對
本次檢測為本發明的另一個應用:試劑盒組成，檢測方法及試劑用量同實施例3，具體方法包括如下步驟:
(I)樣本處理
取25 g (mL)食品樣本，加入225mL堿性蛋白胨水(APW)中進行勻漿；37°C培養12h，取上清分為A、B管(B管為活菌對照組)；將A管置于75度水浴鍋中10分鐘，并通過顯微鏡觀察顯示A管菌體已破裂；然后將加熱(A管)與不加熱處理的菌液(B管)分別進行10倍梯度稀釋10、ΙΟ2、ΙΟ3、104、IO5UO6倍，分別取50ul稀釋菌液涂平板(LB)進行過夜培養。第二天，A管的菌液對應的LB平板無菌落，B管的菌液對應的LB平板有菌落，說明加熱后的菌(A管)全被滅活，A管為死菌，B管為活菌。
[0103](2)提取、擴增與檢測
SAT檢測方法同實施例3 ；PCR檢測市面上常規檢測副溶血弧菌的PCR試劑盒進行提取和擴增檢測。
[0104](3)檢測結果:
對B管副溶血弧菌各梯度濃度進行檢測，SAT方法均可檢出KT1到10_6 (圖3)濃度，PCR可檢出10-1到10-5 (圖4)，可見本發明所形成的試劑盒具有較高的靈敏度。
[0105]對A管各梯度濃度進行檢測，SAT的Fl通道檢測除陽性對照外均為陰性(圖5)，同時F2通道(圖6)顯示各梯度有內標信號，說明SAT反應體系未受抑制，結果可靠；同時A管的PCR檢測結果(圖7)同B管PCR結果，IO-1到10_5顯示均為陽性，表明其不能區分死菌和活菌，這是因為副溶血弧菌的DNA在環境中穩定所致。通過對RNA的檢測，可有效區分食品中的副溶血弧菌活菌死菌情況，避免假陽性。
【權利要求】
1.一種副溶血弧菌VP的方法，其特征在于，所述擴增方法包括步驟:在反應體系中進行擴增，所述的反應體系中含有擴增副溶血弧菌VP的特異性引物對，所述引物對包括: T7引物:序列如SEQ ID NO: 3所示；和 nT7引物:序列如SEQ ID NO: 4所示。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述反應體系還包括副溶血弧菌VP的捕獲探針。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述反應體系還包括副溶血弧菌VP的檢測探針。
4.如權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于，所述方法還包括步驟:在擴增反應過程之中或之后，檢測副溶血弧菌VP的特異性探針發出的熒光信號。
5.一種副溶血弧菌VP的非診斷性檢測方法，其特征在于，所述檢測方法包括: 用如權利要求1中所述的擴增方法擴增待測樣品；和 在擴增反應過程之中或之后，檢測副溶血弧菌VP的特異性探針發出的熒光信號。
6.一種副溶血弧菌VP的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括: (a)第一容器，以及位于所述容器內的擴增副溶血弧菌的特異性引物對，所述引物對包括: T7引物:序列如SEQ ID NO: 3所示；和 nT7引物:序列如SEQ ID NO: 4所示; 以及使用說明書。
7.如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，還含有選自下組的一種或多種組分: (b)捕獲探針； (C)檢測探針； (d)EV內標序列；和/或 (e)內標檢測探針。
8. 如權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，包括選自下組的一個或多個特征: 所述檢測探針包括如SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列；和/或 所述的捕獲探針包括如SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列；和/或 所述的VP內標序列包括如SEQ ID NO: 7所示的核苷酸序列；和/或 所述的內標檢測探針包括如SEQ ID NO: 6所示的核苷酸序列。
9.一種擴增副溶血弧菌的特異性引物對，其特征在于，所述引物對包括: T7引物:序列如SEQ ID NO: 3所示；和 nT7引物:序列如SEQ ID NO: 4所示。
10.如權利要求6所述的試劑盒或權利要求9所述的引物對的用途，其特征在于，對鮮凍水產品及腌制食品樣品中是否存在副溶血弧菌VP進行定性檢測，和/或 對是否存在副溶血弧菌VP活菌進行判定。
【文檔編號】C12Q1/04GK103571942SQ201310342094
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年8月7日 優先權日:2012年8月7日
【發明者】張長明, 于明輝, 尹華立, 朱鳳, 居金良 申請人:上海仁度生物科技有限公司