用于產生具有生物學活性的分泌型多肽的方法【專利摘要】本發明涉及用于產生具有生物學活性的分泌型多肽的方法。本發明涉及用于生產具有生物學活性的多肽的方法，包括：(a)在有益于生產所述多肽的培養基中培養真菌宿主細胞，其中所述真菌宿主細胞包含可操作相連接的編碼所述多肽的第一多核苷酸與編碼變體信號肽或變體前原肽的第二多核苷酸；和(b)自所述培養液分離所述具有生物學活性的分泌型多肽?！緦＠f明】用于產生具有生物學活性的分泌型多肽的方法[0001]本申請是申請日為2007年7月13日、申請號為“200780033511.1”(國際申請號為“PCT/US2007/073455”)、名稱為“用于產生具有生物學活性的分泌型多肽的方法”的發明申請的分案申請。發明領域[0002]本發明涉及用于產生分泌型多肽(secretedpolypeptide)的方法。本發明還涉及變體信號肽(variantsignalpeptide)或變體前原肽(variantprepropeptide),及包含與編碼多肽的多核苷酸可操作相連接的所述變體信號肽或變體前原肽編碼序列的核酸構建體、載體和宿主細胞。[0003]相關技術的描述[0004]信號肽是以符合讀碼框的方式(inframe)連接至具有生物學活性的多肽的氨基末端并指導所編碼的多肽進入細胞的分泌途徑的氨基酸序列。前原肽指位于多肽的氨基末端的氨基酸序列，其中所得多肽稱為酶原(proenzyme)或多肽原(propolypeptide),或者在有些情況中稱為酶原(zymogen)。多肽原一般是沒有活性的，而且可以通過催化性地或自身催化性地自多肽原切割掉前肽(propeptide)而轉變成成熟的、有活性的多肽。若多肽的氨基末端存在有信號肽和前肽兩個區，則前肽區以符合讀碼框的方式連接至多肽的氨基末端，而信號肽區以符合讀碼框的方式連接至前肽區的氨基末端。[0005]特定宿主細胞中感興趣的重組多肽的分泌可能要求將其天然信號肽替換成與所選擇的宿主細胞相容的新信號肽。另外，多肽的前肽序列可能還需要用不同前肽序列替換或缺失，因為前肽序列沒有得到宿主細胞的加工或者得到宿主細胞的不正確加工，而前肽序列需要得到宿主細胞的正確加工才能分泌活性多肽。在其它情況中，可以不存在信號肽和/或前肽。[0006]通過突變來修飾與多肽天然相關的天然信號肽或天然前原肽從而改善感興趣多肽的分泌可以是有可能的。[0007]Belin等，2004，JournalofMolecularBiology335:437-453描述了改善纖溶酶原激活物抑制物2(PAI_2)信號序列的功能活性的突變。Tsuchiya等，2003,NucleicAcidsResearchSupplementN0.3，pp.262-262描述了用于在酵母中有效分泌人溶菌酶的信號序列的突變。Nothwehr和Gordon,1990，TheJournalofBiologicalChemistry265:17202-17208描述了人前(A原)載脂蛋白A-1I信號肽氨基末端區中影響信號肽酶對其切割的位點的結構特征。Ngsee和Smith,1990,Gene86:251-255描述了酵母中的有效分泌所需的牛促乳素(bovineprolactin)信號肽中的變化。[0008]美國專利N0.5，766，912披露了來自細毛嗜熱霉(ThermomycesIanuginosus)的全長野生型脂肪酶的克隆過程和序列，所述脂肪酶包含前原肽序列。美國專利N0.5，869，438披露了來自細毛嗜熱霉的全長野生型脂肪酶的變體。[0009]本領域需要改進的信號肽和前肽序列用于各種宿主細胞中活性多肽的分泌。[0010]本發明的一個目的是提供使用變體信號肽或變體前原肽在真菌宿主細胞中產生多肽的改進的方法。[0011]發明概述[0012]本發明涉及用于產生具有生物學活性的分泌型多肽的方法，其包括:[0013](a)在有益于產生所述多肽的培養基中培養真菌宿主細胞，其中所述真菌宿主細胞包含編碼所述多肽的第一多核苷酸，所述第一多核苷酸與編碼選自下組的變體信號肽或變體前原肽的第二多核苷酸可操作連接:[0014](i)在與SEQIDNO:2氨基酸1_17的第2位對應的位置處包含取代的親本信號肽變體，其中所述變體信號肽以符合讀碼框的方式連接至所述多肽的氨基末端；[0015](ii)在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的一個或多個(幾個、數個)位置包含缺失的親本前原肽變體，其中所述變體肽以符合讀碼框的方式連接至所述多肽的氨基末端；[0016](iii)在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第2位對應的位置處包含取代的親本前原肽變體，其中所述變體前原肽以符合讀碼框的方式連接至所述多肽的氨基末端；和[0017](iv)在與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第2位對應的位置處包含取代且在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的一個或多個(幾個、數個)位置處包含缺失的親本前原肽變體；并[0018](b)自所述培養基分離所述具有生物學活性的分泌型多肽。[0019]本發明還涉及編碼變體信號肽和變體前原肽的分離的多核苷酸，及包含與編碼多肽的多核苷酸可操作相連接的編碼所述變體信號肽和所述變體前原肽的多核苷酸的構建體、載體和真菌宿主細胞。[0020]具體地，本發明涉及以下各項:[0021]1.一種用于產生具有生物學活性的分泌型多肽的方法，其包括:[0022](a)在有益于產生所述多肽的培養基中培養真菌宿主細胞，其中所述真菌宿主細胞包含編碼所述多肽的第一多核苷酸，所述第一多核苷酸與編碼選自下組的變體信號肽或變體前原肽的第二多核苷酸可操作連接:[0023](i)在與SEQIDNO:2氨基酸1_17的第2位對應的位置處包含取代的親本信號肽變體，其中所述變體信號肽以符合讀碼框的方式連接至所述多肽的氨基末端；[0024](ii)在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的一個或多個位置處包含缺失的親本前原肽變體，其中所述變體肽以符合讀碼框的方式連接至所述多肽的氨基末端；[0025](iii)在與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第2位對應的位置處包含取代的親本前原肽變體，其中所述變體前原肽以符合讀碼框的方式連接至所述多肽的氨基末端；和[0026](iv)在與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第2位對應的位置處包含取代且在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的一個或多個位置處包含缺失的親本前原肽變體，其中所述變體肽以符合讀碼框的方式連接至所述多肽的氨基末端；和[0027](b)自所述培養基分離所述具有生物學活性的分泌型多肽。[0028]2.項I的方法，其中所述親本信號肽或前原肽選自下組:[0029](a)所述親本信號肽或前原肽分別與SEQIDNO:2氨基酸1_17或SEQIDNO:2氨基酸1-22具有優選至少70%同一性、更優選至少75%同一性、更優選至少80%同一性、甚至更優選至少85%同一丨丨生、最優選至少90%同一丨丨生和甚至最優選至少95%同一丨丨生；[0030](b)所述親本信號肽或前原肽由包含如下核苷酸序列的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列分別與SEQIDNO:1核苷酸1-51或SEQIDNO:1核苷酸1_66具有優選至少70%同一性、更優選至少75%同一性、更優選至少80%同一性、甚至更優選至少85%同一性、最優選至少90%同一性；和[0031](c)所述親本信號肽或前原肽由包含如下核苷酸序列的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列在嚴格條件下分別與SEQIDNO:1核苷酸1-51或SEQIDNO:1核苷酸1_66或者它們的互補鏈發生雜交，其中所述嚴格條件定義為在比計算的10°C的溫度在0.9MNaCl,0.09MTris-HClpH7.6，6mMEDTA,0.5%NP-40,IXDenhardt氏溶液，ImM焦磷酸鈉，ImM磷酸二氫鈉，0.1mMATP,和0.2mg/ml酵母RNA中進行預雜交、雜交和雜交后洗滌，并在比計算的Tm低5°C到10°C的溫度在6XSCC加0.1%SDS中洗滌一次15分鐘和使用6XSSC洗滌兩次各15分鐘。[0032]3.項I的方法，其中所述親本信號肽包含SEQIDNO:2氨基酸1_17或其保留指導多肽進入細胞的分泌途徑以分泌具有生物學活性的多肽的能力的肽片段，或者由它們組成；且其中所述親本前原肽包含SEQIDNO:2氨基酸1-22或其保留指導多肽進入細胞的分泌途徑以分泌具有生物學活性的多肽的能力的肽片段，或者由它們組成。[0033]4.項I的方法，其中在與SEQIDNO:2氨基酸1_17的第2位對應的位置處包含取代的所述親本信號肽變體選自下組:[0034](a)在與SEQIDNO:2氨基酸1-17的第2位對應的位置處包含用Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys>Met>Phe>Pro、Ser>Thr>Trp>Tyr、或Val取代的變體信號肽；[0035](b)在與SEQIDNO:2氨基酸1-17的第2位對應的位置處包含Lys作為取代的變體信號肽；[0036](c)在與SEQIDNO:2氨基酸1_17的第2位對應的位置處包含取代R2K的變體信號肽；和[0037](d)包含SEQIDNO:2氨基酸1_17的取代R2K或由其組成的變體信號肽。[0038]5.項I的方法，其中在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的一個或多個位置處包含缺失的所述親本前原肽變體選自下組:[0039](a)在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的一個或多個位置處包含Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr>Trp>Tyr、或Val缺失的變體前原肽；[0040](b)在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的位置處包含缺失的變體前原肽；[0041](c)在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的位置處包含Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val缺失的變體前原肽；[0042](d)在分別與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的位置處包含Ser、Pro、lie、Arg和Arg的一個或多個缺失的變體前原肽；[0043](e)在分別與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的位置處包含Ser、Pro、lie、Arg和Arg缺失的變體前原肽；[0044](f)包含SEQIDNO:2氨基酸1-22中S18*、P19*、I20*、R21*和R22*的一個或多個缺失的變體前原肽；和[0045](g)包含SEQID勵:2氨基酸1-22的S18*、P19*、I20*、R21*和R22*的缺失或由其組成的變體前原肽。[0046]6.項I的方法，其中在與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第2位對應的位置處包含取代的所述親本前原肽變體選自下組:[0047](a)在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第2位對應的位置處包含用Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys>Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代的變體前原肽；[0048](b)在與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第2位對應的位置處包含Lys取代的變體前原肽；[0049](c)在與前原肽SEQIDNO:2氨基酸1_22的第2位對應的位置處包含R2K取代的變體；[0050](d)包含SEQIDNO:2氨基酸1_22的R2K取代或由其組成的變體前原肽。[0051]7.項I的方法，其中在與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第2位對應的位置處包含取代且在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的一個或多個位置處包含缺失的所述親本前原肽變體選自下組:[0052](a)在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第2位對應的位置處包含用Ala、Arg、Asn、Asp、Cys>Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys>Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代且在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的一個或多個位置處包含Ala、Arg、Asn、Asp、Cys>Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys>Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val缺失的變體前原肽；[0053](b)在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第2位對應的位置處包含取代且在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的位置處包含缺失的變體前原肽；[0054](c)在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第2位對應的位置處包含用Ala、Arg、Asn、Asp、Cys>Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代且在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的位置處包含Ala、Arg、Asn、Asp、Cys>Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val缺失的變體前原肽；[0055](d)在與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第2位對應的位置處包含Lys作為取代且在分別與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的位置處包含Ser、Pro、lie、Arg和Arg的一個或多個缺失的變體前原肽；[0056](e)在與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第2位對應的位置處包含Lys作為取代且在分別與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的位置處包含Ser、Pro、lie、Arg和Arg缺失的變體前原肽；[0057](f)在與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第2位對應的位置處包含R2K取代且在分別與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的位置處包含S18*、P19*、120*、R21*和R22*缺失的變體前原肽；[0058](g)包含SEQIDNO:2氨基酸1-22的R2K取代且包含SEQIDNO:2氨基酸1-22的S18'P19'120'R21*和R22*中一個或多個缺失的變體前原肽；[0059](h)包含SEQIDNO:2氨基酸1-22的R2K取代且包含SEQIDNO:2氨基酸1-22的S18'P19'120'R21*和R22*缺失或由其組成的變體前原肽。[0060]8.項I的方法，其中所述變體信號肽是SEQIDNO:4或所述變體前原肽是SEQIDN0:6。[0061]9.項I的方法，其中所述多肽是激素或激素變體、酶、受體或其部分、抗體或其部分、或報道物。[0062]10.項I的方法，其中所述真菌宿主細胞是絲狀真菌或酵母細胞。[0063]11.項I的方法，其中所述第一多核苷酸編碼包含SEQIDN0:8之成熟多肽的多肽。[0064]12.項I的方法，其中所述第一多核苷酸是SEQIDNO:7之成熟多肽編碼序列。[0065]13.項I的方法，其中所述第一多核苷酸編碼包含SEQIDNO:10之成熟多肽的多肽。[0066]14.項I的方法，其中所述第一多核苷酸是SEQIDNO:9之成熟多肽編碼序列。[0067]15.一種分泌型多肽，其是通過項1-14任一項的方法獲得的。[0068]16.項15的分泌型多肽，其包含SEQIDNO:8或SEQIDNO:10之成熟多肽。[0069]17.在與SEQIDNO:2氨基酸1_17的第2位對應的位置處包含取代的親本信號肽變體，其選自下組:[0070](a)在與SEQIDNO:2氨基酸1-17的第2位對應的位置處包含用Ala、Arg、Asn、Asp、Cys>Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys>Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代的變體信號肽；[0071](b)在與SEQIDNO:2氨基酸1-17的第2位對應的位置處包含Lys作為取代的變體信號肽；[0072](c)在與SEQIDNO:2氨基酸1_17的第2位對應的位置處包含R2K取代的變體信號肽；和[0073](d)包含SEQIDNO:2氨基酸1_17的R2K取代或由其組成的變體信號肽。[0074]18.一種親本信號前原肽變體，其中所述變體選自下組:[0075](a)在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的一個或多個位置處包含缺失的變體前原肽；[0076](b)在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第2位對應的位置處包含取代的變體前原肽；和[0077](c)在與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第2位對應的位置處包含取代且在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的一個或多個位置處包含缺失的變體前原肽。[0078]19.在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的一個或多個位置處包含缺失的項18的變體前原肽，其選自下組:[0079](a)在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的一個或多個位置處包含Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser>Thr>Trp>Tyr或Val缺失的變體前原肽；[0080](b)在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的位置處包含缺失的變體前原肽；[0081](c)在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的位置處包含Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val缺失的變體前原肽；[0082](d)在分別與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的位置處包含Ser、Pro、lie、Arg和Arg中一個或多個缺失的變體前原肽；[0083](e)在分別與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的位置處包含Ser、Pro、lie、Arg和Arg缺失的變體前原肽；[0084](f)分別在SEQID勵:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22處包含318*、？19*、120'R21*和R22*的一個或多個缺失的變體前原肽；和[0085](g)包含SEQID勵:2氨基酸1-22的318*、？19*、120*、1?21*和1?22*缺失或由其組成的變體前原肽。[0086]20.在與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第2位對應的位置處包含取代的項18的變體前原肽，其選自下組:[0087](a)在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第2位對應的位置處包含用Ala、Arg、Asn、Asp、Cys>Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys>Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代的變體前原肽；[0088](b)在與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第2位對應的位置處包含Lys作為取代的變體前原肽；[0089](c)在與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第2位對應的位置處包含R2K取代的變體前原肽；和[0090](d)包含SEQIDNO:2氨基酸1_22的R2K取代或由其組成的變體前原肽。[0091]21.在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第2位對應的位置處包含取代且在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的ー個或多個位置處包含缺失的項18的變體前原肽，其選自下組:[0092](a)在與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第2位對應的位置處包含用Ala、Arg、Asn、Asp、Cys>Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys>Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代且在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的ー個或多個位置處包含Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val缺失的變體前原肽；[0093](b)在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第2位對應的位置處包含取代且在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的位`置處包含缺失的變體前原肽；[0094](c)在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第2位對應的位置處包含用Ala、Arg、Asn、Asp、Cys>Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys>Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代且在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的位置處包含Ala、Arg、Asn、Asp、Cys>Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys>Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val缺失的變體前原肽；[0095](d)在與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第2位對應的位置處包含Lys作為取代且在分別與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的位置處包含Ser、Pro、lie、Arg和Arg的一個或多個缺失的變體前原肽；[0096](e)在與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第2位對應的位置處包含Lys作為取代且在分別與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的位置處包含Ser、Pro、lie、Arg和Arg缺失的變體前原肽；[0097](f)在與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第2位對應的位置處包含R2K取代且在分別與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的位置處包含S18*、P19*、120*、R21*和R22*缺失的變體前原肽；[0098](g)包含SEQIDNO:2氨基酸ト22的R2K取代且包含SEQIDNO:2氨基酸ト22的S18'P19'120'R21*和R22*中一個或多個缺失的變體前原肽；和[0099](h)包含SEQIDNO:2氨基酸ト22的R2K取代且包含SEQIDNO:2氨基酸ト22的S18'P19'120'R21*和R22*缺失或由其組成的變體前原肽。[0100]22.ー種信號肽，其包含SEQIDNO:4之氨基酸序列或由其組成。[0101]23.一種分離的多核苷酸,其編碼項22的信號肽。[0102]24.ー種前原肽，其包含SEQIDNO:6之氨基酸序列或由其組成。[0103]25.一種分離的多核苷酸,其編碼項24的前原肽。[0104]26.ー種核酸構建體，其包含項23或25的多核苷酸。[0105]27.項26的核酸構建體，其中所述編碼信號肽或前原肽的多核苷酸與編碼多肽的第二多核苷酸可操作連接，其中所述信號肽多核苷酸或所述前原肽多核苷酸的3'端緊挨著位于所述第二多核苷酸的起始密碼子的上游。[0106]28.一種重組表達載體，其包含項27的核酸構建體。[0107]29.一種重組宿主細胞，其包含項27的核酸構建體。[0108]30.一種分離的分泌型多肽，其具有由編碼包含SEQIDN0:8或SEQIDNO:10之成熟多肽序列的多肽的多核苷酸編碼的脂肪酶活性，所述多核苷酸與編碼項17或22的變體信號肽的信號肽編碼序列可操作連接，其中由所述信號肽編碼序列編碼的所述變體信號肽在所述多肽分泌時自全長多肽上切割下來。[0109]31.一種分離的分泌型多肽，其具有由編碼包含SEQIDN0:8或SEQIDNO:10之成熟多肽序列的多肽的多核苷酸編碼的脂肪酶活性，所述多核苷酸與項18-21和24中任一項的前原肽編碼序列可操作連接，其中由所述前原肽編碼序列編碼的所述變體前原肽在所述多肽分泌時自全長多肽上切割下來。[0110]附圖簡述[0111]圖1顯示了pBM128a的限制性圖譜。[0112]圖2顯示了pMB1537的限制性圖譜。[0113]圖3顯示了pBM126a的限制性圖譜。[0114]圖4顯示了pMB1539的限制性圖譜。[0115]圖5顯示了pJLinl68的限制性圖譜。[0116]圖6顯示了pBM142c的限制性圖譜。[0117]圖7顯示了pBM143b的限制性圖譜。[0118]圖8顯示了pJLinl68轉化體的平均相對脂肪酶活性。[0119]圖9顯示了pBM143b轉化體的平均相對脂肪酶活性。[0120]圖10顯示了pMB1682的限制性圖譜。[0121]圖11顯示了pJLinl95的限制性圖譜。[0122]圖12顯示了pBM143b和pJLinl95轉化體的平均相對脂肪酶活性。[0123]圖13顯示了搖瓶中的pBM143b轉化體的平均相對脂肪酶活性。[0124]圖14顯示了pJLinl87的限制性圖譜。[0125]圖15顯示了pBM121b的限制性圖譜。[0126]圖16顯示了pBM120a的限制性圖譜。[0127]圖17顯示了pJMS7的限制性圖譜。[0128]圖18顯示了pJMS6的限制性圖譜。[0129]圖19顯示了pJMS6和pJMS7轉化體第3天培養液的相對脂肪酶活性。[0130]圖20顯示了pJMS6、pJMS7和質粒TB5轉化體第3天培養液的相對脂肪酶活性。[0131]圖21顯示了pJMS6和質粒TB6轉化體第4天培養液的相對脂肪酶活性。[0132]定義[0133]全長多肽:術語“全長多肽”在本申請中定義為具有生物學活性的多肽的前體形式，其中所述前體包含信號肽，或者還包含前肽，其中在從細胞分泌吋，所述信號肽被切割棹，或者所述前肽也被切割棹，從而產生具有生物學活性的多肽。[0134]信號肽:術語“信號肽”在本申請中定義為以符合讀碼框的方式連接(融合)至具有生物學活性的多肽的氨基末端且指導所述多肽進入細胞的分泌途徑的肽。前肽可以存在于信號肽與多肽氨基末端之間(見下文前原肽定義)。[0135]前肽:術語“前肽”指以符合讀碼框的方式連接(融合)至多肽的氨基末端的氨基酸序列，其中所得多肽稱為酶原或多肽原(或在有些情況中稱為酶原(zymogen))。多肽原一般是沒有活性的，而且可以通過催化性地或自身催化性地從多肽原切割掉前肽而轉變成成熟的、有活性的多肽。[0136]前原肽:術語“前原肽”在本申請中定義為存在于多肽的氨基末端的信號肽和前肽，其中前肽以符合讀碼框的方式連接(或融合)至多肽的氨基末端，而信號肽區以符合讀碼框的方式連接(或融合)至前肽區的氨基末端。[0137]信號肽編碼序列:術語“信號肽編碼序列”在本申請中定義為編碼信號肽的多核苷酸。[0138]前肽編碼序列:術語“前肽編碼序列”在本申請中定義為包含前肽的多核苷酸。[0139]前原肽編碼序列:術語“前原肽編碼序列”在本申請中定義為編碼前原肽的多核苷酸。[0140]野生型信號肽:術語“野生型信號肽”指由天然存在的微生物(如在自然界中找到的酵母或絲狀真菌)所表達的信號肽。[0141]親本信號肽:術語“親本信號肽”在用于本申請時指將要進行修飾(例如一處或多處取代、ー處或多處插入、一處或多處缺失和/或ー處或多處截短)以生成本發明的信號肽變體的信號肽。該術語還指變體與之進行比較和比對的信號肽。親本可以是天然存在(野生型)信號肽，或者它甚至可以是其通過任何合適手段制備的變體。例如，親本信號肽可以是天然存在信號肽的變體，其在氨基酸序列中得到了修飾或改變。親本信號肽也可以是等位變體，即由占據相同染色體基因座的多核苷酸序列的兩種或更多可變形式之任一所編碼的信號肽。[0142]野生型前原肽:術語“野生型前原肽”指由天然存在的微生物(如在自然界中找到的酵母或絲狀真菌)所表達的前原肽。[0143]親本前原肽:術語“親本前原肽”在用于本申請時指將要進行修飾(例如ー處或多處取代、ー處或多處插入、一處或多處缺失和/或ー處或多處截短)以產生本發明的前原肽變體的前原肽。該術語還指變體與之進行比較和比對的前原肽。親本可以是天然存在的(野生型)前原肽，或者它甚至可以是其通過任何合適手段制備的變體。例如，親本前原肽可以是天然存在的前原肽的變體，其在氨基酸序列中得到了修飾或改變。親本前原肽也可以是等位變體，即由占據相同染色體基因座的多核苷酸序列的兩種或更多可變形式之任一所編碼的前原肽。[0144]變體:術語“變體”在本申請中定義為包含ー處或多處(幾處、數處)改變(如在肽或多肽的ー個或多個(幾個、數個)特定位置處包含ー個或多個(幾個、數個)特定氨基酸殘基的取代、插入、缺失和/或截短)的肽或多肽。[0145]變體信號肽:術語“變體信號肽”在本申請中定義為親本信號肽的如下信號肽，其中變體信號肽包含ー處或多處(幾處、數處)改變，如在信號肽的ー個或多個(幾個、數個)特定位置處包含ー個或多個(幾個、數個)特定氨基酸殘基的取代、插入、缺失和/或截短。[0146]變體前原肽:術語“變體前原肽”在本申請中定義為親本前原肽的如下前原肽，其中變體前原肽包含ー處或多處(幾處、數處)改變，如在前原肽的ー個或多個(幾個、數個)特定位置處包含ー個或多個(幾個、數個)特定氨基酸殘基的取代、插入、缺失和/或截短。[0147]可操作連接:術語“可操作連接”在本申請中指其中控制序列置于相對于多核苷酸序列的編碼序列的適當位置使得控制序列指導多肽編碼序列的表達的構造(,configuration)。[0148]表達:術語“表達”包括多肽產生中所涉及的任何步驟，包括但不限于轉錄、轉錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。[0149]編碼序列:術語“編碼序列”在本申請中定義為當置于適當控制序列的控制下時轉錄成mRNA(該mRNA又翻譯成多肽)的多核苷酸序列。編碼序列的邊界一般由位于H1RNA5'端開放閱讀框開始處的起始密碼子和位于mRNA開放閱讀框3'端的終止密碼子決定。編碼序列可以包括但不限于基因組DNA、cDNA、半合成的、合成的和重組的核苷酸序列。[0150]多肽編碼序列的5'端可以包含以符合翻譯讀碼框的方式與編碼序列中編碼多肽的區段天然連接的天然信號肽編碼區或天然前原肽編碼區?；蛘撸嚯木幋a序列的5'端可以缺乏天然信號肽編碼區或天然前原肽編碼區。[0151]成熟多肽:術語“成熟多肽”在本申請中定義為在翻譯和任何翻譯后修飾(如N端加工、C端截短、糖基化、磷酸化等)之后以其最終形式具有生物學活性的多肽。[0152]成熟多肽編碼序列:術語“成熟多肽編碼序列”在本申請中定義為編碼具有生物學活性的成熟多肽的多核苷酸序列。[0153]發明詳述[0154]本發明涉及用于產生具有生物學活性的多肽的方法，其包括:(a)在有益于產生所述多肽的培養基中培養真菌宿主細胞，其中所述真菌宿主細胞包含編碼所述多肽的第一多核苷酸，所述第一多核苷酸與編碼選自下組的變體信號肽或變體前原肽的第二多核苷酸可操作連接:(i)在與SEQIDNO:2氨基酸1_17的第2位對應的位置處包含取代的親本信號肽變體，其中所述變體信號肽以符合讀碼框的方式連接至所述多肽的氨基末端；(ii)在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的ー個或多個(幾個、數個)位置處包含缺失的親本前原肽變體，其中所述變體前原肽以符合讀碼框的方式連接至所述多肽的氨基末端；(iii)在與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第2位對應的位置處包含取代的親本前原肽變體，其中所述變體前原肽以符合讀碼框的方式連接至所述多肽的氨基末端；和(iv)在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第2位對應的位置處包含取代且在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的ー個或多個(幾個、數個)位置處包含缺失的親本前原肽變體；和(b)從所述培養基分離所述具有生物學活性的分泌型多肽。[0155]在本發明的產生方法中，使用本領域已知的方法在適合于產生所述多肽的營養培養基中培養所述真菌宿主細胞。例如，可以通過在合適培養基中和在允許所述多肽表達和/或分離的條件下進行的實驗室或エ業發酵罐中的搖瓶培養或者小規模或大規模發酵(包括連續的、分批的、補料分批的或固態發酵)來培養細胞。使用本領域已知的規程在合適的營養培養基中進行培養，所述營養培養基包含碳源和氮源和無機鹽。合適的培養基能夠從商業供應商獲得或可以根據公開的組成制備(例如，在美國典型培養物保藏中心的目錄中)。[0156]可以使用本領域已知的、對于所述多肽是特異性的方法來檢測具有生物學活性的多肽。這些檢測方法可以包括特異性抗體的使用、高效液相層析、毛細管層析、酶產物的形成、酶底物的消失、或SDS-PAGE。例如，若所述多肽是酶，則可以使用酶測定法(enzymeassay)來測定所述酶的活性。用于測定酶活性的規程，對于許多酶是本領域已知的(參見例如D.Schomburg和M.Salzmann(編),EnzymeHandbook,Springer-Verlag,NewYork,1990)。`[0157]在本發明的方法中，在同樣的產生條件下培養時，真菌細胞優選相對于包含與編碼多肽的多核苷酸序列可操作連接的天然信號肽編碼序列或天然前原肽編碼序列的真菌細胞產生多至少約25%、更優選多至少約50%、更優選多至少約75%、更優選多至少約100%、甚至更優選多至少約200%、最優選多至少約300%和甚至最優選多至少約400%的多肽。[0158]所得分泌的且活化的多肽可以通過本領域已知的方法從培養基直接回收。例如，所述多肽可以通過常規方法從營養培養基回收，所述常規方法包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發、或沉淀。[0159]具有生物學活性的多肽可以通過本領域已知的多種方法來純化，所述方法包括但不限于層析(例如離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如制備性等電聚焦)、差別溶解度(例如硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE、或提取(參見例如ProteinPurification,J.-C.Janson和LarsRyden,編者，VCHPublishers,NewYork,1989)。[0160]變體的設計規則[0161]在本發明中，信號肽變體和前原肽變體中采用了氨基酸殘基位置的特定編號方式。例如，通過比對已知的信號肽或前原肽序列的氨基酸序列，有可能給任何信號肽或前原肽序列中的任何氨基酸殘基指定氨基酸位置編號。[0162]例如，使用源自SEQIDNO:2中披露的脂肪酶氨基酸序列的編號系統，并與許多其它脂肪酶或其它酶的氨基酸序列比對，有可能指出信號肽或前原肽區中具有結構同源性的區域中氨基酸殘基的位置。[0163]蛋白質序列的多重比對可以使用例如“ClustalW”(Thompson,J.D.,Higgins,D.G.和Gibson,T.J.，1994，CLUSTALW:1mprovingthesensitivityofprogressivemultiplesequencealignmentthroughsequenceweighting,positions—speciiicgappenaltiesandweightmatrixchoice,NucleicAcidsResearch22:4673-4680)來進打。DNA序列的多重比對可以使用蛋白質比對為模板來進行，即用來自DNA序列的相應密碼子替換氨基酸。[0164]常用的成對序列比較算法足以檢測分歧不超過約20-30%序列同一性這點的蛋白質序列之間的相似性(Doolittle,1992,ProteinSc1.1:191-200;Brenner等，1998，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA95,6073-6078)。然而，具有相同折疊模式(fold)和相似的生物學功能的真正的同源蛋白分岐常常達到這樣的點，即傳統的基于序列的比較未能檢測出它們的相關性(Lindahl和Elofsson,2000，J.Mol.Biol.295:613-615)?；谛蛄械乃阉髦懈蟮撵`敏度可以使用利用蛋白質家族的概率表現(probabilisticrepresentation)(序型(profile))來搜索數據庫的搜索程序來獲得。例如，PS1-BLAST程序通過疊代(iterative)數據庫搜索方法來生成序型，而且能夠檢測關系疏遠的同源物(remotehomolog)(Atschul等，1997，NucleicAcidsRes.25:3389-3402)。若感興趣蛋白質的家族或超家族在蛋白質結構數據庫中具有ー個或多個代表，則可以實現甚至更大的靈敏度。如GenTHREADER(Jones1999,J.Mol.Biol.287:797-815;McGuffin和Jones,2003,Bioinformatics19:874-881)的程序利用來自多個來源的信息(PS1-BLAST、ニ級結構預測、結構比對序型和溶劑化勢(solvationpotential))作為預測查詢序列之結構折疊模式的神經網絡的輸入。類似的，可以使用Gough等，2000，J.Mo1.Biol.313:903-919的方法將結構未知的序列與SCOP數據庫中存在的超家族模型進行比對。這些比對又可用于產生感興趣蛋白質的同源性模型，而且可以使用就該目的而開發的多種工具來評估此類模型的精確性。[0165]對于結構已知的蛋白質，數個工具和來源可用于獲取和生成結構比對。例如，對蛋白質的SCOP超家族進行了結構比對，而旦那些比對是可獲得的和可下載的。這些比對可用于預測同一結構超家族內的蛋白質中結構上和功能上對應的氨基酸殘基。該信息，與由同源性建模和序型捜索得到的信息一起，可用于預測當感興趣突變自ー種蛋白質移至接近的或疏遠的同源物時突變哪些殘基。[0166]在描述本發明的各種信號肽變體或前原肽變體時，使下文所述命名法適應于方便提及。在所有情況中，采用公認的IUPAC單字母或三字母氨基酸縮寫。[0167]取也。對于氨基酸取代，使用如下命名法:初始的氨基酸，位置，取代后的氨基酸。因而，第2位精氨酸取代成賴氨酸表述成“Arg2Lys”或“R2K”。[0168]跡失。對于氨基酸缺失，使用如下命名法:初始氨基酸，位置'因而，缺失第18位絲氨酸表述成“Ser18*”或“S18*”。[0169]通入。對于氨基酸插入，使用如下命名法:初始氨基酸，位置，初始氨基酸，新插入的氨基酸。因而，在第17位谷氨酸后插入賴氨酸表述成“Glyl7GlyLys”或“G17GK”。[0170]親本信號肽和前原肽[0171]在本發明中，親本信號肽或前原肽可以是分別與SEQIDNO:2氨基酸1-17或SEQIDN0:2氨基酸1-22具有至少70%同一性的任何信號肽或前原肽；其由包含如下多核苷酸或由如下多核苷酸組成的多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含分別與SEQIDN0:1核苷酸1-51或SEQIDNO:1核苷酸1-66或它們的互補鏈具有至少70%同一性的核苷酸序列；或由包含如下核苷酸序列或由如下核苷酸序列組成的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列在嚴格條件下分別與SEQIDNO:1核苷酸1-51或SEQIDNO:1核苷酸1_66或它們的互補鏈發生雜父。[0172]在第一個方面，親本信號肽或前原肽分別與SEQIDNO:2氨基酸1-17或SEQIDNO:2氨基酸1-22具有至少約70%、優選至少約75%、更優選至少約80%、更優選至少約85%、甚至更優選至少約90%、最優選至少約95%和甚至最優選至少約96%、97%、98%、或99%同一性程度，其具有指導多肽進入細胞的分泌途徑以分泌具有生物學活性的多肽的能力(下文“同源肽”)。[0173]在另ー個優選的方面，同源親本信號肽、前肽、或前原肽具有分別與SEQIDN0:2氨基酸1-17或SEQIDNO:2氨基酸1-22差別為5個氨基酸、優選4個氨基酸、更優選3個氨基酸、甚至更優選2個氨基酸和最優選I個氨基酸的氨基酸序列。就本發明而言，兩條氨基酸序列之間的同一‘性程度通過Clustal方法(Higgins,1989,CABIOS5:15ト153)來測定，其中使用LASERGENE?MEGALIGN?軟件(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)及同一性表和如下多重比對參數:缺ロ罰分為10，缺ロ長度罰分為10。配對比對參數為Ktuple(K元組)=1，缺ロ罰分=3,窗=5,對角線=5。[0174]在另ー個優選的方面，親本信號肽或前原肽分別包含SEQIDNO:2氨基酸1-17或SEQIDN0:2氨基酸1-22或它們的片段，其具有指導多肽進入細胞的分泌途徑以分泌具有生物學活性的多肽的能力。在ー個更優`選的方面，親本信號肽或前原肽分別包含SEQIDNO:2氨基酸1-17或SEQIDN0:2氨基酸1_22。在另ー個優選的方面，親本信號肽或前原肽分別由SEQIDNO:2氨基酸1-17或SEQIDNO:2氨基酸1_22或它們的片段組成，其具有指導多肽進入細胞的分泌途徑以分泌具有生物學活性的多肽的能力。在另ー個更優選的方面，親本信號肽或前原肽分別由SEQIDNO:2氨基酸1-17或SEQIDN0:2氨基酸1_22組成。[0175]本發明還涵蓋包含如下核苷酸序列或由如下核苷酸序列組成的多核苷酸，所述核苷酸序列編碼分別具有SEQIDNO:2氨基酸1-17或SEQIDNO:2氨基酸1_22之氨基酸序列的親本信號肽或前原肽，由于遺傳密碼子的簡并性，它們分別與SEQIDN0:1核苷酸1-51或SEQIDNO:1核苷酸1-66有差別。本發明還涉及SEQIDNO:1核苷酸1_51或SEQIDNO:1核苷酸1-66的子序列，所述子序列分別編碼SEQIDNO:2氨基酸1_17或SEQIDNO:2氨基酸1-22的片段，其具有指導多肽進入細胞的分泌途徑以分泌具有生物學活性的多肽的能力。[0176]SEQIDNO:1核苷酸1-51或SEQIDNO:1核苷酸1-66的子序列指由SEQIDNO:1核苷酸1-51或SEQIDNO:1核苷酸1-66所涵蓋的核酸序列，只是ー個或多個(幾個、數個)核苷酸已經自5'和/或3'端缺失。SEQIDNO:2氨基酸1-17或SEQIDNO:2氨基酸1-22的片段是自該氨基酸序列的氨基和/或羧基末端缺失ー個或多個(幾個、數個)氨基酸的妝。[0177]在第二個方面，親本信號肽或前原肽由包含如下核苷酸序列的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列分別與SEQIDNO:1核苷酸1-51或SEQIDNO:1核苷酸1_66具有至少約70%、優選至少約75%、更優選至少約80%、更優選至少約85%、甚至更優選至少約90%、最優選至少約95%和甚至最優選至少約96%、97%、98%、或99%的同一性程度；或SEQIDNO:1核苷酸1-51或SEQIDNO:1核苷酸1-66的等位變體和子序列，所述等位變體和子序列編碼信號肽或前原肽的片段，其具有指導多肽進入細胞的分泌途徑以分泌具有生物學活性的多肽的能力。就本發明而言，兩條核酸序列之間的同一‘丨生程度通過Wilbur-Lipman方法(Wilbur和Lipman,1983，ProceedingsoftheNationalAcademyofScienceUSA80:726-730)來測定，其中使用LASERGENE?MEGALIGN?軟件(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)及同一性表和如下多重比對參數:缺ロ罰分為10，缺ロ長度罰分為10。配對比對參數為K元組=1，缺ロ罰分=3，窗=20。[0178]在第三個方面，親本信號肽或前原肽由包含如下核苷酸序列或由如下核苷酸序列組成的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列在嚴格條件下分別與SEQIDN0:1核苷酸1-51或SEQIDNO:1核苷酸1-66或它們的互補鏈發生雜交(J.Sambrook,E.F.Fritsch,和T.Maniatus,1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,桌2te,ColdSpringHarbor,NewYork)。[0179]SEQIDNO:1核苷酸1_66或其子序列、以及SEQIDNO:2氨基酸1_22或其片段可用于設計核酸探針，用以依照本領域眾所周知的方法自不同屬或種的菌株鑒定和克隆編碼信號肽、前肽、或前原肽的DNA。具體而言，遵循標準的Southern印跡方法，此類探針可用于與感興趣的屬或種的基因組或cDNA雜交，以鑒定和分離其中相應的基因。此類探針可明顯短于完整序列，但長度上應為至少15、優選至少30和更優選至少45個核苷酸。DNA和RNA探針兩者都可使用。通常將探針標記以檢測相應的基因(例如用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)標記)。此類探針涵蓋在本發明中。[0180]如此，可以對自此類其它生物體制備的基因組DNA或cDNA文庫篩選與上文所述探針發生雜交且編碼信號肽或前原肽的DNA。可以通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳或其它分離技術分離來自此類其它生物體的基因組或其它DNA?？梢詫碜晕膸斓腄NA或分離的DNA轉移至硝酸纖維素或其它合適的載體材料并固定于其上。為了鑒定與SEQIDNO:1核苷酸1-51或SEQIDNO:1核苷酸1-66或其子序列同源的克隆或DNA，將所述載體材料用在Sounthern印跡中。就本發明而言，雜交表示核酸序列在本申請中所定義的嚴格條件下與經過標記的核酸探針發生雜交，所述核酸探針對應于SEQIDNO:1核苷酸1-51或SEQIDNO:1核苷酸1-66或它們的互補鏈或其子序列?？墒褂美鏧射線膠片來檢測在這些條件下核酸探針與之發生雜交的分子。[0181]在一個優選的方面，核酸探針是包含如下核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列分別編碼SEQIDNO:2氨基酸1-17或SEQIDNO:2氨基酸1_22之信號肽或前原肽或其子序列。在另ー個優選的方面，核酸探針是SEQIDNO:1核苷酸1-51或SEQIDNO:1核苷酸1-66。[0182]對于長度為約15個核苷酸至約60個核苷酸的短探針，嚴格條件定義為遵循標準的Southern印跡方法在比使用依照Bolton和McCarthy(1962,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA48:1390)的算法計算得出的Tm低5°C到10°C的溫度在0.9MNaCl,0.09MTris-HClpH7.6，6mMEDTA,0.5%NP-40,IXDenhardt氏溶液，ImM焦磷酸鈉，ImM磷酸ニ氫鈉，0.1mMATP,和0.2mg/ml酵母RNA中進行預雜交、雜交和雜交后洗滌，最佳的是12-24小吋。[0183]對于長度為約15個核苷酸至約60個核苷酸的短探針，將載體材料在比計算的Tm低5°C到10°C的溫度在6XSCC加0.1%SDS中洗滌一次15分鐘和使用6XSSC洗滌兩次各15分鐘。[0184]變體信號肽或前原肽[0185]親本信號肽的或親本前原肽的變體可以依照本領域眾所周知的定點誘變方法來制備。定點誘變是一種在編碼親本信號肽或親本前原肽的多核苷酸分子中的指定位點處創建一個或多個突變的技術。該技術可以在體外或在體內實施。[0186]定點誘變可以在體外通過涉及使用包含期望突變的寡核苷酸引物的PCR來實現。定點誘變還可以在體外通過涉及限制酶對質粒中的位點處的切割及隨后在該多核苷酸中連接含有突變的寡核苷酸的盒式誘變來實施，所述質粒包含編碼親本信號肽或親本前原肽的多核苷酸。通常，消化質粒和寡核苷酸的限制酶是相同的，從而容許質粒和插入物的粘末端彼此相連接。參見例如Scherer和Davis,1979,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA76:4949-4955;及Barton等，1990，NucleicAcidsResearch18:7349-4966。[0187]定點誘變可以在體外通過本領域已知的方法來實現。參見例如美國專利申請公開文本2004/0171154;Storici等，2001，NatureBiotechnology19:773-776;Kren等，1998，Nat.Med.4:285-290;及Calissano和Macino,1996，FungalGenet.Newslett.43:15-16。[0188]任何定點誘變方法都可用于本發明。有許多商品化試劑盒可用于制備親本信號肽的或親本前原肽的變體。[0189]在本發明中，親本信號肽的或親本前原肽的變體在與SEQIDN0:2氨基酸1-17的第2位對應的位置處包含取代且在與SEQIDNO:2氨基酸18-22的第18、19、20、21和/或22位對應的位置處包含ー個或多個(幾個、數個)缺失，其中所述變體信號肽或變體前原肽在以符合讀碼框的方式可操作連接(融合)至多肽時指導多肽進入細胞的分泌途徑。在一個優選的方面，變體信號肽或變體前原肽包含分別與SEQIDN0:2氨基酸1-17或SEQIDN0:2氨基酸1-22具有至少70%、優選至少75%、更優選至少80%、更優選至少85%、甚至更優選至少90%、最優選至少95%和甚至最優選至少96%、97%、98%或99%的同一性程度的氨基酸序列。就本發明而言，兩條氨基酸序列之間的同一性程度通過Clustal方法(Higgins,1989，CABIOS5:151-153)來測定，其中使用LASERGENE?MEGALIGN?軟件(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)及同一性表和如下多重比對參數:缺ロ罰分為10，缺ロ長度罰分為10。配對比對參數為K元組=1,缺ロ罰分=3,窗=5,對角線=5。[0190]在一個優選的方面，本發明變體中氨基酸取代的數目優選包含I個取代。在另ー個優選的方面，本發明變體中氨基酸缺失的數目優選包含I個、更優選2個、甚至更優選3個、最優選4個和甚至最優選5個缺失。在另ー個優選的方面，本發明變體中氨基酸取代的數目優選包含I個取代，且本發明變體中氨基酸缺失的數目優選包含I個、更優選2個、甚至更優選3個、最優選4個和甚至最優選5個缺失。[0191]在一個優選的方面，變體信號肽在與SEQIDNO:2氨基酸1-17的第2位對應的位置處包含取代。[0192]在ー個更優選的方面，變體信號肽在與SEQIDNO:2氨基酸1_17的第2位對應的位置處包含用Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser>Thr、Trp、Tyr、或Val進行的取代。[0193]在一個甚至更優選的方面，變體信號肽在與SEQIDNO:2氨基酸1-17的第2位對應的位置處包含Lys作為取代。[0194]在ー個最優選的方面，變體信號肽在與SEQIDNO:2氨基酸1_17的第2位對應的位置處包含R2K取代。[0195]在一個甚至最優選的方面，變體信號肽包含SEQIDNO:2氨基酸1_17的R2K取代形式或由其組成。[0196]在另ー個優選的方面，變體前原肽在與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第18、19、20、21和22位對應的ー個或多個(幾個、數個)位置處包含缺失。[0197]在另ー個優選的方面，變體前原肽在與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第18、19、20、21和22位對應的ー個或多個(幾個、數個)位置處包含Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val的缺失。[0198]在另ー個優選的方面，變體前原肽在與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第18、19、20、21和22位對應的位置處包含多個缺失。[0199]在另ー個優選的方面，變體前原肽在與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第18、19、20、21和22位對應的位置處包含Al`a、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys>Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val的多個缺失。[0200]在另ー個更優選的方面，變體前原肽在分別與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第18、19,20,21和22位對應的位置處包含Ser、Pro、Ile、Arg和Arg的ー個或多個(幾個、數個)缺失。[0201]在另ー個甚至更優選的方面，變體前原肽在分別與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的位置處包含Ser、Pro、lie、Arg和Arg缺失。[0202]在另ー個最優選的方面，變體前原肽包含SEQIDNO:2氨基酸1_22的S18'P19'120'R21*和R22*中ー個或多個(幾個、數個)缺失。[0203]在另ー個甚至最優選的方面，變體前原肽包含SEQIDNO:2的S18'P19'120'R21*和R22*缺失形式或由其組成。[0204]在另ー個優選的方面，變體前原肽在與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第2位對應的位置處包含取代。[0205]在另ー個更優選的方面，變體前原肽在與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第2位對應的位置處包含用Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser>Thr、Trp、Tyr、或Val進行的取代。[0206]在另ー個甚至更優選的方面，變體前原肽在與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第2位對應的位置處包含Lys作為取代。[0207]在另ー個最優選的方面，變體前原肽在與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第2位對應的位置處包含R2K取代。[0208]在另ー個甚至最優選的方面，變體前原肽包含SEQIDNO:2氨基酸1_22的R2K取代形式或由其組成。[0209]在另ー個優選的方面，變體前原肽在與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第2位對應的位置處包含取代且在與SEQIDN0:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的ー個或多個(幾個、數個)位置處包含缺失。[0210]在另ー個更優選的方面，變體前原肽在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第2位對應的位置處包含用Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val進行的取代且在與SEQIDN0:2氨基酸ト22的第18、19、20、21和22位對應的ー個或多個(幾個、數個)位置處包含Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val缺失。[0211]在另ー個甚至更優選的方面，變體前原肽在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第2位對應的位置處包含取代且在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的位置處包含缺失。[0212]在另ー個甚至更優選的方面，變體前原肽在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第2位對應的位置處包含用Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val進行的取代且在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的位置處包含Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys>Met、Phe、Pro、Ser>Thr>Trp>Tyr、或Val缺失。[0213]在另ー個甚至更優選的方面，變體前原肽在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第2位對應的位置處包含Lys作為取代且在分別與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第18、19、20、21和22位對應的位置處包含Ser、Pro、lie、Arg和Arg的ー個或多個(幾個、數個)缺失。[0214]在另ー個甚至更優選的方`面，變體前原肽在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第2位對應的位置處包含Lys取代且在分別與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第18、19、20、21和22位對應的位置處包含Ser、Pro、lie、Arg和Arg缺失。[0215]在另ー個甚至更優選的方面，變體前原肽在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第2位對應的位置處包含R2K取代且在分別與SEQIDN0:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的位置處包含S18*、P19*、120*、R21*和R22*缺失。[0216]在另ー個最優選的方面，變體前原肽包含SEQIDNO:2氨基酸1_22的R2K取代形式且包含SEQIDN0:2氨基酸1-22的S18*、P19*、120*、R21*和R22*中的ー個或多個(幾個、數個)缺失，或由其組成。[0217]在另ー個甚至最優選的方面，變體前原肽包含SEQIDNO:2氨基酸1_22的R2K取代形式且包含SEQID勵:2氨基酸1-22的318*、？19*、120*、1?21*和1?22*缺失，或由其組成。[0218]在另ー個甚至最優選的方面，變體信號肽是SEQIDN0:4。在另ー個甚至最優選的方面，變體信號肽編碼序列是SEQIDN0:3。在另ー個甚至最優選的方面，變體前原肽是SEQIDN0:6。在另ー個甚至最優選的方面，變體前原肽編碼序列是SEQIDN0:5。[0219]本發明的變體可進ー步包含氨基酸序列的ー個或多個(幾個、數個)額外的取代、缺失和/或插入。[0220]多核苷酸[0221]本發明還涉及分別編碼親本信號肽和親本前原肽的變體信號肽和變體前原肽的分離的多核苷酸，其中所述變體信號肽和所述變體前原肽在與SEQIDNO:2氨基酸1-17的第2位對應的位置處包含取代和/或在與SEQIDNO:2氨基酸18-22的第18、19、20、21和/或22位對應的位置處包含ー個或多個(幾個、數個)缺失，其中所述變體信號肽或變體前原肽當以符合讀碼框的方式可操作連接(融合)至多肽時指導該多肽進入細胞的分泌途徑。[0222]親本信號肽或前原肽可以是分別與SEQID勵:2氨基酸1_17或5￡0IDNO:2氨基酸1-22具有至少70%同一‘丨生的任何信號肽或前原肽；由包含如下核苷酸序列或由如下核苷酸序列組成的多核苷酸編碼的任何信號肽或前原肽，所述核苷酸序列分別與SEQIDNO:1核苷酸1-51或SEQIDNO:1核苷酸1-66或它們的互補鏈具有至少70%同一性；或者由包含如下核苷酸序列或由如下核苷酸序列組成的多核苷酸編碼的任何信號肽或前原肽，所述核苷酸序列在嚴格條件下分別與SEQIDNO:1核苷酸1-51或SEQID勵:1核苷酸1_66或它們的互補鏈發生雜交，如本文所述。[0223]在一個優選的方面，分離的多核苷酸編碼包含如下氨基酸序列的變體信號肽或變體前原肽，所述氨基酸序列分別與SEQIDNO:2氨基酸1-17或SEQIDN0:2氨基酸1_22具有至少70%、優選至少75%、更優選至少80%、更優選至少85%、甚至更優選至少90%、最優選至少95%和甚至最優選至少96%、97%、98%、或99%的同一性程度。[0224]在一個優選的方面，分離的多核苷酸編碼在與SEQIDNO:2氨基酸1_17的第2位對應的位置處包含取代的變體信號肽。[0225]在ー個更優選的方面，分離的多核苷酸編碼在與SEQIDNO:2氨基酸1_17的第2位對應的位置處包含Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代的變體信號肽。[0226]在一個甚至更優選的方面，分離的多核苷酸編碼在與SEQID勵:2氨基酸1_17的第2位對應的位置處包含Lys作為取代的變體信號肽。[0227]在ー個最優選的方面，分離的多核苷酸編碼在與SEQIDNO:2氨基酸1_17的第2位對應的位置處包含R2K取代的變體信號肽。[0228]在一個甚至最優選的方面，分離的多核苷酸編碼包含SEQIDN0:2氨基酸1_17的R2K取代形式或由其組成的變體信號肽。[0229]在另ー個優選的方面，變體前原肽在與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第18、19、20、21和22位對應的ー個或多個(幾個、數個)位置處包含缺失。[0230]在另ー個優選的方面，分離的多核苷酸編碼在與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第18、19、20、21和22位對應的ー個或多個(幾個、數個)位置處包含Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser>Thr>Trp>Tyr、或Val缺失的變體前原肽。[0231]在另ー個優選的方面，分離的多核苷酸編碼在與SEQIDN0:2氨基酸1_22的第18、19、20、21和22位對應的位置處包含多個缺失的變體前原肽。[0232]在另ー個優選的方面，分離的多核苷酸編碼在與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第18、19、20、21和22位對應的位置處包含Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val的多個缺失的變體前原肽。[0233]在另ー個更優選的方面，分離的多核苷酸編碼在分別與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第18、19、20、21和22位對應的位置處包含Ser、Pro、Ile、Arg和Arg的ー個或多個(幾個、數個)缺失的變體前原肽。[0234]在另ー個甚至更優選的方面，分離的多核苷酸編碼在分別與SEQIDN0:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的位置處包含Ser、Pro、Ile、Arg和Arg缺失的變體前原肽。[0235]在另ー個最優選的方面，分離的多核苷酸編碼包含SEQIDN0:2氨基酸1_22的S18'P19'I20'R2r和R22*中的ー個或多個(幾個、數個)缺失的變體前原肽。[0236]在另ー個甚至最優選的方面，分離的多核苷酸編碼包含SEQIDNO:2氨基酸1_22的S18'P19'120'R21*和R22*缺失形式或由其組成的變體前原肽。[0237]在另ー個優選的方面，分離的多核苷酸編碼在與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第2位對應的位置處包含取代的變體前原肽。[0238]在另ー個更優選的方面，分離的多核苷酸編碼在與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第2位對應的位置處包含用Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代的變體前原肽。[0239]在另ー個甚至更優選的方面，分離的多核苷酸編碼在與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第2位對應的位置處包含Lys作為取代的變體前原肽。[0240]在另ー個最優選的方面，分離的多核苷酸編碼在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第2位對應的位置處包含R2K取代的變體前原肽。[0241]在另ー個甚至最優選的方面，分離的多核苷酸編碼包含SEQIDNO:2氨基酸1_22的R2K取代或由其組成的變體前原肽。[0242]在另ー個優選的方面，分離的多核苷酸編碼在與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第2位對應的位置處包含取代且在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的ー個或多個(幾個、數個)位置處包含缺失的變體前原肽。[0243]在另ー個更優選的方面，分離的多核苷酸編碼在與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第2位對應的位置處包含用Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代且在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的ー個或多個(幾個、數個)位置處包含Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val缺失的變體前原肽。[0244]在另ー個甚至更優選的方面，分離的多核苷酸編碼在與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第2位對應的位置處包含取代且在與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第18、19、20、21和22位對應的位置處包含多個缺失的變體前原肽。[0245]在另ー個甚至更優選的方面，分離的多核苷酸編碼在與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第2位對應的位置處包含用Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys>Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代且在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的位置處包含Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys>Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val的多個缺失的變體前原肽。[0246]在另ー個甚至更優選的方面，分離的多核苷酸編碼在與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第2位對應的位置處包含Lys作為取代且在分別與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第18、19,20,21和22位對應的位置處包含Ser、Pro、Ile、Arg和Arg的ー個或多個(幾個、數個)缺失的變體前原肽。[0247]在另ー個甚至更優選的方面，分離的多核苷酸編碼在與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第2位對應的位置處包含R2K取代且在分別與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第18、19、20、21和22位對應的位置處包含S18'P19'I20'R2r和R22*的ー個或多個(幾個、數個)缺失的變體前原肽。[0248]在另ー個甚至更優選的方面，分離的多核苷酸編碼在與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第2位對應的位置處包含R2K取代且在分別與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第18、19、20、21和22位對應的位置處包含S18'P19'120'R21*和R22*缺失的變體前原肽。[0249]在另ー個最優選的方面，分離的多核苷酸編碼包含SEQIDN0:2氨基酸1_22的R2K取代且包含SEQIDN0:2氨基酸1-22的S18*、P19*、I20*、R2r和R22*中的ー個或多個(幾個、數個)缺失，或由其組成的變體前原肽。[0250]在另ー個甚至最優選的方面，分離的多核苷酸編碼包含SEQIDNO:2氨基酸1_22的R2K取代且包含SEQIDNO:2氨基酸1-22的S18*、P19*、120*、R21*和R22*缺失，或由其組成的變體前原肽。[0251]在另ー個甚至最優選的方面，分離的多核苷酸編碼SEQIDN0:4之變體信號肽。在另ー個甚至最優選的方面，編碼SEQIDNO:4之變體信號肽的分離的多核苷酸是SEQIDN0:3。在另ー個甚至最優選的方面，分離的多核苷酸編碼SEQIDN0:6之變體前原肽。在另ー個甚至最優選的方面，編碼SEQIDN0:6之變體前原肽的分離的多核苷酸是SEQIDN0:5。[0252]術語“分離的多核苷酸”在用于本申請時指基本上不含其它多核苷酸的多核苷酸，例如根據瓊脂糖電泳的測定為至少20%純、優選至少40%純、更優選至少60%純、甚至更優選至少80%純和最優選至少90%純`的。[0253]本發明還涉及用于獲得編碼變體信號肽或變體前原肽的多核苷酸的方法，其包括:(a)將與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第2位對應的位置處的取代和/或與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和/或22位對應的ー個或多個(幾個、數個)位置處的缺失導入親本信號肽編碼序列或親本前原肽編碼序列，其中所述變體信號肽或變體前原肽當以符合讀碼框的方式可操作連接至具有生物學活性的多肽時指導該多肽進入細胞的分泌途徑；和(b)回收所述多核苷酸。[0254]多肽[0255]多肽對于感興趣真菌宿主細胞而言可以是天然的或異源的(外來的)。術語“異源多肽”在本申請中定義為對于宿主細胞而言不是天然的多肽；或者為了改變天然多肽已經進行了結構修飾的天然多肽。[0256]多肽可以是具有感興趣生物學活性的任何多肽。術語“多肽”在本申請中并非意指特定長度的編碼產物，因此涵蓋肽、寡肽和蛋白質。術語“多肽”還涵蓋雜合多肽，其包含自至少兩種不同多肽得到的部分的或完整的多肽序列的組合，其中ー種或多種(幾種、數種)對于真菌細胞而言可以是異源的。多肽進一歩包括多肽的天然存在的等位及工程改造的變異形式。[0257]在一個優選的方面，多肽是抗體、抗原、抗微生物肽、酶、生長因子、激素、免疫擴張劑(immunodiIator)、神經遞質、受體、報道蛋白、結構蛋白和轉錄因子。[0258]在ー個更優選的方面，多肽是氧化還原酶、轉移酶、水解酶、裂合酶、異構酶、或連接酶。在ー個最優選的方面，多肽是a-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質酶、角質酶、環糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、a-半乳糖苷酶、P-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖腦苷脂酶(glucocerebrosidase)、a-葡糖苷酶、&-葡糖苷酶、轉化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、變位酶(mutanase)、氧化酶、果膠水解酶、過氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉谷氨酰胺酶、尿激酶、或木聚糖酶。[0259]在另ー個優選的方面，多肽是白蛋白、膠原、原彈性蛋白(tropoelastin)、彈性蛋白、或明膠。[0260]在一個優選的方面，多肽是脂肪酶。在ー個更優選的方面，多肽是自嗜熱霉屬(Thermomyces)得到的脂肪酶。在一個甚至更優選的方面，多肽是自細毛嗜熱霉得到的野生型脂肪酶。在ー個最優選的方面，多肽是包含SEQIDN0:8之成熟多肽或由其組成的野生型細毛嗜熱霉脂肪酶。在一個甚至最優選的方面，SEQIDN0:8之成熟多肽由SEQIDNO:7之成熟多肽編碼序列編碼。在另ー個甚至更優選的方面，多肽是自細毛嗜熱霉脂肪酶得到的變體脂肪酶。在另ー個最優選的方面，多肽是包含SEQIDNO:10之成熟多肽或由其組成的細毛嗜熱霉變體脂肪酶。在另ー個甚至最優選的方面，SEQIDNO:10之成熟多肽由SEQIDN0:9之成熟多肽編碼序列編碼。[0261]在一個優選的方面，成熟多肽是SEQIDNO:8氨基酸23-291。在另ー個優選的方面，成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:7核苷酸67-918。在另ー個優選的方面，成熟多肽是SEQIDNO:10氨基酸23-291。在另ー個優選的方面，成熟多肽編碼序列是SEQIDN0:9核苷酸67-873。[0262]編碼多肽的多核苷酸可以自任何原核的、真核的或其它的來源獲得。就本發明而言，術語“自…得到的”或“得自”在本申請中與給定來源一起使用時應意味著該多肽是由所述來源或由其中已經插入了來自所述來源的基因的細胞產生的。[0263]用于分離或克隆編碼多肽的核酸序列的技術是本領域已知的，包括自基因組DNA分離、自cDNA制備、或其組合。自此類基因組DNA克隆核酸序列可以通過例如使用眾所周知的聚合酶鏈式反應(PCR)來實現。參見例如Innis等，1990,PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplication,AcademicPress,NewYork。克隆步驟可以涉及切除和分離包含編碼多肽的核酸序列的期望核酸片段，將該片段插入載體分子，并將該重組載體摻入突變體真菌細胞，其中將會復制多個拷貝或克隆的所述核酸序列。所述核酸序列可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源的，或其任意組合。[0264]核酸構建體[0265]本發明還涉及包含編碼多肽的多核苷酸的核酸構建體，所述多核苷酸可操作連接至本發明的變體信號肽編碼序列或變體前原肽編碼序列及一個或多個控制序列，所述控制序列指導編碼序列在合適宿主細胞中在與控制序列相容的條件下表達。表達應理解為包括產生多肽所涉及的任何步驟，包括但不限于轉錄、轉錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。[0266]“核酸構建體”在本申請中定義為自天然存在基因分離的或經修飾而包含以本不存在于自然界中的方式組合和井置的核酸區段的單鏈或雙鏈核苷酸分子。當核酸構建體包含編碼序列和編碼序列表達所需要的所有控制序列時，術語核酸構建體與術語表達盒同義。[0267]可以以多種方式進ー步操作編碼多肽的分離的多核苷酸，從而為多肽表達作準備。取決于表達載體，在將多核苷酸的核苷酸序列插入載體前對其進行操作可能是理想的或必要的。利用重組DNA方法修飾核苷酸序列的技術是本領域眾所周知的。[0268]在本發明的方法中，多核苷酸可以包含ー種或多種天然控制序列，或者可以將ー種或多種天然控制序列用對所述多核苷酸而言是外來的一種或多種控制序列替換，從而改進編碼序列在宿主細胞中的表達。[0269]術語“控制序列”在本申請中定義為包括對于感興趣多肽的表達而言是必需的或有益的所有構件(component)。每種控制序列對于編碼多肽的多核苷酸而言可以是天然的或外來的。此類控制序列包括但不限于前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、本發明的變體信號肽編碼序列或變體前原肽編碼序列、和轉錄終止子。最低限度，控制序列包括本發明的變體信號肽編碼序列或變體前原肽編碼序列、及轉錄和翻譯終止信號。為了導入特定限制性位點以促進控制序列與編碼多肽的多核苷酸序列的編碼區的連接，控制序列可以與接頭一起提供。[0270]控制序列可以是適當的啟動子序列，其受到用于表達多核苷酸的宿主細胞的識另IJ。啟動子序列包含介導多肽表達的轉錄控制序列。啟動子可以是在所選擇的宿主細胞中顯示出轉錄活性的任何序列，包括突變的、截短的和雜合的啟動子，而且可以從編碼對于宿主細胞而言是同源的或異源的胞外或胞內多肽的基因獲得。[0271]用于指導本發明的核酸構建體在絲狀真菌宿主細胞中轉錄的合適啟動子的實例是從下列酶的基因獲得的啟動子:米曲霉(Aspergillusoryzae)TAKA淀粉酶、米赫根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillusniger)中性a-淀粉酶、黑曲霉酸穩定性a-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillusawamori)葡糖淀粉酶(glaA)、米赫根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構酶、構巢曲霉(Aspergillusnidulans)こ酰胺酶、鑲片錸孢(Fusariumvenenatum)淀粉葡糖苷酶(W000/56900)、鑲片祿抱Daria(WC)00/56900)、壤片祿抱Quinn(W000/56900)、尖祿抱(Fusariumoxysporum)胰蛋白酶樣蛋白酶(W096/00787)、里氏木霉(Trichodermareesei)P-葡糖苷酶、里氏木霉纖維ニ糖水解酶1、里氏木霉纖維ニ糖水解酶I1、里氏木霉內切葡聚糖酶1、里氏木霉內切葡聚糖酶I1、里氏木霉內切葡聚糖酶II1、里氏木霉內切葡聚糖酶IV、里氏木霉內切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶1、里氏木霉木聚糖酶I1、里氏木霉P-木糖苷酶、以及NA2-tpi啟動子(來自黑曲霉中性a-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸異構酶基因的啟動子的雜合體)；和它們的突變的、截短的和雜合的啟動子。[0272]在酵母宿主中，有用的啟動子從如下酶的基因獲得:釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)烯醇化酶(EN0-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GALl)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH1，ADH2/GAP)、釀酒酵母丙糖磷酸異構酶(TPI)、釀酒酵母金屬硫蛋白(CUPl)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。對于酵母宿主細胞有用的其它啟動子描述于Romanos等,1992,Yeast8:423-488。[0273]控制序列可以是合適的轉錄終止子序列，其被宿主細胞識別以終止轉錄。終止子序列可操作連接至編碼多肽的多核苷酸序列的3’端?？梢詫⒃谒x擇的宿主細胞中有功能的任何終止子用于本發明。[0274]對于絲狀真菌宿主細胞優選的終止子從如下酶的基因獲得:米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉a-葡糖苷酶和尖錸孢胰蛋白酶樣蛋白酶。[0275]對于酵母宿主細胞優選的終止子從如下酶的基因獲得:釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細胞色素C(CYCl)和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶。對于酵母宿主細胞有用的其它終止子描述于Romanos等，1992，見上文。[0276]控制序列還可以是合適的前導序列，即對于宿主細胞進行的翻譯而言是重要的mRNA非翻譯區。前導序列可操作連接至編碼多肽的多核苷酸序列的5’端?？梢詫⒃谒x擇的宿主細胞中有功能的任何前導序列用于本發明。[0277]對于絲狀真菌宿主細胞優選的前導序列從如下酶的基因獲得:米曲霉TAKA淀粉酶和構巢曲霉丙糖磷酸異構酶。[0278]對于酵母宿主細胞合適的前導序列從如下酶的基因獲得:釀酒酵母烯醇化酶(EN0-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母a-因子和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)。[0279]控制序列也可以是聚腺苷酸化序列，其可操作連接至多核苷酸序列的3’端，而且在轉錄時，被宿主細胞識別為向轉錄的mRNA添加聚腺苷殘基的信號?？梢詫⒃谒x的宿主細胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列用于本發明。[0280]對于絲狀真菌宿主細胞優選的聚腺苷酸化序列從如下酶的基因獲得:米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、尖錸孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑曲霉a-葡糖苷酶。[0281]對于酵母宿主細胞有用的`聚腺苷酸化序列描述于Guo和Sherman,1995,MolecularCellularBiology15:5983-5990。[0282]控制序列還可以是前肽編碼區，其編碼位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽稱為酶原或多肽原(或在某些情況下為酶原)。多肽原一般是沒有活性的，而且可以通過催化性地或自身催化性地自多肽原切割掉前肽而轉變成成熟的、有活性的多肽?？梢詮娜缦旅傅幕颢@得前肽編碼區:釀酒酵母a-因子、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、細毛嗜熱霉脂肪酶和嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila)漆酶(W095/33836)。[0283]若多肽的氨基末端存在有信號肽和前肽兩個區，則前肽區以符合讀碼框的方式連接至多肽的氨基末端，而信號肽區以符合讀碼框的方式連接至前肽區的氨基末端。[0284]可能還期望添加調節序列，其允許相對于宿主細胞的生長來調節多肽的表達。調節系統的例子是那些引起基因表達響應化學或物理刺激(包括調節性化合物的存在)而開啟或關閉的系統。在酵母中，可以使用ADH2系統或GALl系統。在絲狀真菌中，可以使用TAKAa-淀粉酶啟動子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動子作為調節序列。調節序列的其它實例是那些允許基因擴增的序列。在真核系統中，這些序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下擴增的ニ氫葉酸還原酶基因,和以重金屬(withheavymetal)擴增的金屬硫蛋白基因。在這些情況中，包含編碼多肽的核苷酸序列的多核苷酸將與調節序列可操作相連接。[0285]表達載體[0286]本發明還涉及重組表達載體，其包含本發明的變體信號肽編碼序列或變體前原肽編碼序列、編碼感興趣多肽的多核苷酸序列、及轉錄和翻譯終止信號。上文所述各種核苷酸和控制序列可以結合在一起以產生重組表達載體，其可以包含ー個或多個方便的限制性位點以允許在這些位點插入或取代啟動子和/或編碼多肽的多核苷酸序列。或者，可以通過在用于表達的適當載體中插入包含變體信號肽編碼序列或變體前原肽編碼序列和編碼多肽的多核苷酸序列或核酸構建體來表達多核苷酸序列。在創建表達載體吋，將編碼序列置于載體中，使得編碼序列與本發明的變體信號肽編碼序列或變體前原肽編碼序列和用于表達的ー個或多個適當的控制序列可操作相連接。[0287]重組表達載體可以是任何載體(例如質?；虿《?，其能方便地進行重組DNA步驟，而且能產生多核苷酸序列的表達。載體的選擇將通常取決于載體與其中待引入該載體的宿主細胞的相容性。載體可以是線狀的或閉合環狀的質粒。[0288]本發明的載體優選包含ー個或幾個選擇標志，其允許簡單選擇經轉化的細胞。選擇標志是其產物提供殺生物劑抗性或病毒抗性、對重金屬的抗性、對營養缺陷型的原養性(prototrophytoauxotrophs)等的基因。對于酵母宿主細胞合適的標志包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRPI和URA3。用于絲狀真菌宿主細胞的選擇標志包括但不限于amdS(こ酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲?；D移酶)、bar(膦絲菌素(phosphinothricin)こ酰轉移酶)、hygB(潮霉素磷酸轉移酶)、niaD(硝酸還原酶)(nitratereductase)、PyrG(乳清酸核苷_5’_憐酸脫羧酶)(orotidine-5’-phosphatedecarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰轉移酶)、trpC(鄰氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase)),以及它們的等效物。優選用在曲霉屬細胞中的是構巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)的bar塞因。[0289]載體可以是自主復制載體，即作為染色體外實體(entity)存在的載體，其復制獨立于染色體復制，例如質粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)、或人工染色體。載體可以包含任何用于確保自復制的手段(means)?；蛘撸d體可以是ー種當被導入宿主細胞時，整合到基因組中并且與整合了該載體的染色體一起復制的載體。此外，可以使用単一的載體或質?；蛘邇蓚€或更多個載體或質粒，其一起含有待導入宿主細胞基因組的總DNA(totalDNA)，或者可以使用轉座子。[0290]本發明的載體優選包含允許載體穩定整合入宿主細胞基因組或允許載體在細胞中獨立于基因組自主復制的元件。[0291]為了整合入宿主細胞基因組，載體可以依賴編碼多肽的多核苷酸序列或用于將載體通過同源或非同源重組穩定整合入基因組的任何其它載體元件。或者，載體可以包含額外的核苷酸序列，用于指導通過同源重組整合入宿主細胞染色體中。所述額外的核苷酸序列使得載體能夠在染色體中的精確位置處整合入宿主細胞基因組。為了增加在精確位置處整合的可能性，整合元件應優選包含足夠數目的核酸，如100-10，000堿基對、優選400-10，000堿基對和最優選800-10，000堿基對，其與相應的靶序列具有高的同一性程度以增強同源重組的概率。整合元件可以是與宿主細胞基因組中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非編碼的或編碼的核苷酸序列。另ー方面，可以將載體通過非同源重組整合到宿主細胞的基因組中。[0292]為了自主復制，載體可以進一歩包含復制起點，其使載體能夠在所討論的宿主細胞中自主復制。復制起點可以是在細胞中發揮功能的、介導自主復制的任何質粒復制子(replicator)。術語“復制起點”或“質粒復制子”在本申請中定義為使質?；蜉d體能夠在體內復制的核苷酸序列。[0293]用于酵母宿主細胞中的復制起點的實例是2微米(2micix)n)復制起點、ARS1、ARS4、ARS1與CEN3的組合和ARS4與CEN6的組合。復制起點可以是具有使其在宿主細胞中以溫度敏感性方式發揮功能的突變的復制起點(參見例如Ehrlich，1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:1433)。[0294]在絲狀真菌細胞中有用的復制起點的實例是AMAl和ANSI(Gems等，1991，Gene98:61-67;Cullen等，1987，NucleicAcidsResearch15:9163-9175;W000/24883)。分離AMAl基因和構建包含該基因的質粒或載體可以依照WO00/24883中披露的方法來進行。[0295]可以將多于ー個拷貝的編碼多肽的多核苷酸插入宿主細胞以増加基因產物的產生。多核苷酸拷貝數的増加可通過如下方法獲得:將至少一個額外拷貝的核苷酸序列整合入宿主細胞基因組，或將可擴增的選擇標志基因包括在核苷酸序列內，其中可通過在適當選擇劑(selectableagent)存在下培養細胞來選擇含有選擇標志基因的擴增拷貝并由此含有多核苷酸的額外拷貝的細胞。[0296]用于連接上文所述元件以構建本發明的重組表達載體的規程是本領域技術人員熟知的(參見例如Sambrook等，1989，見上文)。[0297]宿主細胞[0298]本發明還涉及包含可操作連接至編碼多肽的多核苷酸的本發明的變體信號肽編碼序列或變體前原肽編碼序列的重組宿主細胞，其有利地用于重組產生所述多肽。將包含可操作連接至編碼多肽的多核苷酸的本發明的變體信號肽編碼序列或變體前原肽編碼序列的載體導入宿主細胞，使得該載體作為染色體成分或作為自復制的染色體外載體得到維持，正如上文所述。術語“宿主細胞”涵蓋親本細胞的任何后代，其由于復制過程中發生的突變而與親本細胞有所不同。宿主`細胞的選擇將在很大程度上取決于編碼多肽的基因及其來源。[0299]宿主細胞可以是任何可用于本發明方法的真菌細胞?！罢婢痹谟糜诒旧暾垥r包括以下門:子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)和接合菌門(Zygomycota)(如Hawksworth等，于AinsworthandBisby;sDictionaryofTheFungi,第8版，1995，CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK中所定義的)、以及卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，見上文，第171頁中所引用)和所有有絲分裂孢子真菌(mitosporicfungi)(Hawksworth等，1995，見上文)。[0300]在一個優選的方面，真菌宿主細胞是酵母細胞。“酵母”在用于本申請時包括產子囊酵母(ascosporogenousyeast)(內抱霉目(Endomycetales))、產擔子酵母(basidiosporogenousyeast)和屬于半知菌類(FungiImperfecti)(芽抱綱(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分類在未來可能改變，就本發明而言，酵母應定義為如BiologyandActivitiesofYeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,和Davenport,R.R.,編，Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesN0.9,1980)中所述。[0301]在ー個更優選的方面，酵母宿主細胞是假絲酵母屬(Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂通酵母屬(Schizosaccharomyces)、或耶氏酵母屬(Yarrowia)細胞。[0302]在ー個最優選的方面，酵母宿主細胞是卡爾酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)、克魯弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、諾地酵母(Saccharomycesnorbensis)、或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)細胞。在另ー個最優選的方面，酵母宿主細胞是乳酸克魯維酵母(KluyveromycesIactis)細胞。在另ー個最優選的方面，酵母宿主細胞是解脂耶氏酵母(YarrowiaIipolytica)細胞。[0303]在一個甚至最優選的方面，酵母宿主細胞是釀酒酵母JG169(MAT-a，ura3-52,leu2-3，p印4-1137，his3A2，prbl::leu2，Aprel::his3)(美國專利N0.5，770，406)。[0304]在另ー個優選的方面，真菌宿主細胞是絲狀真菌細胞。“絲狀真菌”包括真菌門(Eumycota)和卵菌門(Oomycota)的亞門(如Hawksworth等，1995，見上文所定義的)的所有絲狀形式。絲狀真菌的特征在于由殼多糖(chitin)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它復雜多糖構成的菌絲體壁。通過菌絲延伸進行營養性生長，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母如釀酒酵母的營養性生長通過單細胞菌體的出芽(budding)進行，而碳分解代謝可以是發酵的。[0305]在ー個更優選的方面，絲狀真菌宿主細胞是如下屬的菌種的細胞:包括但不限于枝頂抱霉屬(Acremonium)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、煙管霉屬(Bjerkandera)、擬錯菌屬(Ceriporiopsis)、金孢子菌屬(Chrysosporium)、鬼傘屬(Coprinus)、革蓋菌屬(Coriolus)、隱球菌屬(Cryptococcus)、Filibasidium、f廉抱屬(Fusarium)、腐質霉屬(Humicola)、梨孢菌屬(Magnaporthe)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、新考瑪脂霉屬(Neocallimastix)、脈抱菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、平革菌屬(Phanerochaete)、射脈菌屬(Phlebia)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、側耳屬(Pleurotus)、裂糟菌屬(Schizophyllum)JI節菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、栓菌屬(Trametes)、或木霉屬(Trichoderma)。[0306]在一個甚至更優選的方面，絲狀真菌宿主細胞是泡盛曲霉(AspergiIIusawamori)、煙曲霉(Aspergillusfumigatusノ、臭曲4(Aspergillusfoetiaus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、構巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、或米曲霉(Aspergillusoryzae)細胞。在另ー個最優選的方面，絲狀真菌宿主細胞是桿孢狀錸孢(Fusariumbactridioides)、禾谷錸孢(Fusariumcerealis)、庫威?廉抱(Fusariumcrookwellense)、大刀?廉:T包(FusariumcuImorum)、木本科?廉抱(Fusariumgraminearum)、木赤?廉抱(Fusariumgraminum)、弁抱?廉抱(Fusariumheterosporum)、合歡木?廉:T包(Fusariumnegunai)、尖?廉抱(Fusariumoxysporum)、多枝?廉抱(Fusariumreticulatum)、粉紅?廉す包(Fusariumroseum)、接骨木f廉抱(Fusariumsambucinum)、膚色f廉抱(Fusariumsarcochroum)、擬分枝抱f廉抱(Fusariumsporotrichioides)、硫色?廉抱(Fusariumsuiphureum)、圓?廉抱(Fusariumtorulosum)、擬絲抱f廉抱(Fusariumtrichothecioides)、或壤片f廉抱(Fusariumvenenatum)細胞。在另ー個最優選的方面，絲狀真菌宿主細胞是黑剌煙管菌(Bjerkanderaadusta)、干擬錯菌(Ceriporiopsisaneirina)、干擬錯_囷、Ceriporiopsiscaregiea、Ceriporiopsisgilvescens、Ceriporiopsispannocinta、Ceriporiopsisrivulosa、Ceriporiopsissubrufa、蟲擬錯菌(Ceriporiopsissubvermispora)、嗜角質金抱子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、ChrysosporiumIucknowense熱市金抱子M(Cnrysosporiumtropicum)、(nrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、適金f包于囷(Chrysosporiumpannicola)、(nrysosporiumqueenslandicum(hrysosporiumzonatum、灰蓋鬼傘(Coprinuscinereus)、毛革蓋菌(Coriolushirsutus)、特異腐質霉(Humicolainsolens)、疏棉狀腐偵霉(Humicolalanuginosa)、米赫毛(Mucormiehei)、嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila)、粗糖脈抱菌(Neurosporacrassa)、產紫(Penicilliumpurpurogenum)、負抱平革菌(Phanerocnaetecnrysosporium)、福射射脈菌(Phlebiaradiata)、剌序側耳(Pleurotuseryngii)、土生梭抱霉(Thielaviaterrestris)、長域毛栓菌(Trametesvillosa)、變色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康寧木霉(Trichodermakoningii)、長枝木霉(Trichoderma1ngiorachiatumノ、里氏木4(Trichodermareesei)、或綠色木霉(Trichoaermaviride)細胞。[0307]可以通過涉及原生質體形成、原生質體轉化和細胞壁重建的方法以本身已知的方式來轉化真菌細胞。用于轉化曲霉屬宿主細胞的合適方法描述于EP238023及Yelton等，1984，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA81:1470-1474。用于轉化里氏木霉宿主細胞的合適方法描述于Penttila等，1987，Gene61:155-164及Gruber等，1990，CurrGenet.18(I):71-6。用于轉化錸孢屬菌種的合適方法描述于Malardier等，1989，Gene78:147-156及WO96/00787?？梢允褂糜扇缦挛墨I記載的方法來轉化酵母:Becker和Guarente，于Abelson，J.N.和Simon，M.1.，編，GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MetnodsinEnzymology,卷194，pp182-187，AcademicPress,Inc.,NewYork;Ito等，1983，JournalofBacteriology153:163;及Hinnen等，1978，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:1920。[0308]通過下文實施例來進ー步描述本發明，所述實施例不應解釋為限制本發明的范圍。實施例[0309]作為緩沖液和底物使用的化學藥品是至少試劑等級的商業產品。[0310]DNA測序[0311]使用AppliedBiosystems3130X型遺傳分析儀(Model3130XGeneticAnalyzer)(AppliedBiosystems,FosterCity，CA，USA)進行DNA測序，其使用染料終止物化學(Giesecke等，1992，JournalofVirol.Methods38:47-60)。使用phred/phrap/consed(UniversityofWashington,Seattle,WAjUSA)及序列特異性引物來裝配序列。[0312]菌株[0313]本文實施例中使用釀酒酵母JG169(MAT-a，ura3-52，leu2-3，pep4_lI37，his3A2，prbl::leu2，Aprel::his3)(美國專利N0.5，770，406)和米曲霉BECh2(Aalp,Aamy，CPA-，KA-，Anpl)(WO00/39322)作為宿主菌株。[0314]培養基和溶液[0315]YPD培養基每升由IOg酵母提取物、20gBacto蛋白胨和2%葡萄糖構成。[0316]CUP減ura培養基(CUPminusuramedium)(pH7.0)(“初始培養基”)姆升由ImlIOOmMCuSO4AH2O,1.7g不含氨基酸和硫酸銨的酵母氮喊(yeastnitrogenbase,YNB)(B10101,Carlsbad,CA,USA)，0.8g含40mg腺嘌呤的CSM-ura(B10101,Carlsbad,CA,USA)，5g釀蛋白氛基酸(Becton,DickensonandCompany,Sparks,MD,USA),100ml50%葡萄糖,50ml0.5MK2HPO4,和ImllOOmg/ml氨節青霉素構成。[0317]酵母ura減選擇培養基(Yeasturaminusselectionmedium)姆升由6.7g含硫酸銨的酵母氮堿(YNB)，5g酪蛋白氨基酸，IOOml0.5M琥珀酸pH5，40ml50%葡萄糖，和2ml10mg/ml氯霉素構成。[0318]酵母ura減選擇板由酵母ura減選擇培養基姆升補加20gNoble瓊脂構成。[0319]MY25培養基每升由25g麥芽糊精，2gMgSO4?7H20，IOgKH2PO4,2g檸檬酸，2gK2SO4,2g脲，IOg酵母提取物，和1.5mlAMG痕量金屬溶液構成，調至pH6。[0320]AMG痕量金屬溶液每升由14.3gZnSO4?7H20,2.5gCuSO4?5H20,0.5gNiCl2?6H20,13.8gFeSO4?7H20,8.5gMnSO4?H2O,和3g檸檬酸構成。[0321]SCura減培養基每升由7.5g不含氨基酸的酵母氮堿(Fluka,Buchs,Switzerland),11.3g琥拍酸，6.8g氫氧化鈉，5.6g酪蛋白氨基酸，和0.1gL-色氨酸構成，并且在高壓滅菌后添加IOOml50%果糖無菌溶液和400uI250mg/ml氨芐青霉素無菌溶液。[0322]SCura減板由SCura減培養基(只是使用IOOml無菌20%果糖)和20g瓊脂(SigmaChemicalC0.,St.Louis,MO,USA)構成。[0323]SDMUA培養基每升由1.7g不含氨基酸的酵母氮堿，5.0g酪蛋白氨基酸，0.8g含40mg/lADE的CMS-Ura(MPBiomedicals,Irvine,CA,USA),IOml的IOmMCuSO4?5H20,和IOml的IMK2HPO4構成，并且在高壓滅菌后添加IOOml無菌的50%果糖和400UI無菌的250mg/ml氨節青霉素。[0324]SOC培養基由2%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，IOmMNaCl,2.5mMKCl,IOmMMgCl2,和IOmMMgSOjQ成，通過高壓滅菌來滅菌，然后添加經過濾除菌的葡萄糖至20mM。[0325]2XYT板每升由16g胰蛋白胨，IOg酵母提取物，5gNaCl,和15g細菌用瓊脂(bactoagar)構成。[0326]COVE板每升由342g蔗糖，10mlCOVE鹽溶液，IOml的IMこ酰胺，IOml1.5MCsCl,和25gNoble瓊脂構成。[0327]COVE鹽溶液每升由26gKCl,26gMgSO4,76gKH2PO4,和50mlCOVE痕量金屬溶液構成。[0328]COVE痕量金屬溶液每升由0.04gNa2B4O7?IOH2O,0.4gCuSO4?5H20,1.2gFeSO4?7H20,0.7gMnSO4?H2O,0.8gNa2MoO2?H2O,和IOgZnSO4?7H20構成。[0329]VNO3RLMT瓊脂每升由20ml50X的含25mMNaNO3的Vogels,273.33g蔗糖，和15g低熔點瓊脂糖構成。[0330]50X的含25mMNaNO3的Vogels每升由125gニ水合檸檬酸鈉，250gKH2PO4,106.25gNaNO3,IOgMgSO4?IW2Q,5gCaCl2?2H20,2.5ml生物素溶液，和5mlVogels痕量元素溶液構成。[0331]生物素溶液由100ml50%こ醇中的5mg生物素構成。[0332]Vogels痕量元素溶液由5g單水合檸檬酸，5gZnSO4?7H20,IgFe(NH4)2(SO4)2?6H20,0.25gCuSO4?5H20,0.05gMnSO4?H2O,0.05gH3BO3,和0.05gNa2MoO4?2H20構成。[0333]實施例1:銅誘導型啟動子(CUP1啟動子)的PCR擴增[0334]設計了下文所示PCR引物997247和997248用于從質粒pCu426(Labbe和Thiele,1999,MethodsinEnzymology306:145-153)擴增釀酒酵母銅誘導型啟動子(CUP1啟動子)。引物設計中摻入了限制酶位點AgeI和EcoRI，用于克隆入釀酒酵母表達質粒pMB1537(見實施例2)。[0335]引物997247:[0336]5，-CACCGGTGCATGCCTGCAGGAGCTCCTAGTTAGAAA-3，(SEQIDNO:11)[0337]AgeI[0338]引物997248:[0339]5，-AACTATTCTTGAATGGAATTCTAGTCGATGACTTCT-3，(SEQIDNO:12)[0340]EcoRI[0341]使用EXPAND?高保真PCR系統(Roche,Indianapolis,IN,USA)通過PCR擴增CUP啟動子片段。PCR擴增反應混合物含有大約50ngpCu426質粒DNA，Iiil引物997247(50pmol/u1)，I引`物997248(50pmol/U1)，I含15mMMgCl2的IOXPCR緩沖液(Roche,Indianapolis,IN,USA)，IyIdNTP混合物(每種IOmM)，40.25yI水，和0.75uI(3.5U/uI)DNA聚合酶混合物(Roche,Indianapolis,IN,USA)。使用EPPEND0RFkMASTERCYCLER.?5333(Eppendorf,Westbury,NY,USA)來擴增片段，程序為94°C2分鐘的I個循環；10個循環每個為94°C15秒、55°C30秒和72°C15秒；15個循環每個為94°C15秒、55°C30秒和72°C15秒(每個連續的循環遞加5秒延伸)；72°C7分鐘的I個循環；及10°C維持。[0342]使用TAE緩沖液(每升4.84gTris堿，1.14ml冰醋酸，和2ml0.5MEDTApH8.0)通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳純化246bpPCR產物，并使用QIAQUICK?凝膠提取試劑盒(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA)進一步純化。使用pCR2.1-T0P0?(InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA,USA)根據制造商的說明書連接246bpPCR產物。溫育后，使用2ill混合物轉化ONESHOT?T0P10化學感受態大腸桿菌細胞(InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA,USA)。將2iiI體積的連接混合物添加至大腸桿菌細胞并在冰上溫育5分鐘。隨后，將細胞在42°C熱休克30秒，然后在冰上放置2分鐘。將250UI體積的SOC培養基添加至細胞并將混合物在37°C和250rpm溫育I小吋。溫育后，將菌落涂布在每升補充有IOOiig氨芐青霉素的2XYT板上并在37°C溫育過夜，以進行質粒選擇。用無菌牙簽挑取在板上生長的8個菌落并在裝有3ml每ml補充有100ug氨芐青霉素的LB培養基的15mlFALCON?管中在37°C，250rpm培養過夜。使用BioRobot9600(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA)分離質粒。[0343]用EcoRI消化4UI體積的所得質粒微量制備物。通過瓊脂糖凝膠電泳和UV分析來分析消化反應液，如先前關于PCR反應所述。使用I質粒模板，1.6ngM13引物(正向的或反向的)(MWGBiotech,HighPoint,NC，USA)，和補至6yl的水，對包含插入物的分尚質粒進行測序。將具有正確序列的所得質粒命名為pBM128a(圖1)。[0344]實施例2:表達載體pMB1537的構建[0345]表達載體PMB1537包含驅動編碼細毛嗜熱霉脂肪酶的野生型基因表達的酵母TPI啟動子(SEQIDNO:7是DNA序列，而SEQIDN0:8是推導的氨基酸序列；美國專利N0.5，869，438)、CYCl終止子和作為選擇標志的URA3基因。[0346]使用EXPAND?長模板PCR系統(Roche,Germany)PCR擴增酵母表達質粒PSTED226(W005/045018)，其中使用pSTED226作為模板和如下兩種引物。[0347]引物319137:5，-TCTAGAGGGCCGCATCATGTAATTAG-3’(SEQIDNO:13)[0348]引物19138:5，-GACGCCATGGTGAAGCTTTCTTTTAATCGT-3，(SEQIDNO:14)[0349]PCR擴增反應混合物含有大約50ngpSTED226質粒DNA,IiU引物319137(50pmol/uI),IμI引物19138(50pmol/uI),5uI含15mMMgCl2的10XPCR緩沖液(Roche,Indianapolis,IN,USA)，IyIdNTP混合物(每種10mM)，40.25yI水，和0.75u1(3.5U/uI)DNA聚合酶混合物(Roche,Indianapolis,IN,USA)。使用PTCPeltier熱循環儀(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA,USA)來擴增片段,程序為94°C2分鐘的I個循環；10個循環每個為94°C15秒、55°C30秒和72°C15秒；15個循環每個為94°C15秒、55°C30秒和72°C15秒(每個連續的循環遞加5秒延伸)；72°C7分鐘的I個循環；和10°C維持。PCR步驟終止后，使用GFX?PCRDNA和凝膠條帶純化試劑盒根據制造商的說明書(AmershamBiosciences,UnitedKingdom)純化和洗脫5826bp的PCR片段。[0350]使用EXPAND、高保真PCR系統PCR擴增包含細毛嗜熱霉野生型脂肪酶基因的基因片段，其中使用作為模板的pENI1298(W000/24883)和如下兩種引物:[0351]引物349699:[0352]5，-CAAGAAGATTACAAACTATCAATTTCATACACAATATAAACGATTAAAAGAAAGCTTCACCATGAGGAGCTCCCTTGTGCTGTTCTTTGTCTCTG-3’(SEQIDNO:15)[0353]引物353031:[0354]5，-GAGGGCGTGAATGTAAGCGTGACATAACTAATTACATGATGCGGCCCTCTAGATTATCAAAGACATGTCCCAATTAACCCGAAGTAC-3’(SEQIDNO:16)[0355]PCR擴增反應混合物含有大約50ngpENI1298質粒DNA,IiU引物349699(50pmol/uI)，Iyl引物353031(50pmol/ul)，5yI含15mMMgCl2的10XPCR緩沖液(Roche,Indianapolis,IN,USA)，IyIdNTP混合物(每種IOmM)，40.25yI水，和0.75u1(3.5U/uI)DNA聚合酶混合物(Roche,Indianapolis,IN,USA)。使用PTCPeltier熱循環儀來擴增片段，程序為94°C2分鐘的I個循環；10個循環每個為94°C15秒、55°C30秒和72°C15秒；15個循環每個為94°C15秒、55°C30秒和72°C15秒(每個連續的循環遞加5秒延長);72°C7分鐘的I個循環；和10°C維持。PCR步驟終止后，使用GF入丨<PCRDNA和凝膠條帶純化試劑盒根據制造商的說明書(AmershamBiosciences,UnitedKingdom)純化和洗脫927bpPCR片段。[0356]將所得兩種片段，5826bp和927bp通過電穿孔轉化入釀酒酵母JG169，其中根據制造商的步驟使用設定為1.5千伏(kvolt)的GENEI3ULSER?和脈沖控制儀(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)及2mm縫隙的電擊杯(cuvette)。轉化反應液含有混合的IOOngPCR擴增的載體DNA及IOOng包含脂肪酶基因的PCR產物。將轉化反應液涂布到酵母ura減選擇板上并在30°C溫育5天。[0357]將來自上述步驟的ー個酵母克隆在SCura減板上再劃線，并將ー個酵母單菌落接種入50ml搖瓶中的IOmlSCura減培養基并在30°C，250rpm溫育過夜。使用2ml培養液進行質粒制備，其中使用用于酵母質粒制備的QIAPREP?SpinMiniprepKit(旋轉微量制備試劑盒)(QIAGENInc.，Germany)。稍后將質粒測序并驗證了預期的DNA序列。將質粒命名為pMB1537(圖2)。[0358]實施例3:表達載體pBM126a的構建[0359]用AgeI和EcoRI消化質粒pBMl28a，用EcoRI和NdeI消化質粒pMB1537，并分別通過使用TAE緩沖液的1.8%和0.7%瓊脂糖凝膠電泳聯合QIAQUICK?凝膠提取試劑盒來純化分別為265bp和661bp的片段。為了創建載體片段，用AgeI和NdeI消化pMB1537。通過使用TAE的0.7%瓊脂糖凝膠電泳聯合QIAQUICK?減膠提取試劑盒來純化所得的5148bp片段。[0360]隨后使用快速DNA連接試劑盒(RocheDiagnosticsCorporation,Indianapolis,IN,USA)連接所有三種片段。根據制造商的說明書，使用2yI反應液轉化大腸桿菌XL10-G0LD?:超感受態細胞(Stratagene,LaJolla,CA,USA)。使用BioRobot9600自大腸桿菌轉化體制備質粒DNA。對包含插入物的分離的質粒測序,其中使用IuI質粒模板，1.6ngM13引物(正向的或反向的)，補至6iil的水。將鑒定出具有正確序列的所得質粒命名為pBM126a(圖3)。[0361]實施例4:表達載體pMB1539的構建[0362]構建了質粒pMB1539以包含在TPI啟動子控制下的編碼細毛嗜熱霉脂肪酶變體的基因(SEQIDNO:9是DNA序列，而SEQIDNO:10是推導的氨基酸序列)。[0363]使用EXPAND?高保真PCR系統通過PCR制備了包含細毛嗜熱霉脂肪酶變體基因的基因片段，其中使用作為模板的包含細毛嗜熱霉野生型脂肪酶基因(SEQIDNO:7)的pENil298(W000/24883)和下文所示引物349699和353031。[0364]引物349699:[0365]5，-CAAGAAGATTACAAACTATCAATTTCATACACAATATAAACGATTAAAAGAAAGCTTCACCATGAGGAGCTCCCTTGTGCTGTTCTTTGTCTCTG-3’(SEQIDNO:17)[0366]引物353031:[0367]5，-GAGGGCGTGAATGTAAGCGTGACATAACTAATTACATGATGCGGCCCTCTAGATTATCAAAGACATGTCCCAATTAACCCGAAGTAC-3’(SEQIDNO:18)[0368]PCR擴增反應混合物含有大約50ngpENil298質粒DNA,IiU引物349699(50pmol/uI)，Iyl引物353031(50pmol/ul)，5yI含15mMMgCl2的IOXPCR緩沖液(Roche,Indianapolis,IN,USA)，IyIdNTP混合物(每種IOmM)，40.25yI水，和0.75u1(3.5U/uI)DNA聚合物混合物(Roche,Indianapolis,IN,USA)。使用PTCPeltier熱循環儀來擴增片段，程序為94°C2分鐘的I個循環；10個循環每個為94°C15秒、55°C30秒和72°C15秒；15個循環每個為94°C15秒、55°C30秒和72°C15秒(每個連續的循環遞加5秒延長);72°C7分鐘的I個循環；和10°C維持。[0369]PCR擴增后，使用GF\KPCRDNA和凝膠條帶純化試劑盒純化993bpDNA片段。將所得片段(IOOng)與實施例1中所述pSTED226載體片段(IOOng)混合，并通過電穿孔轉化入電感受態釀酒酵母JG169細胞，其中根據制造商的步驟使用設定為1.5千伏的GENEPULSER?和脈沖控制儀及2mm縫隙的電擊杯。然后將經過轉化的細胞涂布到酵母ura減選擇板上并在30°C溫育5天。[0370]將來自上述步驟的ー個酵母克隆在SCura減板上再劃線，并用ー個酵母單菌落接種50ml搖瓶中的IOmlSCura減培養基并在30°C，250rpm溫育過夜。使用來自此培養物的2ml培養液進行質粒制備，其中使用用于酵母質粒制備的QIAPREP?'旋轉微量制備試劑盒。稍后將質粒測序并驗證了預期的DNA序列。將質粒命名為pMB1539(圖4)。[0371]實施例5:表達載體pJLinl68的構建[0372]利用CUPl啟動子的細毛嗜熱霉脂肪酶變體表達載體的構建是通過將pBM126a(包含在CUPl啟動子控制下的細毛嗜熱霉野生型脂肪酶基因)中的細毛嗜熱霉野生型脂肪酶基因用來自PMB1539的細毛嗜熱霉脂肪酶變體基因交換而實現的。首先，用HindIII和MluI消化pBM126a和pMB1539二者，并使用QIAQUICK?凝膠提取試劑盒凝膠純化來自pBM126a的5kb片段和來自pMB1539的1.1kb片段。隨后使用快速DNA連接試劑盒連接兩片段，其中載體:插入物的摩爾比為1:2、1:3和1:4且載體量設定為50ng。命名為pJLinl68(圖5)的所得質粒包含在CUPl啟動子控制下的細毛嗜熱霉脂肪酶變體基因。[0373]實施例6:表達載體pBM142c和pBM143b的構建[0374]設計了如下引物，用于使用QUIKCHANGE?定點誘變試劑盒(Stratagene,LaJolla,CA,USA)從pJLinl68中的細毛嗜熱霉變體脂肪酶的前肽序列消除編碼氨基酸SPIRR的最后五個密碼子:[0375]引物998570:[0376]5，-CTCTGCGTGGACGGCCTTGGCCGAGGTCTCGCAGGATCTGTTTAAC-3，(SEQIDNO:19)[0377]引物998571:[0378]5，-TTAAACAGATCCTGCGAGACCTCGGCCAAGGCCGTCCACGCAGAG-3，(SEQIDNO:20)[0379]在50ill終體積中含有73ngpJLinl68,IXQUIKCHANGE⑩.反應緩沖液(Stratagene,LaJolla,CA,USA),4UIQUIKS0LUT10N⑧(Stratagene,LaJolla,CA,USA),IylXLdNTP混合物(Stratagene,LaJolla,CA,USA)，和IyI2.5U/uIPfuUltra?DNA聚合酶(Stratagene,LaJolla,CA,USA)的PCR反應液中，使用100皮摩爾姆種引物。EPPENDORF?MASTERCYCLER?編程為:95°CI分鐘的I個循環；18個循環每個為950C50秒、60°C50秒和68°C6分鐘:和10°C維持。將IylDpnI直接添加至擴增反應液并在37°C溫育I小吋。根據制造商的說明書，使用2Ul體積的DpnI消化反應液轉化大腸桿菌XL10-G0L])JU感受態細胞(Stratagene,LaJolla,CA,USA)。通過DNA測序證實了ー個克隆不含對應于SPIRR編碼區的15bp，并命名為pBM142c(圖6)。[0380]為了避免在pBM142c中產生額外的突變，將來自pBM142c的細毛嗜熱霉變體脂肪酶基因的5’區克隆回到pJLinl68中。用HindITT和NdeI消化質粒pBM142c，并通過使用TAE緩沖液的1.5%瓊脂糖凝膠電泳聯合QIAQnCK?臧膠提取試劑盒來純化0.6kb片段。用HindIII和NdeI消化質粒pJLinl68，并通過使用TAE緩沖液的0.7%瓊脂糖凝膠電泳聯合QIAQUICK?凝膠提取試劑盒來純化所得5.5kb片段。隨后使用快速DNA連接試劑盒連接兩片段。命名為pBM143b(圖7)的所得表達質粒包含驅動細毛嗜熱霉變體脂肪酶基因表達的CUPl啟動子。如此，22個氨基酸的信號/前肽序列通過消除最后五個氨基酸(SPIRR)變成了17個氨基酸。[0381]實施例7:用pJLinl68和pBM143b轉化釀酒酵母[0382]使用YEASTMAKER?酵母轉化系統(Clonetech，PaloAlto,CA,USA)根據制造商的說明書將質粒pJLinl68和pBM143b轉化入釀酒酵母菌株JG169。簡言之，將ー個釀酒酵母JG169菌落接種入50mlYPD培養基并在軌道搖床上以250rpm在30°C溫育過夜。在細胞達到600nm吸光度為0.4-0.5時，將細胞以700xg離心5分鐘，丟棄上清液，并將沉淀物重懸于30ml去離子水。以700xg離心5分鐘后，將細胞沉淀物重懸于1.5ml1.1XTE/醋酸鋰溶液(IlOmM醋酸鋰，IlmMTris,pH8,1.1mMEDTA)。在微型離心機中以12，OOOxg離心15秒后，將細胞沉淀物重懸于600uI1.1XTE/醋酸鋰溶液。添加大約0.5ug載體DNA，250UIPEG/醋酸鋰溶液(40%PEG4000,0.1M醋酸鋰，IOmMTris-HCl,pH8，ImMEDTA)，和5yI10mg/ml變性鯡魚精巢載體(HerringTestesCarrier)DNA至50iiI感受態細胞后，將混合物以550rpm在30°C搖動30分鐘，并通過每10分鐘顛倒將細胞混合。將總體積20UIDMSO添加至每份轉化混合物，并在42°C溫育15分鐘，且每5分鐘顛倒混合物。將轉化混合物在微型離心機中以12，OOOxg離心15秒，將細胞重懸于ImlYPDPLUS?液體培養基(YEASTMAKER?酵母轉化系統，Clonetech,PaloAlto,CA,USA)并在550rpm和30°C搖動90分鐘。以13，OOOxg離心后，用Iml0.9%NaCl溶液洗滌細胞并在15%甘油存在下重懸于Iml酵母ura減選擇培養基。將50iU每份轉化反應液一式兩份涂布到酵母ura減選擇板上并在30°C溫育直至出現菌落。[0383]實施例8:用質粒pJLinl68和pBM143b表達細毛嗜熱霉脂肪酶變體的評估[0384]在搖瓶中評估自pJLinl68和pBM143b表達細毛嗜熱霉脂肪酶變體的情況。將來自實施例7的5個含有pJLin168或pBM143b的代表性釀酒酵母JG169轉化體一式兩份在含有25ml“初始”培養基的搖瓶中培養。在第4、5和7天收獲搖瓶樣品。在如下測定法中使用對硝基苯基丁酸酯作為底物測量培養物上清液的脂肪酶活性:首先將培養物上清液在`0.1MMOPS,4mMCaCl2,0.01%TritonX-100緩沖液，pH7.5(樣品緩沖液)中1/15倍稀釋，接著系列稀釋，自0倍到1/3倍到1/9倍稀釋的樣品。將LIP0LASE?標準品(NovozymesA/S，BagSVierd,Denmark)在樣品緩沖液中使用兩倍步驟(two-foldsteps)稀釋，自1.0LU/ml濃度開始，到0.125LU/ml濃度結束。將總共20UI每種稀釋液(包括標準品)轉移至96孔平底板。將200uI對硝基苯基丁酸酯底物溶液(對硝基苯基丁酸酯對DMSO對0.1MMOPSpH7.5的比例為1:99:400)添加至每個孔，然后在25°C溫育15分鐘。在溫育結束吋，對96孔板測量405nm吸光度。由生成的標準曲線通過外推(extrapolation)來測定樣品濃度。[0385]對于第4天、第5天和第7天采集的樣品，pJLinl68轉化體的平均相對脂肪酶活性分別為14、26和22(圖8)。對于第4天、第5天和第6天采集的樣品，pBM143b轉化體的平均相對脂肪酶活性分別為69、100和92(圖9)。[0386]為了驗證脂肪酶活性測定法的結果，對來自樣品的上清液實施SDS-PAGE。將來自第5天取樣的兩份搖瓶樣品的20iiI培養物上清液與Laemmli樣品緩沖液(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)以1:2的比例混合。煮沸2分鐘后，將樣品以及15UIPRECISIONPLUSPROTEIN?標準品(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)加載到10-20%SDS-PAGE凝膠(Bio-RadLaboratories,Inc.，Hercules,CA,USA)上。在IXTris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)中以200V跑膠I小吋。然后將凝膠用水漂洗3次，每次5分鐘，并用B10-SAFE?考馬斯染料(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)染色I小時，接著用水脫色至少30分鐘。[0387]SDS-PAGE結果顯示了對于pBM143b轉化體觀察到的增加的脂肪酶活性對應于增加的蛋白質水平。[0388]實施例9:細毛嗜熱霉脂肪酶變體信號序列的誘變[0389]使用包含細毛嗜熱霉野生型脂肪酶基因的質粒pMB1537來構建細毛嗜熱霉脂肪酶信號肽的隨機誘變文庫。通過PCR擴增信號肽編碼序列的隨機誘變PCR片段和側翼DNA區，其中使用EXPAND?高保真PCR系統和下文所示引物(DNA-Technology,Aarhus,Denmark)。[0390]引物309787:[0391]5，-CTAGGAACCCATCAGGTTGGTGGAAG-3’(SEQIDNO:21)[0392]引物373172:[0393]5，-CTGTGCAAAGAGATTGAACTGGTTAAACAGATCCTGCGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCATGGTGAAGCTTTCTTTTAA-3，(SEQIDNO:22)[0394]其中:[0395]SEQIDNO:22第41、50、51、60、64、66、68、70、71、72、74、75、77、80、82、83和87位的N是99%的A和1%的G、C、或T;[0396]SEQIDNO:22第40、46、47、52、53、56、62、65、67、73、78、84、85、86和88位的N是99%的G和1%的A、C、或T;[0397]SEQIDNO:22第42、43、45、48、49、54、55、58、59、61、63、69、76、79、81、89、91和92位的N是99%的C和1%的A、G、或T;且[0398]SEQIDNO:22第44、57、90和93位的N是99%的T和1%的A、C、或G。[0399]遵循如下規則設計了引入多祥性的引物:隨機化位置處的野生型堿基始終以99%存在，而另三種堿基以1%存在且所有三種同等展現。[0400]使用EXPAND?高保真PCR系統通過PCR擴增了信號肽編碼序列的誘變片段。PCR擴增反應混合物含有大約50ngpMB1537,Iyl引物309787(50pmol/yl)，lul弓丨物373172(50pmol/ii1)，I含15mMMgCl2的10XPCR緩沖液(Roche,Indianapolis,IN,USA),IiiIdNTP混合物(每種IOmM)，40.25yI水，和0.75u1(3.5U/uI)DNA聚合酶混合物(Roche,Indianapolis,IN,USA)。使用PTCPeltier熱循環儀來擴增片段，程序為94°C2分鐘的I個循環；10個循環每個為94°C15秒、55°C30秒和72°C15秒；15個循環每個為94°C15秒、55°C30秒和72°C15秒(每個連續的循環遞加5秒延長);72°C7分鐘的I個循環；和10°C維持。[0401]通過PCR制備細毛嗜熱霉野生型脂肪酶基因的基因片段，其中在使用EXPAND?高保真PCR系統的PCR反應中使用pMB1537作為模板。PCR中所使用的引物是上文所述309787和373172。[0402]PCR擴增后，使用GFX?PCRDNA和凝膠條帶純化試劑盒根據制造商的規程純化600bpPCR片段，并在50uIIOinMTris-HClpH8.0中洗脫。[0403]通過在信號肽編碼序列內的DNA位置用SacI消化將質粒pMB1537線性化。使用線性化載體作為釀酒酵母JG169轉化中的受體DNA，其中使用信號肽編碼序列及側翼DNA區(與受體質粒的受體DNA100%同源)的PCR片段作為供體DNA。[0404]具體而言，將大約3iig經SacI消化的pMB1537與大約IUg600bpPCR片段一起電穿孔入IOOiIl電感受態釀酒酵母JG169細胞，其中使用設定為1.5千伏的GENEPULSER?和脈沖控制儀及2mm縫隙的電擊杯。電穿孔后，給經過轉化的細胞提供Iml的IM山梨醇，并在30°C溫育I小時，之后將1.1ml涂布到每ml補充有100ug氨芐青霉素的SCura減板上。[0405]自姆ml補充有100ug氨節青霉素的SCura減板挑取總共8400個菌落并轉移至96孔聚苯こ烯微孔板，即將挑取的克隆施加至B-H行1-12列的孔，讓A行空著，其接種釀酒酵母JG169中的野生型質粒構建體作為野生型參照。所有孔包含每升添加40mg腺嘌呤的SD培養基-URA(稱為SDMUA)(遵循制造商的推薦，Qbiogene,Inc.，BIO101?系統，AHDiagnostics,Aarhus,Denmark)。將板在30°C和250rpm溫育5天。5天后，在使用下文所述對硝基苯基戊酸酯測定法測量脂肪酶活性之前將板保持在4°C。[0406]在如下測定法中使用對硝基苯基戊酸酯作為底物測量了培養物上清液的脂肪酶活性。在50mMTrispH7,IOmMCaCl2,0.4%TritonX-100緩沖液(稀釋緩沖液)中稀釋培養物上清液。將LIP0LASE?標準品(NovozymesA/S,BagSVcerd,Denmark)在樣品緩沖液中使用兩倍步驟稀釋，自1.0LU/ml濃度開始，到0.125LU/ml濃度結束。在聚苯こ烯微孔板中，將10UI上清液與90uI稀釋緩沖液混合。將100uI對硝基苯基戊酸酯底物溶液(117Ul對硝基苯基戊酸酯溶解于IOml異丙醇)添加至每個孔，簡單混合，然后在3分鐘里每12秒測量405nm吸光度。評估測定數據以鑒定活性比釀酒酵母JG169中pMB1539構建體(A行孔中)聞的所有樣品。[0407]收集活性比參照高的所有克隆作為陽性命中(positivehit)并在相同設置中再次分析，將活性仍比參照高的所有克隆作為接種材料用于微孔板中的新鮮SDMUA培養基。A行再次用于參照菌株。將板如上`所述接種，并如上所述分析。[0408]移出活性比參照高的所有克隆并在SC-瓊脂板上再劃線。收集所有克隆的單菌落用于在微孔板中在200uISDMUA培養基中和在裝有10mlSDMUA培養基的50ml管中在30°C再次培養5天，之后使用上文所述對硝基苯基戊酸酯測定法將產量(yield)與參照菌株的產量進行比較。[0409]在3個鄰近的微孔和3個單獨的50ml管中培養每個克隆。使用這3個培養實驗的平均值來比較活性水平。[0410]最后，將在微孔板和50ml管中都具有最聞脂肪酶活性的克隆接種含有IOmlSDMUA培養基的搖瓶(帶有兩個擋板的250ml錐型帶擋板搖瓶)并在30°C以250rpm溫育5天。使用上文所述對硝基苯基戊酸酯測定法對上清液測定脂肪酶活性。將具有最高脂肪酶活性的克隆進行DNA測序。[0411]將顯示出最高活性的克隆命名為MB1665，其在脂肪酶信號肽中具有R2K取代(信號肽的第二個密碼子自AGG變成AAG)。[0412]通過使用與實施例4所述相同的原理，將編碼此信號肽的DNA轉移至編碼細毛嗜熱霉脂肪酶變體的PMB1539構建體。在這種情況中使用與實施例4所述相同的步驟制備了更小的PCR片段。然而，也根據實施例4但是使用來自MB1539的質粒DNA作為模板制備了更大的片段。如上所述進行了釀酒酵母JG169的GAP修復和轉化。此克隆方法產生了具有細毛嗜熱霉脂肪酶變體的更高表達的克隆。將此克隆命名為釀酒酵母MB1681。[0413]將來自SC-瓊脂板(在30°C培養5天)的釀酒酵母MB1681細胞材料用于接種50ml搖瓶中的IOmlSCura減培養基并在30°C、250rpm溫育過夜。使用來自此培養物的2ml培養液進行質粒制備，其中使用用于酵母質粒制備的QIAPREP?旋轉微量制備試劑盒。根據制造商的說明書，將經過純化的質粒轉化入大腸桿菌ToplOF’(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)。將經過轉化的大腸桿菌細胞涂布到每ml補充有100yg氨芐青霉素的LB板上。分離單菌落，再劃線，接種入LB培養基，并在30°C溫育過夜。將Iml過夜培養物用于質粒制備，其中使用QIAPREP?旋轉微量制備試劑盒。最后，將分離的質粒用作DNA測序的模板，驗證了變體信號序列(SEQIDNO:3)和細毛嗜熱霉脂肪酶變體編碼區(SEQIDN0:9及SEQIDNO:10之推導的氨基酸序列)的序列。將所得質粒命名為pMB1682(圖10)。質粒pMB1682包含TPI啟動子和細毛嗜熱霉脂肪酶變體編碼區(不含SPIRR、具有R2K變化(withoutSPIRRwithaR2Kchangeノ)。[0414]實施例10:pJLinl95的構建[0415]構建了質粒pJLinl95以包含利用釀酒酵母CUPl啟動子的細毛嗜熱霉脂肪酶變體(具有含R2K變化且不含SPIRR的信號序列)表達載體。[0416]將pMB1682的HindII1-NdeI片段克隆入經過HindIII和NdeI消化的pBM143b，即將第二個氨基酸Arg的編碼序列(AGG)替換成Lys的編碼序列(AAG)。將pMB1682和pBM143b二者用HindIII和NdeI消化，并用QIAQUICK?減膠提取柱凝膠提取來自pMB1682的Ikb片段和來自pBM143b的5kb片段。使用快速DNA連接試劑盒根據制造商的說明書將片段連接到一起，其中載體對插入物的摩爾比為1:2、1:1和3:1且載體量為50叩。將通過DNA測序驗證的所得質粒命名為pJLinl95(圖11)。[0417]實施例11:用pJLinl95和pBM143b轉化釀酒酵母[0418]將質粒pBM143b和pJLinl95單獨轉化入釀酒酵母菌株JG169，如實施例7所述，只是使用YPD培養基代替YPDPLUS?液體培養基。同樣，在用0.9%NaCl洗滌后，將ura減培養基中的200uI細胞懸浮液直接涂布于酵母ura選擇板。將菌落在酵母ura選擇板上劃線，培養每種轉化體的兩個菌落并使用培養液測定脂肪酶活性。[0419]將純化的包含pBM143b或pJLinl95的釀酒酵母JG169轉化體(每種構建體至少10個)一式兩份接種入96孔板中的180uIura選擇培養基并在30°C、250rpm溫育過夜。然后將過夜培養物在180illCUP減ura培養基中稀釋100倍，并在30°C、250rpm培養5天。將相同培養基(只是存在IOmM尿苷)中培養的釀酒酵母JG169包括在內作為陰性對照。[0420]如實施例8所述測定脂肪酶活性。pBM143b和pJLinl95轉化體的相對平均脂肪酶活性分別為51和100(圖12)。t檢驗顯示了pJLinl95轉化體的活性顯著不同于pBM143b轉化體。結果表明R2K信號序列將細毛嗜熱霉脂肪酶變體產量改善了2.1倍。[0421]實施例12:在搖瓶中評估含質粒pJLinl95和pBM143b的細毛嗜熱霉脂肪酶變體的表達[0422]為了進行搖瓶分析，將代表性的pBM143b和pJLinl95轉化體接種入2mlura選擇培養基并在30°C、250rpm溫育過夜。然后將過夜培養物在125ml塑料搖瓶中在25mlCUP減ura培養基中稀釋200倍并在30°C、250rpm培養6天。在第5和6天采集樣品并在微型離心機中以12，OOOxg離心10秒。如實施例8所述對上清液測定脂肪酶活性。[0423]結果顯示了脂肪酶活性在第5-6天左右達到峰值(圖13)。當在搖瓶中培養時第5天的總脂肪酶活性高于96孔樣品。平均而言，具有R2K信號序列的細毛嗜熱霉脂肪酶變體在第5天顯示出2倍高(2-foldhigher)的相對脂肪酶活性(野生型細毛嗜熱霉脂肪酶變體為I)。因此，25ml搖瓶顯示出與在96孔板中培養的培養物相似的結果。具有R2K信號序列的細毛嗜熱霉脂肪酶變體在第6天顯示出比第5天稍高的活性，所以第6天的改進甚至更高。[0424]為了驗證脂肪酶活性測定法的結果，如實施例8所述對來自搖瓶的上清液進行了SDS-PAGE0SDS-PAGE結果顯示了來自代表性轉化體的細毛嗜熱霉脂肪酶變體條帶的強度與脂肪酶活性測定法的結果一致。[0425]實施例13:細毛嗜熱霉脂肪酶變體的N端序列分析[0426]在具有在線(on-line)毛細管HPLC和液相三氟こ酸(TFA)遞送的ProcisecLC蛋白質測序儀(AppliedBiosystems,FosterCity,CA,USA)上進行了N端測序。使用10%甲醇中的IOmMCAPS(3-[環己基氨基]-1-丙磺酸)，pHll.0將蛋白質樣品自SDS-PAGE凝膠電印跡到PVDF膜(Invitrogen,SanDiego,CA,USA)上，在具有電印跡凝膠裝置的NOVEX?XCellII(Invitrogen,SanDiego,CA,USA)上以25伏運行2小時或者在配備有TRANS-BL0T?轉移室的CRITERION?鋮膠裝置(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA,USA)上以100伏運行2小時。將PVDF膜用40%甲醇/1%こ酸中的0.1%考馬斯藍R-250染色20秒，并在50%甲醇中脫色以觀察蛋白質條帯。切下染色的蛋白質條帶并測序。こ內酰苯硫脲(phenylthiohydantoin)-氨基酸的檢測是通過在線毛細管HPLC來完成的,其中使用500ml在水中含有3.5%四氫呋喃的緩沖液A及9ml含有こ酸、こ酸鈉和己磺酸鈉(sodiumhexanesulfonate)的Premixa濃縮液(AppliedBiosystems,FosterCity,CA,USA)和含有こ腈/2-丙醇的溶劑B2。使用APPLIEDBIOSYSTEMS?610數據分析軟件2.1a版在MACINTOSH?G4處理器上收集`和分析數據。序列測定通過對著光源顯現層析圖來進行。[0427]N端測序分析顯示了對攜帶R2K變體信號序列的細毛嗜熱霉脂肪酶變體的正確加エ。pJLinl95轉化體測定的N端序列為EVSQDLFNQFN(SEQIDNO:10氨基酸ト11)。[0428]實施例14:pJLinl87的構建[0429]通過在來自pJLinl68的脂肪酶基因中引入L269I變化并通過將該脂肪酶片段亞克隆入米曲霉表達載體pBM120a，構建了質粒pJLinl87。使用下文所示基因特異性正向和反向引物來進行PCR擴增。[0430]正向引物:[0431]5’-ACACAACTGGCCATGAGGAGCTCCCTTGTGCTGTTC-3’(SEQIDNO:23)[0432]反向引物:[0433]5，-AGTCACCTCTAGTTAA77/1/1TTATCAAATACATGTCCCAA-3，(SEQIDNO:24)[0434]粗體字母代表編碼序列，而斜體字母代表添加至細毛嗜熱霉脂肪酶變體基因3’端的PacI位點。反向引物中加下劃線的AAT指示脂肪酶基因中用以獲得L269I的核苷酸變化。剰余序列與pBM120a插入位點側翼的區域同源。[0435]使用EXPAND?高保真PCR系統根據制造商的說明書進行PCR擴增。每份PCR反應液含有IuIpJLinl68,200uMdNTPs，IyM正向和反向引物，IX反應緩沖液，和2.6個單位EXPAND?高保真酶混合物。將反應液使用EPPENDORF?MASTERCYCLER?進行擴增，程序為94°C2分鐘的I個循環；10個循環每個為94°C15秒、58.3°C30秒和72°CI分15秒；15個循環每個為94°C15秒、58.30C30秒和72°CI分15秒(每個連續的循環遞加5秒延長)；和720C7分鐘的I個循環。使用QIAQUICK?PCR純化試劑盒純化0.9kbPCR產物，然后使用INFUSION?克隆試劑盒(BDBiosciences,PaloAlto,CA,USA)克隆入pBM120a。INFUSION?克隆反應物由IXINFUSION?緩沖液(BDBiosciences,PaloAlto,CA,USA)，IXBSA(BDBiosciences,PaloAlto1CA,USA),IuIINFUSION?酶(1:10稀釋的)，IOOng用NcoI和PacI消化的pBM120a，和50ng純化的包含脂肪酶基因的PCR產物組成，總體積50u10將反應液在室溫溫育30分鐘。[0436]使用2ill反應液轉化大腸桿菌SOLOPACK?Gold超感受態細胞(Stratagene,LaJolla,CA,USA)。將通過限制性消化和測序分析驗證的包含期望脂肪酶序列的pBM120a質粒之一命名為pJLinl87(圖14)。[0437]實施例15:pBM120表達載體的構建[0438]構建了質粒pBM120a以獲得包含雙NA2啟動子(NA2_NA2_tpi)用于在曲霉屬物種中驅動基因表達且包含氨芐青霉素抗性基因用于在大腸桿菌中選擇的質粒。[0439]設計了引物用于自pJaL721(W003/008575)中PCR擴增雙NA2啟動子。添加了限制酶位點SalI和NcoI(加下劃線)用于將雙啟動子克隆入曲霉表達質粒pAlLol(W02005/067531)。[0440]5，-GTCGACATGGTGTTTTGATCATTTTA-3，(SEQIDNO:25)[0441]5，-CCATGGCCAGTTGTGTATATAGAGGA-3，(SEQIDNO:26)[0442]使用EXPAND?高保真PCR系統通過PCR擴增感興趣片段。PCR擴增反應混合物含有I0.09iig/iil的pJaL721,Iiil每種引物(50pmol/iil)，5iiI含15mMMgCl2的IOXPCR緩沖液，IiiIdATP、dITP、dGTP和dCTP混合物(每種IOmM)，37.25yI水，和0.75illDNA聚合酶混合物(3.5U/ill)。為了擴增片段，將EPPENDORF?MASTERCYCLER?編程為94°C2分鐘的I個循環；10個循環每個為94°C15秒、55°C30秒和72°C1.25分鐘；15個循環每個為94°C15秒、55°C30秒和72°C1.25分鐘(每個連續的循環遞加5秒延長);和720C7分鐘的I個循環；和10°C維持。將10ill此PCR反應液與IIOXDNA加樣染料(25%甘油，IOmMTrispH7.0,IOmMEDTA,0.025%溴酚藍，0.025%ニ甲苯藍)混合并使用TAE緩沖液在1.0%(w/v)瓊脂糖凝膠上運行。在凝膠顯現系統(Nucleotech,SanMateo,CA,USA)上用紫外光觀察1128bpPCR產物。根據制造商的說明書，將PCR產物直接連接入pCR2.1-T0P0?。將IiiI體積的新鮮PCR產物，3ill雙蒸水，和IT0P0?.克隆載體用移液器尖頭(pipette)混合并在室溫溫育5分鐘。[0443]溫育后，使用2iU混合物轉化0NESH0T?T0P10化學感受態大腸桿菌細胞(InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA,USA)。將2iiI體積的連接混合物添加至大腸桿菌細胞并在冰上溫育5分鐘。隨后，將細胞在42°C熱休克30秒，然后在冰上放置2分鐘。將250uI體積的SOC培養基添加至細胞并將混合物在37°C和250rpm溫育I小吋。溫育后，將菌落涂布在每ml補充有100ug氨芐青霉素的2XYT板上并在37°C溫育過夜，用于選擇質粒。用無菌牙簽挑取8個在板上生長的菌落并在含有3ml每ml補充有100ug氨芐青霉素的LB培養基的15mlFALCONk管中在37°C、250rpm培養過夜。使用BioRobot9600分離質粒。[0444]用EcoRI消化4iiI體積的所得質粒微量制備物。如先前關于PCR反應所述通過瓊脂糖凝膠電泳和UV分析來分析消化反應。將分離的包含插入物的質粒測序，其中使用IUI質粒模板，1.6ng的M13引物(正向的或反向的)，和補至6iil的水。將所得質粒命名為pBM121b(圖15)。[0445]用SalI和NcoI消化5UI體積的pBM121b。如上所述通過瓊脂糖凝膠電泳分析消化反應，并連接至先前用SalI和NcoI消化的載體pAlLol。將所得表達質粒命名為pBM120a(圖16)。[0446]實施例16:包含疏棉狀嗜熱霉(Thermomyceslanuginosa)脂肪酶變體基因的米曲霉載體的構建[0447]自pJLinl87PCR擴增細毛嗜熱霉脂肪酶變體基因，pJLinl87是攜帶脂肪酶變體基因的曲霉屬表達載體。pJLinl87中的脂肪酶基因包含編碼氨基酸變化L269I的突變，這在PCR過程中得到了糾正。使用下文所示基因特異性引物使用EXPAND?高保真PCR系統PCR擴增基因。[0448]正向引物:[0449]5’-ACACAACTGGCCATGAGG.AGCTCCCTTGTGCTGTTC-3’(SEQIDNO:27)[0450]反向引物:[0451]5，-AGTCACCTCTAGTTAATTAATTATCAAAgACATGTCCCAATTAACCC-3，(SEQIDNO:28)`[0452]粗體字母代表編碼序列，加下劃線的部分表示所引入的PacI位點，小寫字母為預期的變化，而剩余序列是與PBM120中的插入點同源的側翼區。[0453]PCR反應液含有IOOngpJLinl87,200uMdNTPs,300nM每種引物，1XEXPAND?高保真緩沖液(含MgCl2的)，和2.6個單位EXPAND?高保真酶混合物。使用EPPEND0RIルMASTERCYCLER?進行擴增，程序為94°C2分鐘的I個循環；10個循環每個為94°C15秒、550C30秒和72°CI分鐘；和15個循環每個為94°C15秒、55°C30秒和72°CI分鐘，然后是15個循環的每ー個之后72°C延長步驟額外増加5秒。[0454]使用TAE緩沖液在1%瓊脂糖凝膠上運行PCR反應混合物并切下與913bp插入物對應的條帶。通過MINELUTE?瓊脂糖提取試劑盒(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA)根據制造商的方案自樣品提取DNA片段。[0455]使用INFUSION?克隆試劑盒將PCR產物直接克隆入表達載體pBM120，而不需要進行限制性消化和連接。INFUSION?.克隆反應液由IXINFUSION?反應緩沖液，IXBSA,IOOng用PacI和NcoI消化的pBM120,108.4ng經純化的PCR捆入物，和IylINFUSION?酶(1:10稀釋的)構成。將反應液在室溫溫育30分鐘并根據制造商的規程用IUI轉化SOLOPACK?Gold超感受態細胞(Stratagene,LaJolla,CA,USA)。DNA測序鑒定了ー個正確克隆，產生了細毛嗜熱霉脂肪酶變體基因表達載體。將所得質粒命名為pJMS7(圖17)。[0456]實施例17:具有R2K信號肽并缺失SPIRR的米曲霉載體的構建[0457]從攜帶疏棉狀嗜熱霉脂肪酶變體基因之基因的pJLinl95中PCR擴增具有信號肽序列變化R2K和SPIRR缺失的細毛嗜熱霉脂肪酶變體基因。使用如下引物PCR擴增基因。[0458]正向引物:[0459]5’-CTCTATATACACAACTGGCCATGAAGAGCTCCCTTGTGCTGTTC-3’(SEQIDNO:29)[0460]反向引物:[0461]5，-CAGGTGTCAGTCACCTCTAGTTATCAAAGACATGTCCCAATTAACCC-3，(SEQIDNO:30)[0462]粗體序列對應于疏棉狀嗜熱霉脂肪酶變體編碼區而剩余序列為與PBM120中的插入點同源的側翼區。PCR反應和熱循環條件與實施例16中用于細毛嗜熱霉脂肪酶變體基因的那些相同。如實施例16所述使用TAE緩沖液在1%瓊脂糖凝膠上運行PCR反應液并切下DNA片段。[0463]使用NFUSION?克隆試劑盒將PCR產物直接克隆入表達載體pBM120。INFUSION丨？反應液與實施例16中的相同，只是使用64ng經純化的PCR插入物。使用制造商建議的規程用I反應液轉化SOLOPACK?Gold超感受態細胞。DNA測序證實了PCR沒有引入錯誤。將所得質粒命名為PJMS6(圖18)。[0464]實施例18:具有R2K信號肽突變的米曲霉載體的構建[0465]使用QUIKCHANGE?IIXL定點誘變試劑盒(Stratagene,LaJolla,CA,USA)來突變質粒PJMS7，其通過將細毛嗜熱霉脂肪酶變體基因的信號肽序列中的R變成K進行。誘變反應由三個步驟組成:使用下文所示誘變引物進行的突變鏈合成，模板的DpnI消化，和轉化。[0466]正向引物:5，-CACAACTGGCCATGaagAGCTCCCTTGTG-3’(SEQIDNO:31)[0467]反向引物:5’-CACAAGGGAGCTcttCATGGCCAGTTGTG-3’SEQIDNO:32)[0468]小寫密碼子指示信號序列中的變化。[0469]突變鏈合成反應液由5iiI10X反應緩沖液(Stratagene,LaJolla,CA,USA),IOngpJMS7,125ng每種引物，IyldNTP混合物，3yIQUIKS0LUT10N?(Stratagene,LaJolla,CA,USA)，和2.5個單位PfuUltraHFDNA聚合酶構成。使用EPPENDORF?MASTERCYCLER?進行擴增，程序為95°CI分鐘的I個循環；18個循環每個為95°C50秒、600C50秒和68°C7分鐘；和68°C7分鐘的I個循環。然后將IylDpnI限制酶(lOU/yl)添加至反應液。溫和而徹底的混勻后，將反應混合物以13，OOOxg離心I分鐘并立即在37°C溫育I小時以消化親本超螺旋dsDNA。遵循制造商的說明書，將2ill用DpnI處理的樣品反應液轉化入45iiI大腸桿菌XLIO-Gold超感受態細胞(Stratagene,LaJolla,CA,USA)。16小時后，挑取菌落并進行質粒制備和序列分析。下文所示測序引物位于NA2-tpi啟動子區中且以細毛嗜熱霉脂肪酶變體基因的正向讀取。[0470]5，-ATACTGGCAAGGGATGCCATGCTTGG-3’(SEQIDNO:33)[0471]鑒定出了在信號序列中具有R2K突變的正確克隆。將所得質粒命名為質粒TB5。[0472]實施例19:缺失SPIRR的米曲霉載體的構建[0473]使用下文所示誘變引物使用QUIKCHANGE?IIXL定點誘變試劑盒自pJMS6創建了TB6，其通過將信號序列區中的K變成R進行。誘變步驟與實施例18中所述的那些相同。[0474]正向引物:[0475]5，-CACAACTGGCCATGaggAGCTCCCTTGTG-3’(SEQIDNO:34)[0476]反向引物:[0477]5，-CACAAGGGAGCTcctCATGGCCAGTTGTG-3，(SEQIDNO:35)[0478]小寫密碼子是預期的變化。[0479]通過使用SEQIDNO:33之引物的DNA測序鑒定出了在前肽序列中具有SPIRR缺失的正確克隆。將所得質粒命名為質粒TB6。[0480]實施例20:自pJMS6、pJMS7、質粒TB5和質粒TB6表達細毛嗜熱霉脂肪酶變體[0481]根據標準規程來進行米曲霉BeCh2的原生質體制備和轉化,例如Christensen等，1988，Bio/Technology6:1419-1422。在姆個轉化反應中使用約5yg姆種表達載體。將轉化混合物涂布到COVE板上并在37°C溫育7天。挑取轉化體并轉移至新鮮COVE板并在34°C培養,等待孢子純化(sporepurification)和三丁酸甘油酯測定法(tributyrinassay)。[0482]通過將10%(v/v)三丁酸甘油酯與VNO3RLMT瓊脂的50ml混合物(熔化并在無菌攪拌器中混合)傾倒到150_圓盤中并使其干燥來制備三丁酸甘油酯板。使用無菌牙簽切出孢子的Icmxlcm柱狀樣本(plug)并轉移至三丁酸甘油酯板。姆塊板可容納多至9個柱狀樣本。將板在34°C溫育3-4天并通過清除柱狀樣本周圍的暈圈(haloofclearingaroundtheplugs)來鑒定陽性轉化體。[0483]用pJMS6、pJMS7、質粒TB5和質粒TB6轉化米曲霉Bech2產生了許多在三丁酸甘油酷板上為脂肪酶活性陽性的轉化體(見下表)。[0484]表1:脂肪酶活性為陽性的轉化體的數目【權利要求】1.一種用于產生具有生物學活性的分泌型多肽的方法，其包括:(a)在有益于產生所述多肽的培養基中培養真菌宿主細胞，其中所述真菌宿主細胞包含編碼所述多肽的第一多核苷酸，所述第一多核苷酸與編碼選自下組的變體信號肽或變體前原肽的第二多核苷酸可操作連接:(i)在與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第2位對應的位置處包含取代的親本前原肽變體，其中所述變體前原肽以符合讀碼框的方式連接至所述多肽的氨基末端；和(ii)在與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第2位對應的位置處包含取代且在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的一個或多個位置處包含缺失的親本前原肽變體，其中所述變體肽以符合讀碼框的方式連接至所述多肽的氨基末端；和(b)自所述培養基分離所述具有生物學活性的分泌型多肽。2.權利要求1的方法，其中所述親本信號肽或前原肽選自下組:(a)所述親本信號肽或前原肽分別與SEQIDNO:2氨基酸1-17或SEQIDN0:2氨基酸1-22具有優選至少70%同一性、更優選至少75%同一性、更優選至少80%同一性、甚至更優選至少85%同一丨丨生、最優選至少90%同一丨丨生和甚至最優選至少95%同一丨丨生；(b)所述親本信號肽或前原肽由包含如下核苷酸序列的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列分別與SEQIDNO:1核苷酸1-51或SEQIDNO:1核苷酸1_66具有優選至少70%同一性、更優選至少75%同一性、更優選至少80%同一性、甚至更優選至少85%同一性、最優選至少90%同一性；和(C)所述親本信號肽或前原肽由包含如下核苷酸序列的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列在嚴格條件下分別與SEQIDNO:1核苷酸1-51或SEQIDNO:1核苷酸1_66或者它們的全長互補鏈發生雜交，其中所述嚴格條件定義為在比計算的10°C的溫度在0.9MNaCl,0.09MTris-HClpH7.6，6mMEDTA,0.5%NP-40,IXDenhardt氏溶液，ImM焦磷酸鈉，ImM磷酸二氫鈉，0.1mMATP,和0.2mg/ml酵母RNA中進行預雜交、雜交和雜交后洗滌，并在比計算的Tm低5°C到10°C的溫度在6XSCC加0.1%SDS中洗滌一次15分鐘和使用6XSSC洗滌兩次各15分鐘。3.權利要求1的方法，其中所述親本信號肽包含SEQIDNO:2氨基酸1-17或其保留指導多肽進入細胞的分泌途徑以分泌具有生物學活性的多肽的能力的肽片段，或者由它們組成；且其中所述親本前原肽包含SEQIDNO:2氨基酸1-22或其保留指導多肽進入細胞的分泌途徑以分泌具有生物學活性的多肽的能力的肽片段，或者由它們組成。4.權利要求1的方法，其中在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第2位對應的位置處包含取代的所述親本前原肽變體選自下組:(a)在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第2位對應的位置處包含用Ala、Arg、Asn、Asp、Cys>Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys>Met、Phe>Pro、Ser>Thr>Trp>Tyr或Val取代的變體前原肽；(b)在與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第2位對應的位置處包含Lys取代的變體前原肽；(c)在與前原肽SEQIDNO:2氨基酸1-22的第2位對應的位置處包含R2K取代的變體；(d)包含SEQIDNO:2氨基酸1-22的R2K取代或由進行了R2K取代的SEQIDN0:2氨基酸1-22組成的變體前原肽。5.權利要求1的方法，其中在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第2位對應的位置處包含取代且在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的一個或多個位置處包含缺失的所述親本前原肽變體選自下組:(a)在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第2位對應的位置處包含用Ala、Arg、Asn、Asp、Cys>Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys>Met、Phe>Pro、Ser>Thr>Trp>Tyr或Val取代且在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的一個或多個位置處包含Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val缺失的變體前原肽；(b)在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第2位對應的位置處包含取代且在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的位置處包含缺失的變體前原肽；(c)在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第2位對應的位置處包含用Ala、Arg、Asn、Asp、Cys>Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys>Met、Phe>Pro、Ser>Thr>Trp>Tyr或Val取代且在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的位置處包含Ala、Arg、Asn、Asp、Cys>Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys>Met>Phe>Pro、Ser>Thr>Trp>Tyr或Val缺失的變體前原肽；(d)在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第2位對應的位置處包含Lys作為取代且在分別與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的位置處包含Ser、Pro、He、Arg和Arg的一個或多個缺失的變體前原肽；(e)在與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第2位對應的位置處包含Lys作為取代且在分別與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的位置處包含Ser、Pro、lie、Arg和Arg缺失的變體前原肽；(f)在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第2位對應的位置處包含R2K取代且在分別與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的位置處包含S18*、P19*、120*、R21*和R22*缺失的變體前原肽；(g)包含SEQIDNO:2氨基酸1-22的R2K取代且包含SEQIDNO:2氨基酸1_22的S18'P19'120'R21*和R22*中一個或多個缺失的變體前原肽；(h)包含SEQIDNO:2氨基酸1_22的R2K取代且包含SEQIDNO:2氨基酸1_22的S18'P19'120'R21*和R22*缺失或由其組成的變體前原肽。6.權利要求1的方法，其中所述變體前原肽是SEQIDN0:6。7.權利要求1的方法，其中所述多肽是激素或激素變體、酶、受體或其部分、抗體或其部分、或報道物。8.權利要求1的方法，其中所述真菌宿主細胞是絲狀真菌或酵母細胞。9.權利要求1的方法，其中所述第一多核苷酸編碼包含SEQIDN0:8之成熟多肽的多肽。10.權利要求1的方法，其中所述第一多核苷酸是SEQIDNO:7之成熟多肽編碼序列。11.權利要求1的方法，其中所述第一多核苷酸編碼包含SEQIDNO:10之成熟多肽的多肽。12.權利要求1的方法，其中所述第一多核苷酸是SEQIDNO:9之成熟多肽編碼序列。13.—種分泌型多肽，其是通過權利要求1-14任一項的方法獲得的。14.權利要求13的分泌型多肽，其包含SEQIDN0:8或SEQIDNO:10之成熟多肽。15.一種親本信號前原肽變體，其中所述變體選自下組:(a)在與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第2位對應的位置處包含取代的變體前原肽；和(b)在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第2位對應的位置處包含取代且在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的一個或多個位置處包含缺失的變體前原肽。16.在與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第2位對應的位置處包含取代的權利要求15的變體前原肽，其選自下組:(a)在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第2位對應的位置處包含用Ala、Arg、Asn、Asp、Cys>Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys>Met、Phe>Pro、Ser>Thr>Trp>Tyr或Val取代的變體前原肽；(b)在與SEQIDNO:2氨基酸1_22的第2位對應的位置處包含Lys作為取代的變體前原肽；(c)在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第2位對應的位置處包含R2K取代的變體前原肽；和(d)包含SEQIDNO:2氨基酸1-22的R2K取代或由進行了R2K取代的SEQIDNO:2氨基酸1-22組成的變體前原肽。17.在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第2位對應的位置處包含取代且在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的一個或多個位置處包含缺失的權利要求15的變體前原肽，其選自下組:(a)在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第2位對應的位置處包含用Ala、Arg、Asn、Asp、Cys>Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys>Met、Phe>Pro、Ser>Thr>Trp>Tyr或Val取代且在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的一個或多個位置處包含Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val缺失的變體前原肽；(b)在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第2位對應的位置處包含取代且在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的位置處包含缺失的變體前原肽；(c)在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第2位對應的位置處包含用Ala、Arg、Asn、Asp、Cys>Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys>Met、Phe>Pro、Ser>Thr>Trp>Tyr或Val取代且在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的位置處包含Ala、Arg、Asn、Asp、Cys>Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys>Met、Phe>Pro、Ser>Thr>Trp>Tyr或Val缺失的變體前原肽；(d)在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第2位對應的位置處包含Lys作為取代且在分別與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的位置處包含Ser、Pro、He、Arg和Arg的一個或多個缺失的變體前原肽；(e)在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第2位對應的位置處包含Lys作為取代且在分別與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的位置處包含Ser、Pro、lie、Arg和Arg缺失的變體前原肽；(f)在與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第2位對應的位置處包含R2K取代且在分別與SEQIDNO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位對應的位置處包含S18*、P19*、120*、R21*和R22*缺失的變體前原肽；(g)包含SEQIDNO:2氨基酸1-22的R2K取代且包含SEQIDNO:2氨基酸1_22的S18'P19'120'R21*和R22*中一個或多個缺失的變體前原肽；和(h)包含SEQIDNO:2氨基酸1_22的R2K取代且包含SEQIDNO:2氨基酸1_22的S18'P19'120'R21*和R22*缺失或由其組成的變體前原肽。18.一種前原肽，其包含SEQIDNO:6之氨基酸序列或由其組成。19.一種分離的多核苷酸，其編碼權利要求18的前原肽。20.—種核酸構建體,其包含權利要求19的多核苷酸。21.權利要求20的核酸構建體，其中所述編碼信號肽或前原肽的多核苷酸與編碼多肽的第二多核苷酸可操作連接，其中所述信號肽多核苷酸或所述前原肽多核苷酸的3'端緊挨著位于所述第二多核苷酸的起始密碼子的上游。22.—種重組表達載體，其包含權利要求21的核酸構建體。23.一種重組宿主細胞，其包含權利要求21的核酸構建體。24.一種具有脂肪酶活性的分離的分泌型多肽，其由編碼包含SEQIDNO:8或SEQIDNO:10之成熟多肽序列的多肽的多核苷酸編碼,所述多核苷酸與權利要求15-18中任一項的前原肽編碼序列可操作連接，其中由所述前原肽編碼序列編碼的所述變體前原肽在所述多肽分泌時自全長多肽上切割下來?！疚臋n編號】C12N9/20GK103451164SQ201310341952【公開日】2013年12月18日申請日期:2007年7月13日優先權日:2006年7月14日【發明者】戴比.亞弗,馬茲.E.比約恩瓦德申請人:諾維信股份有限公司,諾維信公司