蛇足石杉植物內生真菌及其在制備石杉堿甲中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及蛇足石杉植物內生真菌，其生物分類和分子生物學鑒定為木霉菌（Trichodermasp.）L44，該菌已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC?NO:M2013198。本發明還提供了其在制備石杉堿甲中的應用。本發明為石杉堿甲的來源提供了一個新的微生物。本發明發明的微生物，有生長繁殖迅速，不受季節，氣候等外界環境的限制，產量提升空間大等優勢。能對藥用植物蛇足石杉的野生資源進行有效的保護，避免過度的采挖。
【專利說明】蛇足石杉植物內生真菌及其在制備石杉堿甲中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于藥用植物的微生物提取和產物培養，具體涉及從蛇足石杉中分離內生真菌和利用內生真菌發酵生產石杉堿甲。
【背景技術】 [0002]大量的流行病學調查資料顯示，全球人口的老齡化己成世界趨勢，阿爾茨海默病又稱阿爾茨海默病性老年癡呆，一般簡稱Alzheimer病(Alzheimer’s disease, AD),是癡呆的最主要類型，當仁不讓地成為了現代社會的“常見病”。據Ellis等研究表明，60歲以上老年人發生癡呆的比率為6-12%;隨著年齡的增長，發病的可能性也明顯增加，如對于85歲以上的老人來說，癡呆的發生率高達20-40%。盡管癡呆有多種類型，但50%以上屬于AD。
[0003]目前，全世界AD的發病人數高達2000萬。在日本65歲以上者老年癡呆癥發病率約為3.8%，其中女性患病率高于男性。在美國AD患病人數已達500萬，并預期在2050年將增加至1000萬，其中每年為AD患者的藥物及護理所支出的費用高達1500億美元，該病已成為除心血管病、癌癥和腦卒中以外危害人民健康的第4大殺手。
[0004]石杉堿甲，是我國首次從蕨類植物石杉科石杉屬植物蛇足石杉中分離出的一種生物堿，其化學結構獨特，與美國FDA批準的其他AD治療藥物(Tacrine、Don印ezil、Rivastigmine、Galanthamine等)相比,石杉堿甲具抑制AChE活性高、毒副作用低、可提高記憶力和保護心血管等特點，成為治療AD最有前景的天然藥物[7]。
[0005]目前石杉堿甲生產僅能從蛇足石杉等石松屬植物中提取，存在嚴重的原料短缺和生態環境破壞等問題。由于石松屬植物植株矮小(l(T30cm)，生境要求苛刻，生長緩慢(自然條件下12cm成苗生長需10~15年)，石杉堿甲含量極低(約0.02%左右)，野生資源十分有限(我國為蛇足石杉主產區，實際商業可采量僅200噸/年)，收集非常困難，無法滿足日益增長的需求。
[0006]為解決石杉堿甲藥源問題，人們對蛇足石杉人工栽培技術進行了探索，但令人遺憾的是，其人工栽培技術一直無法突破。同時，許多機構開展了化學合成及組織細胞培養技術研究。石杉堿甲結構復雜，反應步驟多、反應條件苛刻、得率低、環境污染大，同分異構體因無法分離而導致合成物活性低，化學合成法現無法應用于商業化生產。蛇足石杉等石松屬植物愈傷組織和細胞培養極其困難，自1957年開展石松屬植物組織培養研究以來，研究進展極其緩慢，直到2008年Ma和Gang才實現了粗糙馬尾杉0°.體外繁殖。
[0007]利用植物內生真菌發酵生產植物天然藥物成為一種可供選擇的有效途徑。如能采用內生真菌發酵生產石杉堿甲，不僅能有效地解決HupA的藥物來源、降低藥品價格，而且可有效地保護生態環境。

【發明內容】

[0008]本發明的目的是提供一種蛇足石杉植物內生真菌，同時還提供一種采用該菌種發酵生產高產石杉堿甲的方法，以緩解目前石杉堿甲臨床用藥供給嚴重不足的局面。
[0009]本發明的技術方案如下:蛇足石杉植物內生真菌，經18S rDNA和微生物學鑒定為木霉菌(Trichoderma sp.)L44，該菌已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏時間2013年5 月 9 日，保藏號 CCTCC Ν0:Μ 2013198。
[0010]本發明所屬的菌株(Trichoderma sp.) L44,固體培養特征為:
采用PDA培養基培養L44菌株，菌落形態為:28°C培養2_3天菌落直徑為50mm，培養到5-6天可以鋪滿整個培養皿，菌落在生長2-3天顏色為白色，菌絲細絲狀，5-6天生長至整個平皿。菌落中間有細小的深綠色顆粒狀，培養至6-7天，培養菌落上布滿綠色顆粒狀物，在PDA培養基上反面為乳白色，菌落邊緣一圈略顯淡黃色。
[0011]菌絲形態:菌絲平滑，分枝，無色有隔菌絲。
[0012]菌株(Trichoderma sp.) L44的分生孢子梗粗，無色，直徑為10-15 μ m ;分生孢子頂囊近乎球形，直徑為50-65 μ m，產孢結構單層或雙層，分生孢子球形至近球形，直徑為
2.5-5 μ m0
[0013]本發明以(Trichoderma sp.) L44為發酵生產菌株，培養條件為:
以PDA為培養基，該培養基配方為:常規方法，土豆200g，加水煮沸過濾得濾液，蔗糖20g，加水定容到lL，pH6.5。
[0014]發酵條件:溫度28°C，接種量10%，種齡48h，轉速150r/min，發酵時間7天。發酵結束后對發酵液和菌絲進行化學提取，分離可得石杉堿甲及其類似物。
[0015]本發明所述的蛇足石杉內生真菌(Trichoderma sp.)L44，基因登錄號為KF018088ITS堿基序列為:`
GAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGATCTCTGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGACCAAGGCGCCCGCCGGAGGACCAACCAAAACTCTTTTTGTATACCCCCTCGCGGGTTTTTTATAATCTGAGCCTTCTCGGCGCCTCTCGTAGGCGTTTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCCCTGCCTCTTGGCGGTGGCCGTCTCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACACTCGCATCGGGAGCGCGGCGCGTCCACAGCCGTTAAACACCCAACTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATA本發明的效果:本發明為石杉堿甲的來源提供了一個新的微生物。
[0016]本發明發明的微生物，有生長繁殖迅速，不受季節，氣候等外界環境的限制，產量提升空間大等優勢。能對藥用植物蛇足石杉的野生資源進行有效的保護，避免過度的采挖。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為本發明所述木霉菌(Trichoderma sp.) L44的菌落形態。
[0018]圖2為本發明所述木霉菌(Trichoderma sp.) L44在400倍顯微鏡下的菌絲形態。
[0019]圖3和圖4為本發明所述木霉菌(Trichoderma sp.)L44在電鏡下的孢子形態。
[0020]圖5為本發明所述木霉菌(Trichoderma sp.)L44發酵提取物的薄層圖。
[0021]圖6為本發明所述木霉菌(Trichoderma sp.)L44發酵提取物高效液相圖譜，A為石杉堿甲標準品色譜圖。圖7為本發明所述木霉菌(Trichoderma sp.) L44發酵提取物高效液相圖譜，B為木霉菌(Trichoderma sp.) L44發酵提取物色譜圖。
【具體實施方式】
[0022]以下結合附圖實施例對本發明作進一步描述。
[0023]步驟一:產石杉堿甲木霉菌(Trichoderma sp.)L44的分離篩選 從浙江省杭州市，天目山采集野生蛇足石杉植株，帶回實驗室培養。
[0024]選用新鮮，健康的植物蛇足石杉，去污粉洗凈后，流水沖洗4h。
[0025]在超凈工作臺上按莖、葉、根分開，莖用0.1%升汞溶液消毒15min，葉片和根在
0.1%升汞溶液中浸泡lOmin，取出材料，無菌水沖洗6遍。
[0026]在無菌條件下，將根莖葉分別切成0.5cm的長度接種于MS培養基上。MS培養基配方為:硝酸鉀(KN03 ) 1900mg/L，硝酸銨(NH4N03 ) 1650 mg/L，磷酸二氫鉀(KH2P04) 170mg/L，硫酸鎂(MgS04.7H20) 370 mg/L，氯化鈣(CaC12.2H20) 440 mg/L，碘化鉀(KI)0.83mg/L,硼酸(H3B03) 6.2 mg/L,硫酸錳(MnS0.44H20) 22.2 mg/L,硫酸鋅(ZnS04.7H20)8.6 mg/L，鑰酸鈉(Na2Mo04.2H20) 0.25 mg/L，硫酸銅(CuS04.5H20) 0.025 mg/L，氯化鈷(CoC12) 0.025 mg/L,乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA) 37.3 mg/L，硫酸鐵(FeS04.7H20) 27.8mg/L,肌酉享100 mg/L,甘氨酸2 mg/L,鹽酸硫銨素0.1 mg/L ，鹽酸批卩多醇0.5 mg/L,煙酸 0.5 mg/L，蔗糖 30 g/L，瓊脂 7 mg/L, ρΗ6.0。28。。，光照強度為 16001ux 培養 40d，將最后一次蕩洗的水涂布在平板上作對照。培養7d以后，對照板上并沒有菌生長，而千層塔的切口處有菌絲長出，用接種環將菌絲接種到新的PDA培養基上，平板劃線分離，得到純的菌株。
[0027]步驟二:產石杉堿甲木霉菌L44菌絲體的培養
將木霉菌L44接種于馬鈴薯液體培養基中培養，其中250ml的錐形瓶裝100ml的培養基，培養條件--溫度28°C，轉速150r/min，培養時間48h。
[0028]將種子液按10%的體積比接種到250ml的擴大培養基中，培養條件:溫度28V，轉速150r/min，培養時間7d，得到菌絲體。
[0029]步驟三:菌絲體的收集和產物提取
過濾收集菌絲體，用蒸餾水清洗3次，擠干水，于50°C真空干燥箱干燥至衡重，稱重備用。
[0030]稱取菌絲體，用100倍的無水乙醇熱回流提取有效成分，濃縮提取液到原體積的1/10。發酵液濃縮后用3倍體積的無水乙醇醇沉，5000r/min離心除去沉淀，將上清液濃縮到 ImL。
[0031]實施四:菌絲體提取物中石杉堿甲的鑒定
采用2cmX IOcm的硅膠板,展開劑為:氯仿/丙酮/異丙醇(4:6:4),顯色劑:0.3%高猛酸鉀溶液，用毛細管直接將0.4μ L樣品和石杉堿甲標準品點在距薄層板一端約Icm處，點完干燥后將板置于展開液中，待展開到離板另一端約Icm處取出層析板，自然干燥。待溶劑基本揮發后，用噴霧器噴上顯色劑，吹干，記錄斑點，測Rf值。
[0032]結果顯示,木霉菌(Trichoderma sp.)L44菌絲提取物樣品中有石杉堿甲的類似物，遷移率與石杉堿甲標準品非常接近，菌絲L44中有石杉堿甲或類似物，見圖5。[0033]采用D10NEX-3000 色譜系統，0DS-C18 反相柱(5 μ m，4.6_X 150_)，色譜條件為:流動相為甲醇:0.1 moL/L醋酸銨(pH 6.0) =36:64 ;流速lmL/min，進樣量20 μ L，柱溫25°C，檢測波長308nm。稱取石杉堿甲標準品12.75mg,于25mL的容量瓶中用流動相溶解置亥IJ度。吸取石杉堿甲標準品溶液0.1,0.2,0.4,0.8、1.0mL置于IOmL容量瓶中稀釋到刻度，樣品用流動相稀釋成5mL的溶液，膜過濾備用，根據石杉堿甲標準品色譜峰的保留時間對樣品定性，以峰面積與對應濃度繪標準曲線，并計算樣品中石杉堿甲的含量。
[0034]石杉堿甲標準品經過高效液相色譜檢測，不同濃度標準品都在保留時間5.97min有強的吸收峰，菌株木霉菌(Trichoderma sp.)L44的菌絲體提取物在保留時間5.960min,有相似的吸收峰，與其他雜質成良好的分離，可見木霉菌(Trichoderma sp.)L44能產石杉堿甲，并且石杉堿甲在菌絲體中，應為胞內產物。根據標準曲線的回歸方程，算的木霉菌(Trichoderma sp.) L44樣品中石杉堿甲含量為7.43 μ g/mL,共為5mL ,樣品中石杉堿甲量為37.15 μ g，菌絲體的重量為0.387g，所以每克干菌體的石杉堿甲的含量95.99 μ g，見圖6和圖7。
[0035]步驟五:菌株的形態學鑒定
將內生真菌菌株L44接種于PDA培養基中，對真菌菌落的形態特征進行觀察，見圖1。
[0036]菌絲體顯微觀察:將滅菌的濾紙于無菌水中濕潤，置于培養皿中，放上滅菌載玻片上，在載玻片上滴上一滴PDA培養基，將真菌木霉菌L44接種到培養基上，蓋上蓋玻片培養，培養后對菌株的菌絲、 孢子囊等微觀形態進行觀察記錄，見圖2、圖3，最后，比照《真菌鑒定手冊》。
[0037]菌株的分子鑒定:將培養在PDA上的內生真菌菌絲刮下，置于試管中，加500μ LCTAB提取緩沖液，玻棒研磨，65 °C保溫lh，12000 r/min離心10 min，取上清，飽和酚和氯仿異戊醇分別抽提后，用無水乙醇沉淀，12000 r/min離心，倒出乙醇溶液，沉淀晾干后，溶于50 μ L純水中備用。
[0038]PCR擴增菌株ITS區段根據已知真菌的保守序列設計特異性引物ITSl(5，-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3) ’ 和 ITS4 (5，-TCC-TCCGCTTATTGATATGC-3) ’，以真菌基因組DNA為模板，擴增菌株ITS區段。PCR反應體系為:PCR體系建立(25 μ L) =TempLate(基因組)IuL，引物各(10 μ moL/L) 0.5 μ L，dNTP (各 10 mmoL/L) 0.5 μ L, 10XPCRBuffer 2.5 μ L，Taq (5U/ μ L) 0.2 μ L 加水至 25 μ L。反應條件:預變性 94°C 5mim ;循環94°C 30S，55°C 35S，72°C lmin，35個循環，延伸8min。PCR產物用1%凝膠電泳進行檢測，送交上海生工生物工程技術服務有限公司測序，所得ITS序列如下:GAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGATCTCTGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGACCAAGGCGCCCGCCGGAGGACCAACCAAAACTCTTTTTGTATACCCCCTCGCGGGTTTTTTATAATCTGAGCCTTCTCGGCGCCTCTCGTAGGCGTTTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCCCTGCCTCTTGGCGGTGGCCGTCTCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACACTCGCATCGGGAGCGCGGCGCGTCCACAGCCGTTAAACACCCAACTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATA
序列提交到GenBank核酸序列數據庫并得到登錄號KF018088。
【權利要求】
1.蛇足石杉植物內生真菌，其特征在于:生物分類和分子生物學鑒定為木霉菌(Trichoderma sp.) L44，該菌已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC NO:M2013198。
2.根據權利I所述的蛇足石杉植物內生真菌，其特征在于:其在PDA培養基培養的菌落形態為:28°C培養2-3天菌落直徑為50mm，培養到5_6天可以鋪滿整個培養皿，菌落在生長2-3天顏色為白色，菌絲細絲狀，5-6天生長至整個平皿， 菌落中間有細小的深綠色顆粒狀，培養至6-7天，培養菌落上布滿綠色顆粒狀物，在PDA培養基上反面為乳白色，菌落邊緣一圈略顯淡黃色。
3.根據權利I所述的蛇足石杉植物內生真菌，其特征在于:菌絲平滑，分枝，無色有隔菌絲， 菌株的分生孢子梗粗，無色，直徑為10-15μπι;分生孢子頂囊近乎球形，直徑為50-65 μ m，產孢結構單層或雙層，分生孢子球形至近球形，直徑為2.5_5 μ m。
4.根據權利I所述的蛇足石杉植物內生真菌，其特征在于:基因登錄號為KF018088ITS堿基序列為:
GAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGATCTCTGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGACCAAGGCGCCCGCCGGAGGACCAACCAAAACTCTTTTTGTATACCCCCTCGCGGGTTTTTTATAATCTGAGCCTTCTCGGCGCCTCTCGTAGGCGTTTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTC`AGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCCCTGCCTCTTGGCGGTGGCCGTCTCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACACTCGCATCGGGAGCGCGGCGCGTCCACAGCCGTTAAACACCCAACTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAo
5.根據權利I所述的蛇足石杉植物內生真菌在制備石杉堿甲中的應用。
6.根據權利5所述的蛇足石杉植物內生真菌在制備石杉堿甲中的應用，其特征在于:發酵條件:溫度28°C，接種量10%，種齡48h，轉速150r/min，發酵時間7天，發酵結束后對發酵液和菌絲進行化學提取，分離可得石杉堿甲。
【文檔編號】C12R1/885GK103667070SQ201310343403
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年8月8日 優先權日:2013年8月8日
【發明者】董麗輝, 凌慶枝 申請人:浙江醫藥高等專科學校