一種棉鈴蟲V-ATPase A基因cDNA及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種棉鈴蟲V-ATPase A基因的cDNA及其應(yīng)用，設(shè)計與合成棉鈴蟲V-ATPase A siRNA，棉鈴蟲取食V-ATPase A siRNA后，V-ATPase A基因表達受阻，棉鈴蟲生長與代謝受抑制，死亡率提高，從而用于棉鈴蟲的生物防治。
【專利說明】-種棉鈴蟲V-ATPaseA基因cDNA及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于昆蟲分子生物學與生理學領(lǐng)域，具體涉及棉鈴蟲V型ATP酶A亞基 (V-ATPaseA)cDNA的克隆，棉鈴蟲V-ATPaseA基因小RNA(siRNA)的設(shè)計，合成與對棉鈴蟲 幼蟲的飼喂。

【背景技術(shù)】
[0002] 棉鈴蟲（Helicoverpaarmigera)，夜蛾科昆蟲的一種，是棉花蕾鈴期重要鉆駐性 害蟲，主要蛀食蕾、花、鈴，也取食嫩葉。棉鈴蟲是一種世界性分布的害蟲，國內(nèi)各棉區(qū)均有 分布和為害，北方棉區(qū)比南方棉區(qū)受害嚴重。棉鈴蟲為多食性害蟲，除為害棉花外，還能為 害小麥、玉米、高梁、大豆、豌豆、苜蓿、芝麻、番茄、辣椒、向日葵等作物，寄主植物多達20多 科200余種。20世紀90年代左右，棉鈴蟲在我國連年暴發(fā)成災(zāi)，給棉花、玉米和蔬菜等作 物生產(chǎn)帶來了嚴重的威脅。據(jù)統(tǒng)計，1992年棉鈴蟲在我國各種作物上累計發(fā)生面積達2192 萬公頃，造成直接經(jīng)濟損失逾百億元。
[0003]目前表達有殺蟲劑的轉(zhuǎn)基因植物已成為世界上作物害蟲治理的重要手段。2007 年，全世界此類轉(zhuǎn)基因植物的種植面積為4210萬公頃，占所有轉(zhuǎn)基因植物總數(shù)的37%。其 中轉(zhuǎn)有蘇云芽孢桿菌（Bt)中殺蟲劑基因的Bt棉全世界種植面積達1400萬公頃。我國1997 年開始種植轉(zhuǎn)基因Bt棉，至2007年已達到380萬公頃。2011年，全世界轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的種 植面積達到6600萬公頃。
[0004] 但害蟲基因突變可能危及轉(zhuǎn)基因作物的抗蟲功效，目前至少已發(fā)現(xiàn)9種害蟲進化 出不同程度的Bt抗性。研究表明，棉鈴蟲在大田環(huán)境中比在實驗室條件下更容易產(chǎn)生遺傳 突變。中國北方轉(zhuǎn)基因Bt棉田棉鈴蟲的大部分抗性等位基因為隱性的鈣粘蛋白突變，包含 通過實驗室篩選鑒定的刪除突變。因此，尋找新的殺蟲靶標，培育新的抗蟲種質(zhì)，避免或延 緩害蟲抗性的產(chǎn)生是一項非常緊迫的工作。
[0005]RNA干擾（RNAInterference，RNAi)是由雙鏈RNA(doublestrandedRNA，dsRNA) 引起的同源mRNA特異性降解的現(xiàn)象，小RNA(siRNA和microRNA)在RNA干涉機制中發(fā)揮 關(guān)鍵作用。RNA干涉普遍存在于植物、動物和真菌中，是真核生物中存在的一種抵抗病毒入 侵、抑制轉(zhuǎn)座子活動、調(diào)控基因表達的監(jiān)控機制，在農(nóng)業(yè)害蟲生物防治領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用 前景。1998年，Kennerdell與Carthew首次利用RNAi技術(shù)研究了黑腹果蠅frizzled與 frizzled〗基因的功能。隨后的眾多研究也表明，在注射或進食靶標序列dsRNA后，昆蟲靶 標基因的表達也可被有效阻斷。通過體外顯微注射dsRNA可以成功敲除刺吸式口器害蟲稻 飛虱不同表達模式的基因。黃曲條跳甲在注射跨膜氣味受體基因PsOrldsRNA后，對十字 花科寄主的偏好性減弱。棉鈴蟲有一受棉酚誘導(dǎo)的P450基因GIP，當棉鈴蟲幼蟲進食表達 dsGIP的轉(zhuǎn)基因煙草后，幼蟲中腸組織中GIP的轉(zhuǎn)錄水平被顯著抑制并伴隨過氧化氫酶活 性的上升，同時由于棉鈴蟲中腸內(nèi)的GIP表達的下調(diào)而使幼蟲生長受到抑制，對棉酚的耐 受性降低。此外，通過dsRNA飼喂對白蟻內(nèi)源纖維素基因與Hexamerin儲存蛋白基因的干 擾具有致死與致畸效應(yīng)。經(jīng)dsRNA飼喂后默R比亞按蚊的幾丁質(zhì)酶基因可被有效沉默。在 水稻中表達跨膜轉(zhuǎn)運蛋白基因或羧肽酶基因dsRNA可提高水稻對稻褐飛虱的抗性。目前很 少有通過siRNA沉默害蟲靶標基因的報道。
[0006]V型ATP酶（V-ATPase)是一種存在于幾乎所有真核生物膜結(jié)構(gòu)上的的質(zhì)子泵之 一。它能將ATP水解所釋放的能量轉(zhuǎn)化為生物膜兩側(cè)的H+質(zhì)子勢能。H+質(zhì)子勢能進一步推 動細胞內(nèi)各種生理反應(yīng)的進行。例如存在于動物溶酶體膜上的V-ATPase利用ATP水解的能 量將胞質(zhì)中的H+(氫離子）泵入溶酶體，在溶酶體內(nèi)形成適宜的酸性環(huán)境從而使溶酶體內(nèi) 的水解酶發(fā)揮正常功能。另外，V-ATPase作為質(zhì)子泵還通過調(diào)節(jié)膜兩側(cè)的礦濃度來平衡膜 兩側(cè)陽離子如Na+，Ca2+及Cd2+的濃度在生物神經(jīng)信號的傳導(dǎo)中，H+質(zhì)子依賴型的運載蛋白 利用質(zhì)子勢能使神經(jīng)遞質(zhì)在囊泡內(nèi)不斷積累，從而形成有效的神經(jīng)信號傳導(dǎo)。VATPase的 結(jié)構(gòu)由跨膜的％和細胞質(zhì)內(nèi)的％兩個亞單位組成，前者為H+提供通道，后者能分解ATP，為 逆濃度梯度轉(zhuǎn)運H+提供能量。％和Vi只有在聚合時，VATPase全酶才有功能。Vi位于細胞 質(zhì)內(nèi)，包括8種亞基（A-H)，參與ATP水解的主要是A亞基和B亞基。可見，昆蟲的V-ATPase 在昆蟲的生長、發(fā)育、生殖等重要生命活動過程中起著非常重要的作用。
[0007] 研究表明，在人工飼料中添加V型ATP酶A亞基（V-ATPaseA)dsRNA后，玉米根螢 葉甲（Diabroticavirgiferavirgifera)V_ATPaseA的表達明顯受抑制，幼蟲生長停滯甚 至死亡。其中飼喂12天后死亡率達50%寸所需的V-ATPaseAdsRNA濃度為1.82ng/cm2。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：提供一種棉鈴蟲（Helicoverpaarmigera)V型 ATP酶A亞基（V-ATPaseA)的cDNA及其應(yīng)用，設(shè)計與合成棉鈴蟲V-ATPaseA基因siRNA， 棉鈴蟲取食siRNA后，V-ATPaseA基因表達受阻，棉鈴蟲生長與代謝受抑制，死亡率提高， 從而用于棉鈴蟲的生物防治。
[0009] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案是：一種棉鈴蟲V-ATPaseA基因的cDNA，其核苷酸序列如 SEQIDNO. 1所示。該序列是發(fā)明人首次從棉鈴蟲中克隆的V-ATPaseA基因，該基因能夠 作為RNAi的靶標，在棉鈴蟲的防治中具有很大的應(yīng)用價值。
[0010] 本發(fā)明還提供所述CDNA編碼的蛋白，其氨基酸序列如SEQIDN0. 2所示。
[0011] 一種所述cDNA的克隆方法，包括以下步驟：
[0012] (1)從棉鈴蟲幼蟲提取總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA;
[0013] (2)設(shè)計簡并引物，所述簡并引物正向序列如SEQIDNO. 3所示，反向序列如SEQ IDNO. 4 所示；
[0014] (3)以步驟⑴得到的cDNA為模板，用步驟⑵所述的引物進行PCR擴增；
[0015] (4)純化步驟（3)得到的PCR產(chǎn)物，回收目的片段，取純化產(chǎn)物連接到pMD18-T載 體上得到pMD18-T-ATPase，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞ToplO,篩選含pMD18-T-ATPase 的陽性克隆；
[0016] (5)將步驟⑷所得的陽性克隆進行序列測定，得到權(quán)利要求1所述的cDNA。
[0017] 所述棉鈴蟲V-ATPaseAcDNA的應(yīng)用：所述的cDNA用于防治棉鈴蟲。從所述的 cDNA序列中選取四段19bp序列（見SEQIDN01中第299-317位，899-917位，1034-1052 位，1325-1343位核苷酸）作為干涉靶標，合成雙鏈siRNA，正向序列如SEQIDNO. 5，SEQID NO. 7,SEQIDNO. 9,SEQIDNO. 11 所示，反向序列如SEQIDNO. 6,SEQIDNO. 8,SEQID NO. 10，SEQIDNO. 12所示。同時設(shè)計綠色熒光蛋白基因（EGFP)雙鏈siRNA作為對照，正 向序列如SEQIDNO. 13所示，反向序列如SEQIDNO. 14所示。將所述siRNA配制成溶液 施用于煙草表面，棉鈴蟲取食含有V-ATPaseAsiRNA的煙草后，V-ATPaseA表達受抑制， 正常的代謝與生理過程受破壞，棉鈴蟲死亡率提高，從而用于棉鈴蟲的生物防治。
[0018] 上述的應(yīng)用，所述植物為棉花、煙草、小麥、玉米、高梁、大豆、豌豆、苜蓿、芝麻、番 茄、辣椒、向日葵等棉鈴蟲寄主植物。
[0019] 本發(fā)明具有以下有益效果：
[0020] 本發(fā)明首次克隆棉鈴蟲V-ATPaseA基因cDNA。V-ATPaseA是一種真核生物膜結(jié) 構(gòu)上的質(zhì)子泵，在真核生物細胞內(nèi)行使基礎(chǔ)的、必不可少的功能，在昆蟲的生長、發(fā)育、生殖 等生命活動過程中發(fā)揮非常重要的作用。V-ATPaseA的沉默會破壞細胞基本的代謝與生理 過程，造成昆蟲生長、發(fā)育、生殖等一系列生命活動的紊亂與異常。
[0021]目前，RNAi技術(shù)已經(jīng)在害蟲生物防治領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景，以害蟲靶基因 dsRNA或siRNA作為有效成分研制生物農(nóng)藥是一個新的發(fā)展方向。據(jù)報道，dsRNA常被用 于對害蟲靶標基因進行敲除，而不是siRNA。本發(fā)明人首次以棉鈴蟲V-ATPaseA為干涉靶 標，設(shè)計與合成V-ATPaseAsiRNA，對棉鈴蟲進行飼喂，以沉默V-ATPaseA的轉(zhuǎn)錄表達，抑 制棉鈴蟲的種群數(shù)量，研究基礎(chǔ)好，前瞻性高，害蟲產(chǎn)生抗性的風險低，是一種防治棉鈴蟲 的好方法。此外，siRNA與dsRNA相比具有合成成本低，穩(wěn)定性好的特點，更適合于生物農(nóng) 藥的研制，因此本發(fā)明具有重大的應(yīng)用前景。
[0022] 由于棉鈴蟲食性雜，寄主廣泛，除為害棉花外，還能為害小麥、玉米、高梁、大豆、豌 豆、苜蓿、芝麻、番茄、辣椒、向日葵、煙草等作物，寄主植物多達20多科200余種。因此，本 發(fā)明所設(shè)計的V-ATPaseAsiRNA可施用于其它寄主植物，同樣可用于棉鈴蟲的生物防治。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖 1 為棉鈴蟲V-ATPaseA基因的克隆。M:250bpladdermarker;1 :V_ATPaseA cDNA(1667bp)。
[0024] 圖2為V-ATPaseAsiRNA飼養(yǎng)第8天時棉鈴蟲的生長情況。將V-ATPaseAsiRNA 配制成水溶液，以EGFP(綠色熒光蛋白）siRNA為對照，將煙草葉片從植株上剪下置于培養(yǎng) 皿，將siRNA溶液涂布在葉片表面，每個培養(yǎng)皿飼養(yǎng)1頭棉鈴蟲幼蟲，及時更換葉片。
[0025] 圖3為棉鈴蟲取食V-ATPaseAsiRNA后死亡率提高。將siRNA溶液涂布在煙草 葉片表面，飼喂棉鈴蟲，在飼喂的第2天至第10天統(tǒng)計棉鈴蟲的死亡率。

【具體實施方式】
[0026] 下面通過【具體實施方式】的詳細描述來進一步闡明本發(fā)明，但并不是對本發(fā)明的限 制，僅僅作示例說明。
[0027] 本發(fā)明從棉鈴蟲克隆到V型ATP酶A亞基（V-ATPaseA)的cDNA，它具有SEQID NO. 1所示的序列：
[0028] (l)SEQIDNO. 1 的信息
[0029] (a)序列特征：
[0030] 序列長度：1667堿基對
[0031] 類型：核酸
[0032] 鏈型：雙鏈
[0033] 拓撲結(jié)構(gòu)：線性
[0034] (b)分子類型：cDNA
[0035] (c)假設(shè)：否
[0036] (d)反義：否
[0037] (e)最初來源：棉鈴蟲（Helicoverpaarmigera)
[0038] (f)序列描述：SEQIDNO. 1
[0039] (2)SEQIDNO. 2 的信息
[0040] (a)序列特征
[0041]序列長度：555氨基酸
[0042] 類型：氨基酸
[0043] 鏈型：單鏈
[0044] 拓撲結(jié)構(gòu)：線性
[0045](b)分子類型：蛋白質(zhì)
[0046] (c)序列描述：SEQIDN0. 2
[0047] 本發(fā)明棉鈴蟲V-ATPaseA基因cDNA序列SEQIDNO. 1的克隆方法，包括以下步 驟：
[0048] (1)從棉鈴蟲幼蟲提取總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA;
[0049] (2)根據(jù)鱗翅目，鞘翅目，膜翅目，雙翅目昆蟲V-ATPaseA基因的保守序列設(shè)計簡 并引物：

【權(quán)利要求】
1. 一種棉鈴蟲V-ATPase A基因的cDNA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所 /_J、i 〇
2. -種棉鈴蟲V-ATPase A基因表達的蛋白，其特征在于，其由權(quán)利要求1所述的cDNA 所編碼，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3. -種如權(quán)利要求1所述cDNA的克隆方法，包括以下步驟： (1) 從棉鈴蟲幼蟲提取總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA ; (2) 設(shè)計簡并引物，所述簡并引物正向序列如SEQ ID N0.3所示，反向序列如SEG ID NO. 4所示； (3) 以步驟⑴得到的cDNA為模板，用步驟⑵所述的引物進行PCR擴增，得到擴增片 段； (4) 純化步驟⑶得到的PCR產(chǎn)物，回收目的片段，取純化產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上， 然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，篩選含目的片段的陽性克隆； (5) 將步驟（4)所得的陽性克隆進行序列測定，得到權(quán)利要求1所述的cDNA。
4. 一種如權(quán)利要求1所述cDNA的應(yīng)用，其特征在于：從權(quán)利要求1所述的cDNA序列中 選取 SEQ ID NO. 1 中第 299-317 位，899-917 位，1034-1052 位，1325-1343 位共四段 19bp 序 列作為干涉靶標合成siRNA，siRNA正向序列如SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 9， SEQ ID NO. 11 所示，反向序列如 SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 12 所示。將合成的siRNA混合配制成溶液涂布在煙草葉片表面對棉鈴蟲進行飼喂，棉鈴蟲取 食煙葉后，V-ATPase A基因表達受阻，棉鈴蟲代謝與生長受抑制，死亡率提高。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于：所述植物為煙草、棉花、小麥、玉米、高梁、 大豆、豌豆、苜蓿、芝麻、番茄、辣椒、向日葵等棉鈴蟲寄主植物。
【文檔編號】C12N9/14GK104342448SQ201310343150
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年8月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月8日
【發(fā)明者】毛建軍, 曾凡榮 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所