利用家兔乳腺反應器平臺生產重組人第七凝血因子的方法
【專利摘要】發(fā)明提供了利用家兔乳腺反應器平臺生產重組人第七凝血因子的方法，將重組人第七凝血因子的cDNA導入或整合至家兔的染色體基因中，獲得的轉基因兔在乳腺反應器內表達重組人第七凝血因子蛋白。轉基因兔在乳腺反應器具有較高的重組人第七凝血因子蛋白表達水平、并且蛋白活性好，進而降低生產成本。
【專利說明】利用家兔乳腺反應器平臺生產重組人第七凝血因子的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于非人哺乳動物制備重組蛋白藥物領域，具體涉及利用家兔乳腺反應器平臺生產重組人第七凝血因子的方法。
【背景技術】
[0002]血友病是人類最常見的一種出血性疾病，具有終身性，反復性和致命性，約每5000-10000個男性中就有一個是血友病患者。血友病是由于血液中某些功能性凝血因子的缺失而造成的，其最有效的治療方法是直接注射凝血因子進行治療?，F(xiàn)在最常見的治療用凝血因子為第八、九凝血因子，然而，經過頻繁的外源性凝血因子八、九的治療后，病人體內產生了對這些凝血因子的抗性，或產生了中和性的抗體，從而增加對凝血因子治療的風險，導致病人的關節(jié)變形，肌肉萎縮，假瘤和過早死亡。
[0003]第七凝血因子rhF VII是治療因第八，第九凝血因子rhF珊、rhF IX產生抗性的遺傳性血友病患者的首選替代藥物。它也可廣泛用于治療創(chuàng)傷性出血，如車禍創(chuàng)傷、手術性出血、顱內出血，如腦溢血等常見的血液疾病，其臨床研究顯示出強大的潛力。目前市場上的第七凝血因子的重組蛋白產品使用倉鼠幼體腎臟細胞(CHO)的培養(yǎng)系統(tǒng)進行蛋白表達，蛋白表達水平低，導致生產成本極高。有鑒于此，`有必要提供一種高效制備重組人第七凝血因子的方法。

【發(fā)明內容】

[0004]針對上述問題，本發(fā)明提供了利用家兔乳腺反應器平臺生產重組人第七凝血因子的方法，其具有較高的蛋白表達水平，進而降低生產成本。
[0005]其技術方案是這樣的，利用家兔乳腺反應器平臺生產重組人第七凝血因子的方法，其特征在于:將重組人第七凝血因子的cDNA導入或整合至家兔的染色體基因中，獲得的轉基因兔在乳腺反應器內表達重組人第七凝血因子；其包括以下步驟:⑴將外接信號基因的重組人第七凝血因子的cDNA (rhF YD cDNA)插入表達載體中形成第七凝血因子的乳腺表達載體(pBCl- rhFVD,所述表達載體包括調控元件；(2)將乳腺表達載體導入或者整合到家兔的染色體基因中，獲得轉基因兔；⑶獲得的轉基因兔的當代或者后代母兔在泌乳期的乳汁中產生重組人第七凝血因子。
[0006]其進一步特征在于:
所述表達載體為pBCl質粒載體；
所述調控元件包括雞β球蛋白絕緣子，山羊酪蛋白啟動子，TATA盒，β-酪蛋白外顯子1，酪蛋白內含子1，酪蛋白外顯子2，β-酪蛋白外顯子7，8，9，β-酪蛋白內含子7，8，β-酪蛋白基因組片段；
所述重組人第七凝血因子的cDNA在限制性內切酶Xho I多克隆位點插入pBCl質粒載體，所述限制性內切酶Xho I多克隆位點位于酪蛋白外顯子2和β-酪蛋白外顯子7，8，9之間；其更進一步特征在于:
將乳腺表達載體導入或者整合到家兔的染色體基因之前，利用Sal I與Not I的限性內切酶釋放細菌質粒部分，形成乳腺表達構件，所述乳腺表達構件包括所述調控元件和rhF W cDNA ；
步驟⑵中將乳腺表達載體導入或者整合到家兔的染色體基因并獲得轉基因兔的具體操作為:首先，利用Sal I與Not I的限性內切酶釋放細菌質粒部分，形成所述乳腺表達構件；其次，將所述乳腺表達構件通過顯微注射直接注入家兔受精卵中；然后，將家兔受精卵放入FBS M199培養(yǎng)液、并在38.5°C>5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；最后，將家兔胚胎移植到受體家兔的輸卵管中，經過妊娠，獲得轉基因兔；
步驟⑵中將乳腺表達載體導入或者整合到家兔的染色體基因并獲得轉基因兔的具體操作為:首先，利用Sal I與Not I的限性內切酶釋放細菌質粒部分，形成所述乳腺表達構件；其次，將所述乳腺表達構件轉染至家兔供體細胞中，然后，將經過乳腺表達構件轉染的陽性細胞核通過顯微操作移到去除染色體遺傳物質的卵母細胞的細胞質中，構成克隆胚胎；最后，將發(fā)育的克隆胚胎進行胚胎移植，到同步發(fā)情的受體兔中妊娠，獲得轉基因兔；所述重組人第七凝血因子cDNA為人全序列第七凝血因子cDNA ；
所述外接信號基因為β -酪蛋白信號肽和hF VII原有的分泌信號肽；
所述泌乳期包括人工誘導泌乳期和自然分泌的泌乳期；
所述泌乳期包括泌乳前期、泌乳中期和泌乳后期。
[0007]采用本發(fā)明的方法后，其有益效果在于:家兔作為轉基因藥物生產的載體，其優(yōu)點是可以方便地進行GMP工廠的生產，轉基因兔能夠在高度清潔(SPF級)的環(huán)境中培育，具有培育周期短，效益好，安全性`強，成本低等優(yōu)勢，同時，轉基因兔乳汁中第七凝血因子蛋白表達量高、活性好，使得使第七凝血因子的價格降低30-50%，可實現(xiàn)該產品的國產化；pBCl質粒載體更加適用于構建乳腺表達載體；調控元件的設置能實現(xiàn)rhF W cDNA在轉基因兔體內表達，并優(yōu)化表達效果；外接的β_酪蛋白信號肽能使rhF YD cDNA選擇性的在乳汁中表達；乳腺表達載體在顯微注射直接注入家兔受精卵之前，利用Sal I與Not I的限性內切酶釋放細菌質粒部分，可消除細菌DNA對rhF W cDNA表達的干擾；泌乳期包括人工誘導泌乳期和自然分泌的泌乳期，同時，泌乳期包括泌乳前期、泌乳中期和泌乳后期，轉基因家兔的整個泌乳期階段都具有分泌rhF VII的能力，蛋白表達量高，并且通過對泌乳期的人工誘導以及自然選擇，能進一步提高轉基因兔的rhF VII蛋白的表達量；采用顯微注射乳腺表達構建進入家兔受精卵的方式獲得轉基因兔，具有較高的轉基因率。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1為人重組第七凝血因子rhF YD cDNA基因的結構圖；其中，引物pBClhF YD-f/pBClhF VD -r 和 pBClhF W -f2/pBClhF W ~r, S 為外接信號基因。
[0009]圖2 PCR方法擴增人重組第七凝血因子rhF W cDNA產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果；其中，M:1 kb DNA ladder, rhF W cDNA 為 1.4kb。
[0010]圖3為人重組第七凝血因子乳腺表達載體pBCl-rhF νπ的基因結構圖；其中，雞β球蛋白絕緣子(Chicken beta-globin insulator),山羊β -酪蛋白啟動子(Goatbeta-casein promoter), TATA 盒(TATA box), β-酪蛋白外顯子 I (beta-casein exonI)，β_ 酪蛋白內含子 I (beta-casein intron I), 酪蛋白外顯子 2 (beta-caseinexon 2),重組人第七凝血因子cDNA (hF W ss), β _酪蛋白外顯子7,8,9 (beta-caseinexon 7,8,9), β-酪蛋白內含子7,8 (beta-casein intron 7,8), β-酪蛋白基因組片段(beta-casein -genomic fragment),質粒DNA的細菌起始片段(EcolEl),氨節(jié)抗性基因啟動子Amp prom,氨節(jié)抗性基因AmpR, SalI> Not 1、XhoI為酶切位點。
[0011]圖4為人重組第七凝血因子hFVD cDNA感染Zero Blunt TOPO細菌的陽性克隆篩選。
[0012]圖5為人重組第七凝血因子乳腺表達載體pBCl-rhF YD轉化大腸桿菌DH5 α的陽性克隆篩選。
[0013]圖6為pBCl-rhF YD表達載體酶切片段的電泳檢測結果。
[0014]圖7為pBCl-rhF YD基因構件轉染乳腺上皮細胞MCF W的RT-PCR檢測結果；其中，+RT表示有反轉錄酶反應后(RT)的PCR反應，-RT表示沒有反轉錄酶反應后(RT)的PCR反應，作為RT的對照組。313 bp的RT-PCR的產物表明擴增的DNA是從mRNA中反轉錄成cDNA產生的，即pBCl-rhF YD的mRNA表達。
[0015]圖8為乳腺上皮細胞MCF VII中第七凝血因子的Western blot檢測結果；其中，Day3 Non-transfected control為經過3天培養(yǎng)的未轉染pBCl-rhF VII基因的陰性乳腺上皮細胞MCF VII的蛋白檢測泳道，Day 3 transfected medium經過3天培養(yǎng)的轉染pBCl-rhF W基因的陽性乳腺上皮細胞MCF VII的蛋白檢測泳道。
[0016]圖9為顯微操作-轉基因兔卵基因注射。
[0017]圖10為七個轉基因兔的兔耳組織DNA的Southern blot檢測結果；其中，cDNA是pBCl-rhF YD陽性對照，Α449是正常兔陰性對照，H2O是水陰性對照，1-7是檢測的7個轉基因陽性兔的DNA。
[0018]圖1lA為轉基因兔的兔奶中重組人第七凝血因子蛋白的Western Blot檢測結果；其中，一抗:小鼠抗人F VL 二抗:羊抗鼠。
[0019]圖1lB為圖11 A的對照實驗檢測結果；其中，單抗:羊抗鼠。
【具體實施方式】
[0020]實施例1
⑴第七凝血因子乳腺表達載體的制備:
a、第七凝血因子rhF W cDNA擴增:重組第七凝血因子rhF W cDNA結構如圖1所示，包括輕鏈(light chain)和重鏈(heavy chain),輕鏈的端部外接有信號肽S,信號肽S包括第七凝血因子hF VII原有的分泌信號肽(19個氨基酸多肽)與β -酪蛋白信號肽(19個氨基酸多肽)，同時，rhF VII cDNA外接bGH ployA (圖中未示出)，bGH ployA,可增加蛋白質翻譯水平，優(yōu)化表達效果。從人cDNA文庫中擴增出hFVD的片段，準備兩組引物，一組是卩8(:11^'/114^^(:11^'/11-1'，另一組是口8(:11^'/1142^^(:11^'/11-1.。圖1 所示箭頭為 PCR 引物的擴增方向，從pBClhF W -f/pBClhF W _r擴增的片段，包括hF VII原有的分泌信號肽(19個氨基酸多肽)與β -酪蛋白信號肽(19個氨基酸多肽)，從pBClhF W -f2/pBClhF W _r的擴增片段包含有hF VII原有的分泌信號肽(19個氨基酸多肽)。
[0021]引物的堿基序列為:
pBClhF VI1-f:aactcgagatggtgatgaaggtcctcatccttgcctgtctggtggctctggccattgcaagagagatggtctcccaggccct
pBClhF YD -f2:aactcgaggccgccaccatggtgatggtctcccaggccct
pBClhF YD ~r:aactcgagctagggaaatggggctcgcaggagga
引物 pBClhF W -f/pBClhF VD _r 和 pBClhF W -f2/pBClhF W _r 是根據(jù) pBCl 和 hF VD核苷酸序列設計并人工合成的。
[0022]使用引物pBClhF W -f/pBClhF W _r 經過 PCR 可以擴增出 L 4kb 的 rhF W cDNA,如圖 2 所示，M 為 I kb DNA ladder (I kb DNA 階梯對照，來源:NEB, Cat.N3232S)。
[0023]將人工合成的hFVD 00嫩的1.4 kb的片段感染到Zero Blunt TOPO細菌的感受態(tài)細胞中(來源Invitrogen，Cat:K2800 20)，將細菌克隆抽提質粒DNA，并電泳測定，測得結果如圖4所示，其中的克隆#17，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28為ZeroBlunt TOPO vector (3.5kb)的部分，為陰性細菌克隆；#1，14，15，16，18，具備 ZeroBlunt TOPO vector + 插入的rhFVII 片段(3.5 kb +1.4kb = 4.9kb)，為陽性細菌克隆。
[0024]b、pBCl-rhF YD乳腺表達載體的制備、擴增及篩選。
[0025]pBCl-rhF YD表達載體的結構如圖3所示，pBCl質粒(來源，Invitrogen商用質粒)連接雞β球蛋白絕緣子、山羊酪蛋白啟動子、TATA盒、β-酪蛋白外顯子1、β-酪蛋白內含子1、β_酪蛋白外顯子2，在質粒載體的限制性內切酶Xho I多克隆位點插入外接信號基因的rhF YD cDNA，再連接-酪蛋白外顯子7、8、9，β -酪蛋白內含子7、8，在:T端加載β-酪蛋白基因組片段，形成第七凝血因子的乳腺表達載體pBCl- rhFVII，基因序列長23020 bp。pBCl質粒DNA還包含細菌(EolEl)起始片段，氨芐抗性基因AmpR啟動子以及氨芐抗性基因AmpR。
[0026]其中，雞β球蛋白絕`緣子，山羊酪蛋白啟動子，TATA盒，β-酪蛋白外顯子1，β-酪蛋白內含子1，酪蛋白外顯子2，β-酪蛋白外顯子7、8、9，β-酪蛋白內含子7、8，酪蛋白基因組片段為乳腺表達構件的調控元件，實現(xiàn)rhF YD cDNA在家兔體內表達，并優(yōu)化表達效果。
[0027]將上述步驟a中含rhF YD cDNA的克隆#14和pBCl經過Xho I酶切后，進行酶連接，在PBCl質粒載體的限制性內切酶Xho I多克隆位點插入rhF YD cDNA,進而形成pBCl-rhF YD乳腺表達載體；其中，克隆克隆#14酶切后釋放1.4kb片段，即rhF W cDNA。
[0028]使用M13 正向引物(Ml3 Forward (-20))和 M13 反向引物(Ml3 reverse)(來源Invitrogen商用引物)對克隆#14經Xho I酶酶切后得到的1.4kb片段進行DNA序列分析，1.4kb片段的DNA序列(SEQ ID N0.2)為人全序列第七凝血因子cDNA，其推斷出的氨基酸序列(SEQ ID N0.3),與天然的hF VII蛋白的氨基酸序列100%匹配。
[0029]引物的堿基序列為:
M13 Forward (-20): gtaaaacgacggcaag
M13 reverse: caggaaacagctatgac
上述pBCl-rhF YD乳腺表達載體轉化基因文庫效率DH5a competence細菌(來源Invitrogen, cat: 18263-012),或者 One Shot T0P10 化學性 Competent E.coli (來源Invitrogen, cat: 4040-03),獲得受體菌增殖，以實現(xiàn)pBCl-rhF VII的擴增。
[0030]獲得的細菌克隆采用PCR方法篩選出陽性的克隆。使用在hFVD的:T末端前行引物與載體序列在10070-10045 (313 bp PCR產物)進行PCR擴增。由正向引物為hu7A_5f位于第七因子cDNA的末端:5^atgttctgtgccggctactc-3, (9758-9777)和反向引物pBCl-sr (pBCl-sr與hu7A_5f配對)位于β -酪蛋白內含子7:
5、CATCAGAAGTTAAACAGCACAGTTAG-3\ 10070-10045)，PCR產物為 313 bp。篩選結果如圖5所示，從篩選的132個克隆中，細菌克隆#64-79,81-83，86-96為陰性，只有克隆#84和85為陽性，其中，M為100 bp DNA ladder (來源:NEB, Cat.N0467S)?？寺?84的基因序列分析(SEQ ID N0.l),pBCl-rhFVn線性DNA的總長為23020bp，重組人第七凝血因子基因的ATG起始密碼子在8666位點處，TGA終止密碼子在10000位點處。
[0031]引物PBCl-sr/hu7A-5f是根據(jù)pBCl和hF VII核苷酸序列設計并人工合成的。
[0032]⑵pBCl-rhF YD乳腺表達載體在乳腺上皮細胞內的表達
將全長pBCl-rhF VII乳腺表達載體(23020bp)通過電轉染的方法感染乳腺上皮細胞MCF VL三天后收集細胞與培養(yǎng)液，檢測細胞中表達的mRNA與培養(yǎng)液中rhFVII蛋白質的表達情況。采用RT-PCR的檢測方法，使用引物對進行PCR的擴增。使用由正向引物為hu7A-5f和反向引物pBCl-sr (與hu7A-5f配對)進行擴增，PCR產物為313 bp。檢測結果如圖7所示，pBCl-rhFVD cDNA作為陽性的對照，未轉染的細胞作為細胞的陰性對照，+RT表示有反轉錄酶反應后(RT)的PCR反應，-RT表示沒有反轉錄酶反應后(RT)的PCR反應，在感染的細胞中檢測到預期的313 bp的RT-PCR產物，從而證實轉入的pBCl-rhF VII基因在MCF VII的細胞中得到了表達。
[0033]MCR-7細胞中的重組第七凝血因子的蛋白表達檢測是采用常規(guī)的Western Blot完成的。第一抗體是兔抗人第七凝血因子的抗體(來源Renova，1:500稀釋)，第二抗體是羊抗兔的抗體(來源Abeam, ab6846, 1:500稀釋)。檢測結果如圖8所示,50 kDa的表達蛋白在轉染的MCF VII細胞培養(yǎng)液中顯示，其余的著色帶型是非特異性的蛋白，確定了經過三天培養(yǎng)的轉染的細胞分泌了微量的第七凝血因子。
[0034]由此證明，乳腺表達載體`在乳腺中能夠表達，即外源rhF W cDNA能夠在乳腺中表達。
[0035]⑶轉基因兔的培育
a、pBCl-rhFVD乳腺表達載體的處理:利用SalI限制性內切酶可以將環(huán)狀DNA切成線性的DNA (23020 bp);利用XhoI限性內切酶可釋放21.6 kb的乳腺表達載體和1.4kb的rhFW cDNA片段。利用Sal I和Not I限性內切酶可以釋放5.9 kb的細菌質粒部分與
17.1 kb的線性DNA，其中，17.1 kb線性DNA為表達構件、包含調控元件和插入的rhF WCDNA0該表達構件可以用于顯微注射到家兔(蘭諾生物技術無錫有限公司自繁的兔群)的受精卵，培育第七凝血因子轉基因兔的種子，上述酶切片段如圖6所示。
[0036]b、原核期胚胎顯微注射、培育轉基因兔:
運用顯微注射的方法將含rhF VII基因的表達構件(17.lkb)，注射到家兔受精卵的原核中，經過短期體外培養(yǎng)后，成活的胚胎將被移植到受體的輸卵管中，經過約31天的妊娠，獲得基因注射兔。
[0037]性成熟(6月齡以上)的家兔將進行超數(shù)排卵處理，連續(xù)三天，每天兩次按劑量遞增的方式(3，3;4，4和5，5mg)實施頸皮下注射FSH (促濾泡激素)，F(xiàn)SH處理完畢后，超排母兔與公兔交配兩次，并注射100IU hCG/供體(IU國際單位，hCG人絨毛促性腺激素)。hCG處理后18-20h，從供體兔的輸卵管中沖洗出受精卵。受精卵經15000g的條件離心7-8分鐘，充分顯示雄性與雌性原核，如圖9中A、C所示。整個顯微注射的過程見圖9，在明顯確立了原核膨脹后，如圖9中B和D所示，注射過的卵子移入10% FBS M199培養(yǎng)液中在38.5° C，5% CO2培養(yǎng)箱中短暫培養(yǎng)，以檢查注射胚胎的成活率和分裂的狀況。約15-20枚注射胚胎將被移植到經過同期發(fā)情處理的受體母兔的輸卵管中。結果顯示，妊娠率為50%(n=16)，在懷孕的母兔中，大約7.5%的注射卵子會發(fā)育成出生幼體，2-8只幼兔在懷孕母兔中誕生，共出生8個陽性的第七凝血因子轉基因兔，總轉基因效率為24.2% (表1，n=33)。表1為重組人第七凝 血因子轉基因兔制作效率。
[0038]表 I
【權利要求】
1.利用家兔乳腺反應器平臺生產重組人第七凝血因子的方法，其特征在于:將重組人第七凝血因子的CDNA導入或整合至家兔的基因組中，獲得的轉基因兔在乳腺反應器內表達重組人第七凝血因子。
2.根據(jù)權利要求1所述的利用家兔乳腺反應器平臺生產重組人第七凝血因子的方法，其特征在于:利用家兔乳腺反應器平臺生產重組人第七凝血因子的方法，其包括以下步驟:⑴將外接信號基因的重組人第七凝血因子的cDNA插入表達載體中形成第七凝血因子的乳腺表達載體，所述表達載體包括調控元件；⑵將乳腺表達載體導入或者整合到家兔的染色體基因中，獲得轉基因兔；(3)獲得的轉基因兔的當代或者后代母兔在泌乳期的乳汁中產生重組人第七凝血因子。
3.根據(jù)權利要求2所述的利用家兔乳腺反應器平臺生產重組人第七凝血因子的方法，其特征在于:所述表達載體為PBCl質粒載體，所述重組人第七凝血因子cDNA為人全序列第七凝血因子cDNA。
4.根據(jù)權利要求2所述的利用家兔乳腺反應器平臺生產重組人第七凝血因子的方法，其特征在于:所述外接信號基因為β_酪蛋白信號肽和第七凝血因子原有的分泌信號肽。
5.根據(jù)權利要求2或3或4所述的利用家兔乳腺反應器平臺生產重組人第七凝血因子的方法，其特征在于:所述調控元件包括雞β球蛋白絕緣子，山羊β_酪蛋白啟動子，TATA盒，酪蛋白外顯子1，酪蛋白內含子1，酪蛋白外顯子2，β-酪蛋白外顯子7，8,9, β-酪蛋白內含子7，8，β-酪蛋白基因組片段。
6.根據(jù)權利要求5所述的 利用家兔乳腺反應器平臺生產重組人第七凝血因子的方法，其特征在于:所述重組人第七凝血因子的cDNA在限制性內切酶Xho I多克隆位點插入pBCl載體，所述限制性內切酶Xho I多克隆位點位于酪蛋白外顯子2和β-酪蛋白外顯子7，8，9之間。
7.根據(jù)權利要求6所述的利用家兔乳腺反應器平臺生產重組人第七凝血因子的方法，其特征在于:在將所述乳腺表達載體導入或者整合到家兔的染色體基因之前，利用Sal I與Not I的限性內切酶釋放細菌質粒部分，形成乳腺表達構件，所述乳腺表達構件包括所述調控元件和第七凝血因子cDNA。
8.根據(jù)權利要求7所述的利用家兔乳腺反應器平臺生產重組人第七凝血因子的方法，其特征在于:步驟⑵中將乳腺表達載體導入或者整合到家兔的染色體基因并獲得轉基因兔的具體操作為:首先，利用Sal I與Not I的限性內切酶釋放細菌質粒部分，形成所述乳腺表達構件；其次，將所述乳腺表達構件通過顯微注射直接注入家兔受精卵中；然后，將家兔受精卵放入FBS M199培養(yǎng)液、并在38.5°C>5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；最后，將家兔胚胎移植到受體家兔的輸卵管中，經過妊娠，獲得轉基因兔。
9.根據(jù)權利要求7所述的利用家兔乳腺反應器平臺生產重組人第七凝血因子的方法，其特征在于:步驟⑵中將乳腺表達載體導入或者整合到家兔的染色體基因并獲得轉基因兔的具體操作為:首先，利用Sal I與Not I的限性內切酶釋放細菌質粒部分，形成所述乳腺表達構件；其次，將所述乳腺表達構件轉染至家兔供體細胞中，然后，將經過乳腺表達構件轉染的陽性細胞核通過顯微操作移到去除染色體遺傳物質的卵母細胞的細胞質中，構成克隆胚胎；最后，將發(fā)育的克隆胚胎進行胚胎移植，到同步發(fā)情的受體兔中妊娠，獲得轉基因兔。
10.根據(jù)權利要求2所述的利用家兔乳腺反應器平臺生產重組人第七凝血因子的方法，其特征在于:所述泌乳期包括人工誘導泌乳期和自然分泌的泌乳期； 所述人工誘導泌乳期和所述自然泌乳期包括泌乳前期、泌乳中期和泌乳后期。
【文檔編號】C12N15/85GK103484497SQ201310342562
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年8月8日 優(yōu)先權日:2013年8月8日
【發(fā)明者】杜福良, 楊瀾, 薛非, 安禮友 申請人:蘭諾生物技術無錫有限公司