一種象耳豆根結線蟲效應基因Me-tctp，相關蛋白及應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬于生物基因工程【技術領域】，具體公開了一種象耳豆根結線蟲效應基因Me-tctp，相關蛋白及應用。所述效應基因Me-tctp核苷酸序列如SEQIDNO:1～3所示，其相關蛋白ME-TCTP的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。本發明研究了Me-tctp基因在線蟲不同階段表達情況；構建該基因過表達載體，轉化到農桿菌EHA105中，侵染番茄葉片，熒光觀察發現ME-TCTP蛋白定位在植物細胞質上；利用離體RNAi的方法沉默Me-tctp基因，分析結果顯示該基因的沉默能夠顯著的降低象耳豆根結線蟲的侵染能力；構建病毒誘導重組RNAi載體，將該載體導入植物，在植物中產生Me-tctp的dsRNA，該植株能顯著抑制根結線蟲的寄生。通過本發明可獲得強抗象耳豆根結根結線蟲的植物。
【專利說明】—種象耳豆根結線蟲效應基因Me-tctp，相關蛋白及應用
【技術領域】
[0001]本發明屬生物基因工程【技術領域】，具體涉及一種象耳豆根結線蟲效應基因ife-1c ?/7 ,相關蛋白及應用。
【背景技術】
[0002]根結線蟲是一類非常重要的植物寄生線蟲，廣泛分布于世界各地，能侵染超過3000種不同植物。根結線蟲每年造成大概770億美元的經濟損失，隨著作物復種指數的提高和設施農業的發展，根結線蟲的發生和危害將會不斷的加劇。由于根結線蟲的根內寄生、寄主范圍廣泛的特性以及抗根結線蟲種質資源的缺乏限制了化學防治、輪作和抗病育種等防治方法在控制根結線蟲危害中的應用。而且現有的化學防治方法污染嚴重，因此，尋找其他綠色安全有效的防治根結線蟲的方法是植物生產所長期面臨的艱巨任務。
[0003]RNA干擾技術(RNAi)的出現使得開發更為有效的防治根結線蟲的方法成為可能。RNAi能通過靶向抑制根結線蟲特定基因功能而限制根結線蟲侵染、寄生和繁殖因而能高效地減少根結線蟲的危害而且對其他非靶標生物較為安全。RNAi現象最早在秀麗小桿線蟲中發現，隨后在植物、無脊椎動物和脊椎動物中都相繼發現了這種現象。RNAi技術通過dsRNA特異性的降解靶mRNA，影響或抑制該目的基因功能，從而影響該種生物的生長、發育、繁殖甚至能殺死該種生物。該技術相比其他防治方法的最大優點是能定向作用于特定的某種(某類)害蟲而不會影響在該生境中的其他生物。
[0004]應用農桿菌介導的病毒誘導的基因沉默(VIGS)技術相對于傳統的使用組織培養方法獲得RNAi轉基因植株更加簡單快速，使得我們并不需要通過復雜的組培方法就可快速獲得抗線蟲植株。`

【發明內容】

[0005]本發明的目的是為了克服現有技術中缺乏綠色安全有效的防治根結線蟲的方法的缺陷，提供一種新的象耳豆根結線蟲效應基因
[0006]本發明的另一目的是提供一種象耳豆根結線蟲效應基因的相關蛋白ME-TCTP。
[0007]本發明的又一目的是提供一種象耳豆根結線蟲效應基因的應用。
[0008]本發明通過以下技術方案實現上述目的:
一種象耳豆根結線蟲iMeloidogyne javanica )效應基因其核苷酸序列如SEQID N0:1~3任意一條所示。其中SEQ ID NO:1為全基因序列(包括5’端非編碼區、3’端非編碼區、內含子和外顯子)，SEQ ID NO:2為編碼區序列(包括內含子和外顯子)，SEQ IDNO:3為編碼序列(即cDNA序列,僅為外顯子)。
[0009]在嚴格條件下與上述象耳豆根結線蟲效應基因雜交且編碼與象耳豆根結線蟲寄生相關蛋白的DNA分子，或者與上述象耳豆根結線蟲效應基因有90%以上同源性且編碼象耳豆根結線蟲寄生相關蛋白的DNA分子，也在本發明的保護范圍之內。所述嚴格條件為:可在0.1XSSC、0.1% SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。
[0010]一種象耳豆根結線蟲效應蛋白ME-TCTP，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，或該氨基酸序列經過一個或一個以上氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加并且與象耳豆根結線蟲寄生相關的衍生蛋白。
[0011]為了使象耳豆根結線蟲效應蛋白ME-TCTP便于純化，可以在該序列(SEQ ID NO:4)的氨基末端或羧基末端連接上特定的標簽，所述特定標簽為5~6個精氨酸，或2~12個組氨酸，或如SEQ ID NO:5所示序列，或如SEQ ID NO:6所示序列，或如SEQ ID NO:7所不序列。如表1，但不限于表1:
【權利要求】
1.一種象耳豆根結線蟲效應基因其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID N0:1~3任意一條所示。
2.一種象耳豆根結線蟲效應蛋白ME-TCTP，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示 ο
3.在嚴格條件下與權利要求1所述象耳豆根結線蟲效應基因雜交且編碼與象耳豆根結線蟲寄生相關蛋白的DNA分子。
4.與權利要求1所述象耳豆根結線蟲效應基因具有90%以上同源性且編碼與象耳豆根結線蟲寄生相關蛋白的DNA分子。
5..—種象耳豆根結線蟲效應蛋白ME-TCTP，其特征在于在SEQ ID N0:4所示氨基酸序列的氨基末端或羧基末端連接有特定標簽，所述特定標簽為5~6個精氨酸，或2~12個組氨酸，或如SEQ ID NO:5所示序列，或如SEQ ID NO:6所示序列，或如SEQ ID NO:7所示序列。
6.一種重組表達載體，其特征在于，由出發載體的多克隆位點插入權利要求1所述象耳豆根結線蟲效應基因或該基因的部分外顯子片段如SEQ ID NO:8~9任一所示序列構建而成。
7.—種重組基因表達盒，其特征在于，含有權利要求1所述象耳豆根結線蟲效應基因Me-tctp 0
8.—種轉基因細胞系，其特征在于，含有權利要求1所述象耳豆根結線蟲效應基因Me-tctp。
9.一種重組菌，其特征在于，含有權利要求1所述象耳豆根結線蟲效應基因
10.權利要求1所述象耳豆根結線蟲效應基因在制備轉基因植物中的應用。
【文檔編號】C12N15/84GK103509803SQ201310361407
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年8月19日 優先權日:2013年8月19日
【發明者】廖金鈴, 孫鳳俠, 卓侃 申請人:華南農業大學