專利名稱：一種離體高效構建多拷貝乳酸克魯維酵母表達載體的方法
技術領域：
本發明涉及的是乳酸克魯維酵母表達載體，特別是一種離體高效構建多拷貝的乳酸克魯維酵母表達載體的方法，可人為控制外源基因插入拷貝數并且可用于基因劑量效應研究，是酵母表達載體的一種有利的改造。
背景技術：
近年來，酵母表達系統引起了廣泛的重視，并逐漸被用于藥用蛋白質的生產。它既有像原核細胞系統生長快、便于基因操作和可以被大規模培養等優點，同時又有真核細胞具備的翻譯后加工、糖基化修飾能力，能生產有生物活性的重組蛋白等諸多特點。作為最簡單的真核生物之一，乳酸克魯維酵母培養成本低廉，已長期用于工業規模生產。其表達水平高，工程株構建周期短，表達系統不含任何病毒來源的元件，不產生內毒素。 乳酸克魯維酵母還具有真核細胞的大部分翻譯后修飾功能，包括簡單的糖基合成功能。為了獲得外源蛋白的最大表達，研究者們致力尋找高效的工業化菌株。目前所熟知的商業化菌株GG799是乳酸克魯維酵母野生單倍型菌株，已應用于食品工業之中，具有較良好的蛋白合成與分泌能力。乳酸克魯維酵母常用的表達載體有=PKLAC2。
乳酸克魯維酵母常用的表達系統仍然無法滿足日趨增長的產量需求，它的表達量和穩定性都有待提聞。
于是基于分子水平上的各種載體改造成為新的出路。T. Knight建立了一套新的的克隆策略并將其命名為“生物磚”，這種克隆策略可以使生物組件之間能夠標準化裝配， 跟傳統的機械制造一樣，各種組件之間具備相應的標準接口，可以以標準的方式將這些組件進行連接然后裝配并形成更大的組件。每個生物磚都是一段特殊的DNA，它包含特定的信息以及編碼相對應的信息都具有特定功能。例如，一段特殊的DNA可能是啟動子，核糖體結合位點，編碼蛋白質的序列，終止子等其中之一，也可能是這些基本部件的組合體。某些特定的酶切位點一般包含在每個生物磚的上游及下游，需要通過傳統的酶切連接反應，就可以將任意一個標準化后的生物磚組件和其他的生物磚組件按照人們的意愿進行組合，并且新的組合序列依然可以用于下一個 組合，仍然是標準化的生物磚組件。不斷重復這樣的操作，可以利用簡單的手段，從最簡單的組件開始建立，最終可以構建大規模的復雜系統。 簡單的說，生物磚就是一段DNA，這段DNA含有特殊酶切位點和特定功能。一個標準化的生物磚有三個重要部分組成前綴(prefix),主體(body)和后綴(suffix)。其中主體部分是一段可以發揮特定功能的DNA序列，可以是調節基因，也可以是編碼蛋白質基因或終止子等，也可以是它們之間的組合。其中含特殊酶切位點的序列包括在前綴(prefix)和后綴 (suffix)中，起到類似于傳統機械制造中接口的作用。
應用基因改造和生物磚技術能夠提高乳酸克魯維酵母表達蛋白質基因的表達量和穩定性。發明內容
本發明的目的是通過基因工程的手段構建能夠人工選擇插入外源基因拷貝數的表達載體，并成功表達甘露聚糖酶，提供研究乳酸克魯維酵母中基因劑量效應與蛋白表達水平關系的技術方法。
本發明是這樣實現的。其步驟為1、設計合成PCR引物。根據商品化的乳酸克魯維酵母Kluyveromyces lactis GG799 的載體PKLAC2基因序列，設計合成PCR用的10個引物(見表I)。
表格I
權利要求
1.一種離體高效構建多拷貝的乳酸克魯維酵母表達載體的方法，其特征在于其步驟為I)、設計合成PCR引物；根據商品化的乳酸克魯維酵母Kluyveromyces lactis GG799 的載體PKLAC2基因序列，設計合成PCR用的10個引物
全文摘要
本發明提出了一種離體高效構建多拷貝的乳酸克魯維酵母表達載體的方法，步驟為1)根據乳酸克魯維酵母KluyveromyceslactisGG799的載體pKLAC2基因序列，設計合成PCR用的10個引物；2)合成四個限制性內切酶位點的酵母表達核式結構的基因片段；3)構建表達載體BpKLAC2；4)用限制性內切酶酶切驗證重組載體的正確性；5)在表達載體BpKLAC2上插入目的基因成為含有目的基因的單拷貝表達載體；6)應用生物磚法，離體多拷貝表達載體。應用本發明能夠提高乳酸克魯維酵母表達目的蛋白質基因的表達量和穩定性。
文檔編號C12R1/645GK103060367SQ201210587460
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月29日 優先權日2012年12月29日
發明者馬立新, 趙西選, 劉曉倩, 李曄星, 王亞平, 姚永蘭 申請人:湖北大學, 湖北花果山實業有限公司