一種蘆筍莖枯病菌原生質體制備與再生方法
【專利摘要】本發明公開了一種蘆筍莖枯病菌原生質體制備與再生方法，它涉及細胞工程中真菌原生質體制備與再生【技術領域】。它的具體操作步驟如下：(1)制備蘆筍莖枯病菌分生孢子懸液；(2)制備新鮮菌絲體；(3)酶解菌絲細胞壁：(4)原生質體分離；(5)原生質體再生。本發明易于操作，對設備要求低，同時酶解時間及再生周期短，有效提高了原生質體制備及再生的效率。
【專利說明】ー種蘆筍莖枯病菌原生質體制備與再生方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及的是細胞工程中真菌原生質體制備與再生【技術領域】，具體涉及ー種蘆筍莖枯病菌原生質體制備與再生方法。
【背景技術】
[0002]蘆笑(Asparagus officinalis L.),又名石刁柏，屬天門冬科天門冬屬宿根性多年生草本植物，是ー種具有很高營養價值的保健型蔬菜，在國際上享有“蔬菜之王”的美譽。蘆笑莖枯病是由天門冬擬莖點霉(Phmopsis asparagi)引起的世界性重要真菌病害,在美國、歐洲和澳大利亞等地區均有報道。該病主要危害莖桿或嫩笑(stems or spears),也可侵染枝梗和擬葉，初呈水潰狀條斑、后漸變成暗黒色梭條形，病斑中部赤褐色凹陷，大量小黒點狀分生孢子器散生其上，最終導致整株枯死并迅速傳染至相鄰植株。我國作為世界蘆筍主產區，莖枯病發生特別嚴重，近年平均感染率超過50%，常導致成片絕收，已成為制約我國蘆筍發展的最主要瓶頸之一，被稱作“蘆筍癌癥”。目前，利用原生質體進行分子轉化技術已成為絲狀真菌轉化、相關分子克隆技術和致病機制研究的重要組成部分，原生質體分子轉化技術依賴于制備高效可再生的原生質體，但由于不同種類絲狀真菌細胞結構，尤其是細胞壁的結構和組成存在著明顯差異，因此制備原生質體的最佳條件和體系也存在著很大差異。國內外尚未見蘆筍莖枯病菌的原生質體制備體系相關報道，這不利于對該病原菌進行深入的致病分子機制研究。原生質體的高效再生是后期深入研究其致病分子機制的必需條件，不同的酶解時間及穩滲劑對原生質體再生具有重要影響。為了篩選蘆筍莖枯病菌致病力變異菌株，加強對其致病機制的了解，更好地為農業生產上開展抗病分子育種提供基礎，需要對其原生質體制備及再生的方法進行研究。

【發明內容】

`[0003]針對現有技術上存在的不足，本發明目的是在于提供ー種蘆筍莖枯病菌原生質體制備與再生方法，使其原生質體的制備數最高達到2.8X 107個/ mL,再生率最高達到24.0%。
[0004]為了實現上述目的，本發明是通過如下的技術方案來實現:ー種蘆筍莖枯病菌原生質體制備與再生方法，具體操作步驟如下:
[0005](1)、制備蘆筍莖枯病菌分生孢子懸液:
[0006]挑取蘆笑莖枯病菌Phomopsis asparagi菌絲ー環，接種在由50mL燕麥瓊脂培養基制成的固體斜面上，在溫度25°C、光照12h / d條件下培養10-14d，待出現成熟的蘆筍莖枯病菌分生孢子器(可分泌出分生孢子)后，加入30mL無菌蒸餾水洗孢子，得到含有孢子團塊的孢子液，用移液器將該孢子液振蕩打碎孢子團塊，過濾，取濾液進行倍比稀釋，顯微鏡下計數，得到濃度為1 X 106個/ mL的蘆筍莖枯病菌分生孢子懸液；
[0007](2)、制備新鮮菌絲體:
[0008]將制備好的分生孢子懸液接種于液體完全培養基中，25°C條件下150r / min搖床培養72h，漏斗過濾，獲得新鮮菌絲體；
[0009](3)、酶解菌絲細胞壁:
[0010]取l.0g新鮮菌絲體，加入10mL裂解酶、崩潰酶和蝸牛酶的混合酶液，33°C水浴酶解 4.5h，采用 1.0mol / L MgS04(10m mol / L ρΗ6.98 的 PBS 配制，體積比為 MgS04:PBS=3:1)做滲透壓穩定劑時，原生質體數量達到2.8 X107個/ mL；
[0011](4)、原生質體分離:
[0012]過濾酶解溶液，濾去未被酶解的菌絲殘片，濾液于溫度4°C、轉速5000r / min、離心分離5min ;棄上清液，用l_2mL濃度1.0mol / L的山梨醇溶液洗滌2_3次，收集原生質體重懸于lmL濃度1.0mol / L預冷的山梨醇溶液中保存，得到原生質體懸液；
[0013](5)、原生質體再生:
[0014]將原生質體懸液 用濃度0.6mol / L的蔗糖溶液稀釋100倍，取稀釋液0.lmL涂布于馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板和高滲馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板；溫度25°C、保持相対濕度60%-75%、光照培養12h / d，培養3-5d直至長出直徑約1mm再生菌落；調查再生情況，對形成的菌落記數㈧；以不含穩滲劑的PDA培養基作對照(B)。計算再生率，再生率(% ) = (A-B) X100 /總原生質體數；
[0015]所述的步驟(3)混合酶液由下列重量配比的物質組成:裂解酶15g / L、崩潰酶10g / L、蝸牛酶 15g / L、溶劑為 1.0mol / L MgS04(10m mol / LpH6.98 的 PBS 配制，體積比為MgS04:PBS=3:1)，配置好后用直徑為0.45 μ m的超微微孔濾膜過濾除菌；
[0016]所述的步驟(5)中的高滲馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基由下列重量配比的物質組成:馬鈴薯200g / L，葡萄糖20g / L，瓊脂20g / L，蔗糖205g /し
[0017]本發明的有益效果是:
[0018]1.制備エ藝簡單，易操作；
[0019]2.原生質體制備數最高達到1.5-2.8X107個/ mL，再生率最高達到24.0%。【具體實施方式】
[0020]為使本發明實現的技術手段、創作特征、達成目的與功效易于明白了解，下面結合【具體實施方式】，進ー步闡述本發明。
[0021]本【具體實施方式】采用以下技術方案:ー種蘆筍莖枯病菌原生質體制備與再生方法，具體操作步驟如下:
[0022](1)、制備蘆筍莖枯病菌分生孢子懸液:
[0023]挑取蘆笑莖枯病菌Phomopsis asparagi菌絲ー環，接種在由50mL燕麥瓊脂培養基制成的固體斜面上，在溫度25°C、光照12h / d條件下培養10-14d，待出現成熟的蘆筍莖枯病菌分生孢子器(可分泌出分生孢子)后，加入30mL無菌蒸餾水洗孢子，得到含有孢子團塊的孢子液，用移液器將該孢子液振蕩打碎孢子團塊，過濾，取濾液進行倍比稀釋，顯微鏡下計數，得到濃度為1 X 106個/ mL的蘆筍莖枯病菌分生孢子懸液；
[0024](2)、制備新鮮菌絲體:
[0025]將制備好的分生孢子懸液接種于液體完全培養基中，25°C條件下150r / min搖床培養72h，漏斗過濾，獲得新鮮菌絲體；
[0026](3)、酶解菌絲細胞壁:[0027]取l.0g新鮮菌絲體，加入10mL裂解酶、崩潰酶和蝸牛酶的混合酶液，33°C水浴酶解 4.5h，采用 1.0mol / L MgS04(10m mol / L ρΗ6.98 的 PBS 配制，體積比為 MgS04:PBS=3: 1)做滲透壓穩定劑時，原生質體數量達到2.8X 107個/ mL ；
[0028](4)、原生質體分離:
[0029]過濾酶解溶液，濾去未被酶解的菌絲殘片，濾液于溫度4°C、轉速5000r / min、離心分離5min ;棄上清液，用l_2mL濃度1.0mol / L的山梨醇溶液洗滌2_3次，收集原生質體重懸于lmL濃度1.0mol / L預冷的山梨醇溶液中保存，得到原生質體懸液；
[0030](5)、原生質體再生:
[0031]將原生質體懸液用濃度0.6mol / L的蔗糖溶液稀釋100倍，取稀釋液0.lmL涂布于馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板和高滲馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板；溫度25°C、保持相対濕度60%-75%、光照培養12h / d，培養3-5d直至長出直徑約1mm再生菌落；調查再生情況，對形成的菌落記數㈧；以不含穩滲劑的PDA培養基作對照(B)。計算再生率，再生率(% ) = (A-B) X100 /總原生質體數；
[0032]所述的步驟(3)混合酶液由下列重量配比的物質組成:裂解酶15g / L、崩潰酶10g / L、蝸牛酶 15g / L、溶劑為 1.0mol / L MgS04(10m mol / LpH6.98 的 PBS 配制，體積比為MgS04:PBS=3: 1)，配置好后用直徑為0.45 μ m的超微微孔濾膜過濾除菌；
[0033]所述的步驟(5)中的高滲馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基由下列重量配比的物質組成:馬鈴薯200g / L，葡萄糖20g / L，瓊脂20g / L，蔗糖205g /し
[0034]本【具體實施方式】所述方法制備的蘆筍莖枯病菌原生質體大小均一，形態近似圓形，原生質體制備數較高。絲狀真菌由于其結構的特點，原生質體的分離有其獨特之處，早期形成的原生質體來自菌絲尖端，`這些原生質體往往缺少細胞核，再生較困難；后期形成的原生質體來自遠區細胞，形成的原生質體不均一。因此本發明采用分生孢子接種，在分生孢子充分生長為新鮮幼嫩時期的菌絲(72h)制備原生質體，為獲得較高的原生質體產量提供了基礎。
[0035]本【具體實施方式】所述方法菌絲細胞的原生質體產量較高，獲得的原生質體活力也較高。不同的水解酶、滲透壓穩定劑等對菌絲細胞壁的酶解及原生質體的形成及再生非常重要。本發明選用1.0mol / L的MgS04(10m mol / L pH6.98的PBS配制，體積比為MgS04:PBS=3:1)作為滲透壓穩定劑，水解酶由裂解酶、崩潰酶和蝸牛酶按一定比例混合而成，為高效制備原生質體提供了重要基礎。本發明所述方法采用0.6mol / L的蔗糖高滲馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養基作為再生平板，提高了原生質體的再生率。本發明所述方法制備的蘆筍莖枯病菌原生質體制備數最高能達到2.8X107f/ mL，再生率最高為24.0%。
[0036]本【具體實施方式】與超聲波法等原生質體制備方法相比較，本發明所述方法易于操作，對設備要求低，同時酶解時間及再生周期短，有效提高了原生質體制備及再生的效率。
[0037]本發明所述蘆筍莖枯病菌原生質體制備及再生方法原生質體制備數高，再生率較高，是蘆筍莖枯病菌原生質體制備及再生的可靠方法，并為擬莖點霉菌原生質體制備及再生提供技術參考。本發明為原生質體的制備與再生提供了ー種具有實際意義操作方法，為進ー步的采用原生質體轉化技術研究蘆筍莖枯病菌致病分子機制提供了基礎。
[0038]實例ー:收集燕麥固體培養基上(0A)的分生孢子器產生的分生孢子，并接種于完全液體培養基中(CM)，25°C條件下150r / min搖床培養36h，獲得新鮮菌絲體，采用1.5%裂解酶、1.0%崩潰酶1.5%蝸牛酶的混合酶:pH6.00，在30°C水浴酶解3.0h，用1.0mol / LMgS04(10m mol / LPBS配制，體積比為MgS04:PBS=3:1)做滲透壓穩定劑；將原生質體懸液用濃度0.6mol / L的蔗糖溶液稀釋100倍，取稀釋液0.lmL涂布于馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板和高滲馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板于25°C下培養3-5d，原生質體數量達到1.7 X 107個/ mL,再生率為22.0%。
[0039]實例ニ:收集燕麥固體培養基上(0A)的分生孢子器產生的分生孢子，并接種于完全液體培養基中(CM)，25°C條件下150r / min搖床培養48h，獲得新鮮菌絲體，采用1.5%裂解酶、1.0%崩潰酶1.5%蝸牛酶的混合酶:pH7.60，在35°C水浴酶解4.0h，用1.0mol / LMgS04(10m mol / LPBS配制，體積比為MgS04:PBS=3:1)做滲透壓穩定劑；將原生質體懸液用濃度0.6mol / L的蔗糖溶液稀釋100倍，取稀釋液0.lmL涂布于馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板和高滲馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板于25°C下培養3-5d，原生質體數量達到2.2 X 107個/ mL,再生率為22.5%。
[0040]實例三:收集燕麥固體培養基上(0A)的分生孢子器產生的分生孢子，并接種于完全液體培養基中(CM)，2 5°C條件下150r / min搖床培養72h，獲得新鮮菌絲體，采用1.5%裂解酶、1.0%崩潰酶1.5%蝸牛酶的混合酶:pH6.98，在33°C水浴酶解4.5h，用1.0mol / LMgS04(10m mol / LPBS配制，體積比為MgS04:PBS=3:1)做滲透壓穩定劑；將原生質體懸液用濃度0.6mol / L的蔗糖溶液稀釋100倍，取稀釋液0.lmL涂布于馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板和高滲馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板于25°C下培養3-5d，原生質體數量達到2.8 X 107個/ mL,再生率為24.0%o
[0041]以上顯示和描述了本發明的基本原理和主要特征和本發明的優點。本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明精神和范圍的前提下，本發明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發明范圍內。本發明要求保護范圍由所附的權利要求書及其等效物界定。
【權利要求】
1.ー種蘆筍莖枯病菌原生質體制備與再生方法，其特征在于，具體操作步驟如下: (1)、制備蘆筍莖枯病菌分生孢子懸液: 挑取蘆笑莖枯病菌Phomopsis asparagi菌絲ー環，接種在由50mL燕麥瓊脂培養基制成的固體斜面上，在溫度25°C、光照12h / d條件下培養10-14d，待出現成熟的蘆筍莖枯病菌分生孢子器(可分泌出分生孢子)后，加入30mL無菌蒸餾水洗孢子，得到含有孢子團塊的孢子液，用移液器將該孢子液振蕩打碎孢子團塊，過濾，取濾液進行倍比稀釋，顯微鏡下計數，得到濃度為1 X 106個/ mL的蘆筍莖枯病菌分生孢子懸液； (2)、制備新鮮菌絲體: 將制備好的分生孢子懸液接種于液體完全培養基中，25°C條件下150r / min搖床培養72h，漏斗過濾，獲得新鮮菌絲體； (3)、酶解菌絲細胞壁: 取l.0g新鮮菌絲體，加入10mL裂解酶、崩潰酶和蝸牛酶的混合酶液，33°C水浴酶解4.5h，采用 1.0mol / L MgS04(10m mol / L ρΗ6.98 的 PBS 配制，體積比為 MgS04:PBS=3: 1)做滲透壓穩定劑時，原生質體數量達到2.8X 107個/ mL ; (4)、原生質體分 離: 過濾酶解溶液，濾去未被酶解的菌絲殘片，濾液于溫度4°C、轉速5000r / min、離心分離5min ;棄上清液，用l_2mL濃度1.0mol / L的山梨醇溶液洗滌2_3次，收集原生質體重懸于lmL濃度1.0mol / L預冷的山梨醇溶液中保存，得到原生質體懸液； (5)、原生質體再生: 將原生質體懸液用濃度0.6mol / L的蔗糖溶液稀釋100倍，取稀釋液0.lmL涂布于馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板和高滲馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板；溫度25°C、保持相対濕度60%-75%、光照培養12h / d，培養3-5d直至長出直徑約1mm再生菌落；調查再生情況，對形成的菌落記數(A);以不含穩滲劑的PDA培養基作對照(B)。計算再生率，再生率(% ) = (A-B) X100 /總原生質體數。
2.根據權利要求1所述的ー種蘆筍莖枯病菌原生質體制備與再生方法，其特征在干，所述的步驟(3)混合酶液由下列重量配比的物質組成:裂解酶15g / L、崩潰酶10g / L、蝸牛酶 15g / L、溶劑為 1.0mol / L MgS04(10m mol / L ρΗ6.98 的 PBS 配制，體積比為 MgS04:PBS=3:1)，配置好后用直徑為0.45 μ m的超微微孔濾膜過濾除菌。
3.根據權利要求1所述的ー種蘆筍莖枯病菌原生質體制備與再生方法，其特征在干，所述的步驟(5)中的高滲馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基由下列重量配比的物質組成:馬鈴薯200g / L,葡萄糖20g / L,瓊脂20g / L,鹿糖205g /し
【文檔編號】C12N1/14GK103451110SQ201310382669
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年8月21日 優先權日:2013年8月21日
【發明者】張岳平, 陳光宇, 羅紹春, 周勁松, 湯泳萍, 黃燕萍 申請人:江西省農業科學院蔬菜花卉研究所