一種隨機(jī)突變獲得的谷氨酸脫羧酶突變體基因及其編碼蛋白質(zhì)和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了兩種pH作用范圍拓寬的谷氨酸脫羧酶突變體，其DNA序列分別為SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.3，氨基酸序列分別為SEQ?ID?NO.2和SEQ?ID?NO.4。本發(fā)明結(jié)合隨機(jī)突變（易錯(cuò)PCR）技術(shù)和DNA定點(diǎn)突變技術(shù)，對(duì)野生型谷氨酸脫羧酶GadB1編碼基因進(jìn)行分子改造，得到了兩種突變酶GadB1T17I/D294G/Q346H和GadB1T17I/D294G/E312S/Q346H，相對(duì)野生酶其有效pH作用范圍得到一定的擴(kuò)展，尤其在偏中性pH條件下仍具有較好的活性。隨著有效pH作用范圍的拓寬，突變酶在pH5.5～6.5條件下，仍然具有較高的催化活性，因此解決了谷氨酸脫羧酶催化GABA生物合成時(shí)，在pH5.5～6.5時(shí)，催化能力低的問題，為利用該酶及其編碼基因來(lái)生物合成GABA創(chuàng)造好的條件。
【專利說(shuō)明】一種隨機(jī)突變獲得的谷氨酸脫羧酶突變體基因及其編碼蛋白質(zhì)和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及兩種谷氨酸脫羧酶突變體基因及其應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)的【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]定向進(jìn)化屬于非理性設(shè)計(jì)，是指通過在實(shí)驗(yàn)室中模擬達(dá)爾文自然進(jìn)化過程，針對(duì)某一蛋白質(zhì)酶的編碼基因，通過易錯(cuò)PCR、DNA重組等技術(shù)來(lái)改造酶的基因，然后根據(jù)特定的改造目的，篩選有價(jià)值的突變酶。近10年來(lái)，定向進(jìn)化技術(shù)已經(jīng)在酶的相關(guān)性質(zhì)改造領(lǐng)域取得了很多成功的案例，主要集中在提高催化活性，改進(jìn)底物特異性，提高熱穩(wěn)定性等方面。定點(diǎn)突變(site-directed mutagenesis)屬于理性設(shè)計(jì),是指在目的DNA片段的指定位點(diǎn)引入特定的堿基對(duì)，從而改變其編碼的氨基酸序列的技術(shù)。它是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能之間的復(fù)雜關(guān)系的強(qiáng)有力的工具，也是實(shí)驗(yàn)室常用的基因改造的手段。對(duì)某個(gè)已知的基因的特定喊基進(jìn)行定點(diǎn)改造、缺失、或者插入，可以改變對(duì)應(yīng)氣基酸序列和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能特征，有助于了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系。尤其是，在利用隨機(jī)突變等定向進(jìn)化技術(shù)篩選得到具有效果的重要氨基酸位點(diǎn)后，然后對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變分析，將有助于進(jìn)一步了解該位點(diǎn)在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系中所發(fā)揮的作用，所以理性設(shè)計(jì)和非理性設(shè)計(jì)的合理結(jié)合是蛋白質(zhì)改造的一種重要技術(shù)手段。
[0003]谷氛酸脫竣酶(glutamatedecarboxylase,簡(jiǎn)稱 GAD ；EC4.1.1.15)以 PLP 作為輔酶，催化谷氨酸發(fā)生不可逆的α-脫酸反應(yīng)，過程中消耗一個(gè)質(zhì)子，生成Υ-氨基丁酸(Y-aminbutyric，簡(jiǎn)稱GABA)。GAD廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物中，但是在它們的機(jī)體里面的功能各不相同。其中在動(dòng)物中主要是產(chǎn)生GABA，一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，因此具有重要的生理功能；在植物中，GAD系統(tǒng)可以抵抗多種壓力，如驟然高溫、缺氧、鈣離子驟增等；在微生物中，特別是一些腸道細(xì)菌，如大腸桿菌、乳酸菌等，主要與機(jī)體耐酸機(jī)制有關(guān)，它們的最適PH —般在4~5，在此范圍之外酶活力會(huì)大幅降低，尤其是當(dāng)pH大于6時(shí)基本失去活性，這使得利用該酶生物合成GABA受到體系pH值的嚴(yán)重限制，因此需要拓寬GAD酶的pH作用范圍，使其在偏中性條件下，仍具有較好的活性，解決谷氨酸脫羧酶催化GABA生物合成時(shí)，在pH5.5~6.5時(shí)，催化能力低的問題，為利用該酶及其編碼基因來(lái)生物合成GABA創(chuàng)造好的條件。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供了兩種谷氨酸脫羧酶突變體，核苷酸序列如SEQID N0.1和SEQ ID N0.3所示。其編碼的突變體酶在偏中性條件下，酶活有明顯的提高，解決了野生型的谷氨酸脫羧酶在偏中性PH條件下催化活性低的問題，為利用該酶催化GABA生物合成創(chuàng)造好的條件，氨基酸序列如SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.4所示。其中SEQ ID N0.3所示突變體是在SEQ ID N0.1所述突變體基礎(chǔ)上將312位氨基酸由谷氨酸突變?yōu)榻z氨酸獲得，其氨基酸序列如SEQ ID N0.4。
[0005]獲得SEQ ID N0.2所示谷氨酸脫羧酶突變體的方法為在中國(guó)專利CN201110020606.8中公布的gadBl基因序列基礎(chǔ)上，對(duì)其編碼的氨基酸進(jìn)行取代，所述氨基酸取代點(diǎn)為第17位的蘇氨酸、第294位的天冬氨酸和第346位的谷氨酰胺。
[0006]獲得SEQ ID N0.4所示谷氨酸脫羧酶突變體的方法為在中國(guó)專利CN201110020606.8中公布的gadBl基因序列基礎(chǔ)上，對(duì)其編碼的氨基酸進(jìn)行取代，所述氨基酸取代點(diǎn)為第17位的蘇氨酸、第294位的天冬氨酸、第312位的谷氨酸和第346位的谷氨酰胺。[0007]本發(fā)明還提供了一種針對(duì)上述突變體的指示劑平板篩選方法，具體方法為:將突變庫(kù)中的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)移到篩選板上，30°C培養(yǎng)IOh后，挑取在菌落周圍變綠色的單菌落。篩選板的配方為:在LB固體培養(yǎng)基中含有1.2g/L L-Glu、30mg/L卡拉霉素、1/10000甲基紅-亞甲基指示劑，待平板凝固后，在每個(gè)培養(yǎng)皿上涂布10 μ LlM IPTG，然后正面放置30min。
[0008]上述突變體基因及其所編碼氨基酸在生物合成GABA的應(yīng)用均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
[0009]本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)上述谷氨酸脫羧酶突變體的方法，是將SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列以pET28a或能表達(dá)該酶的質(zhì)粒為表達(dá)載體，以大腸桿菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)或能表達(dá)該酶的菌株為表達(dá)宿主，實(shí)現(xiàn)突變體基因
gadB1T17I/D294G/Q346H 和 gadB ^i7IZD294GZE3I2SZQ346H 的高效表達(dá)。
[0010]本發(fā)明所用的谷氨酸脫羧酶的基因gadBl來(lái)自產(chǎn)Y-氨基丁酸的短乳桿菌，該菌株已于2010年12月27日，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:中國(guó)武漢、武漢大學(xué)，保藏編號(hào):CCTCC NO:M2010367，分類學(xué)命名短乳桿菌 Lb85 (Lactobacillus brevis Lb85),gadBl的測(cè)序結(jié)果在中國(guó)專利CN201110020606.8中已經(jīng)公布，序列見SEQ ID N0.5。
[0011]本發(fā)明的具體方法如下:第一，以來(lái)自L.brevis Lb85的谷氨酸脫羧酶基因gadBl為模板，通過易錯(cuò)PCR獲得隨機(jī)突變文庫(kù)，采用平板指示劑篩選和粗酶液酶活測(cè)定兩步篩選法獲得需要的突變酶，擴(kuò)大培養(yǎng)，表達(dá)、純化后得到突變酶GadBl—46H，并測(cè)定其最適pH ;第二，以第一步篩選得到的突變體基因?yàn)槟０澹M(jìn)行E312S定點(diǎn)突變，構(gòu)建突變體，以質(zhì)粒pET28a或能表達(dá)該酶的載體為表達(dá)載體，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)細(xì)胞或能表達(dá)該酶的宿主細(xì)胞，挑選驗(yàn)證后的陽(yáng)性單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，表達(dá)、純化后得到突變酶
GadB1T17I/D294G/E312S/Q346H；并測(cè)定其最適邱。
[0012]本發(fā)明中表達(dá)單元的啟動(dòng)子為常用的T7啟動(dòng)子，在T7啟動(dòng)子的作用下，突變體酶可以直接在宿主細(xì)胞E.coli BL2KDE3)中，完成胞內(nèi)的可溶性表達(dá)。
[0013]本發(fā)明在gadBl的基礎(chǔ)上進(jìn)行易錯(cuò)PCR隨機(jī)突變和定點(diǎn)突變，提高了突變酶在pH5.5 ~6.5 條件下的催化能力。通過 SffISS-MODEL (http: //swissmodel.expasy.0rg/)在線模擬突變體酶的三維結(jié)構(gòu)(圖5)，然后通過分析氫鍵作用力，發(fā)現(xiàn)突變酶中氨基酸替換后，在中性條件下可能會(huì)增大活性槽開口的角度，這樣會(huì)增加酶與底物結(jié)合空間，減小它們結(jié)合的空間位阻。隨著突變酶的有效PH作用范圍的擴(kuò)展，能夠更好的運(yùn)用突變體酶，在pH5.5~6.5的條件下，催化GABA的生物合成。
[0014]本發(fā)明通過比較野生酶GadBl和突變酶(^1(^11171/1)294_461!、63(^嚴(yán)1/1)294_1—34? 的有效作用PH范圍和體外的催化能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在pH6.5下，突變體酶GadB1—η將L-谷氨酸轉(zhuǎn)變成GABA的轉(zhuǎn)化率為野生型的10.6倍；突變體酶GadBlTm/D294G/E312S/Q346H將L-谷
氨酸轉(zhuǎn)變成GABA的轉(zhuǎn)化率為野生型的5.9倍。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1為重組質(zhì)粒pET28a(+)-gadBl的構(gòu)建圖譜:
[0016]圖2為定點(diǎn)突變的原理示意圖:
[0017]圖3為平板初篩的顏色變化圖:
[0018]圖4為野生型和突變型酶純化后的SDS-PAGE圖譜:
[0019]圖5為帶有突變位點(diǎn)的谷氨酸脫羧酶的模擬的空間結(jié)構(gòu):
[0020]圖6為野生和突變酶的最適pH變化圖:
【具體實(shí)施方式】
[0021]以下通過實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步闡明本發(fā)明，下列實(shí)施例用于說(shuō)明目的而非用于限制本發(fā)明范圍。材料和試劑:
[0022]所用的限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、PCR試劑等均購(gòu)于TaKaRa寶生物公司；質(zhì)粒提取試劑盒、基因組提取試劑盒、瓊脂糖純化試劑盒、大腸桿菌JM109、BL21(DE3)菌株購(gòu)于天跟生物公司；引物購(gòu)于上海捷銳公司；SDS-PAGE試劑盒購(gòu)于碧云天生物公司；其他試劑均為國(guó)內(nèi)或者國(guó)外購(gòu)買的分析純?cè)噭?br> [0023]實(shí)施例一:重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0024]本發(fā)明以PCR方法獲取gadBl序列，但不限于PCR方法。
[0025]將L.brevis Lb85(菌株在相關(guān)文獻(xiàn)中公開，已保存于武漢大學(xué)，保藏編號(hào):CCTCCNO:M2010367，并在中國(guó)專利CN201110020606.8中公開)培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)中期，取3 mL菌液12000rpm離心I min棄上清，溶菌酶處理0.5 h，然后按照試劑盒說(shuō)明提取基因組DNA。
[0026]設(shè)計(jì)如下的引物來(lái)用于gadBl的擴(kuò)增:
[0027]gadBl-F:5’ ~GACCGCTCATATGGCTATGTTGTATGGAAAAC~3J
[0028]gadB1-R: 5，~CGTGAATTCTTAGTGCGTGAACCCGTATT~3，
[0029]其中上游引物酶切位點(diǎn)為NdeI CgadBl-F中下劃線部分)，下游引物酶切位點(diǎn)為EcoRI (gadBl-R中下劃線部分)。
[0030] PCR擴(kuò)增條件:94°C變性 5min，34個(gè)循環(huán)(95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 90s)，最后 72°C延伸IOrnin0
[0031]擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，用NdeI和EcoRI對(duì)PCR產(chǎn)物和載體pET28a進(jìn)行雙酶切，兩者的回收產(chǎn)物，用T4連接酶22°C下連接4h，化學(xué)轉(zhuǎn)化到JM109細(xì)胞中，待平板上長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化子之后，挑取轉(zhuǎn)化子液體培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，通過酶切和PCR驗(yàn)證獲得重組質(zhì)粒pET28a-gadBl (圖1)，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)到BL21 (DE3)細(xì)胞，得到BL21 (DE3)/pET28a-gadBl工程菌。
[0032]實(shí)施例二:利用隨機(jī)突變來(lái)構(gòu)建谷氨酸脫羧酶的突變文庫(kù)
[0033]利用易錯(cuò)PCR技術(shù)在體外向谷氨酸脫羧酶基因gadBl引入核苷酸突變。
[0034]易錯(cuò)PCR的反應(yīng)條件和引物:(50 UL體系)
[0035]
【權(quán)利要求】
1.一種谷氨酸脫羧酶突變體基因，其特征在于:其核苷酸序列如SEQ ID N0.1。
2.權(quán)利要求1所述突變基因編碼的谷氨酸脫羧酶突變體，其特征在于:其氨基酸序列如 SEQ ID N0.2。
3.權(quán)利要求1所述的突變體，其特征在于其312位氨基酸由谷氨酸突變?yōu)榻z氨酸，其核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。
4.權(quán)利要求3所述突變基因編碼的谷氨酸脫羧酶突變體，其特征在于:其氨基酸序列如 SEQ ID N0.4。
5.獲得權(quán)利要求2所述谷氨酸脫羧酶突變體的方法，其特征在于:在中國(guó)專利CN201110020606.8中公布的gadBl基因序列基礎(chǔ)上，對(duì)其編碼的氨基酸進(jìn)行取代，所述氨基酸取代點(diǎn)為第17位的蘇氨酸、第294位的天冬氨酸和第346位的谷氨酰胺。
6.獲得權(quán)利要求5所述谷氨酸脫羧酶突變體的方法，其特征在于:在中國(guó)專利CN201110020606.8中公布的gadBl基因序列基礎(chǔ)上，對(duì)其編碼的氨基酸進(jìn)行取代，所述氨基酸取代點(diǎn)為第17位的蘇氨酸、第294位的天冬氨酸、第312位的谷氨酸和第346位的谷氨酰胺。
7.權(quán)利要求2或4所述突變體的指示劑平板篩選方法，其特征是:將突變庫(kù)中的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)移到篩選板上，30°C培養(yǎng)IOh后，挑取在菌落周圍變綠色的單菌落。篩選板的配方為:在LB固體培養(yǎng)基中含有1.2g/L L-Glu、30mg/L卡那霉素、1/10000甲基紅-亞甲基指示劑，待平板凝固后，在每個(gè)培養(yǎng)皿上涂布10 μ LlM IPTG，然后正面放置30min。
8.權(quán)利要求1或3所述突變體基因及其所編碼氨基酸在生物合成GABA的應(yīng)用。
9.一種生產(chǎn)權(quán)利要求2或4所述兩種谷氨酸脫羧酶突變體的方法，其特征是將SEQ IDN0.1和SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列以pET28a或能表達(dá)該酶的質(zhì)粒為表達(dá)載體，以大腸桿菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)或能表達(dá)該酶的菌株為表達(dá)宿主，實(shí)現(xiàn)突變體基因gadB1T17I/D294G/Q346H 和職詘訓(xùn)SAB 棚的高效表達(dá)。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK103484489SQ201310438191
【公開日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2013年9月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月24日
【發(fā)明者】史鋒, 謝一龍, 李永富, 李燁 申請(qǐng)人:江南大學(xué)