一種腰椎間盤退變相關snp的檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種腰椎間盤退變相關SNP的檢測試劑盒。該試劑盒包括以下成分：特異性引物、特異性探針、標準DNA模板、熒光定量PCR反應液。本發明還公開了一種檢測檢測腰椎間盤退變相關SNP熒光定量PCR試劑盒的使用方法。利用該試劑盒可以快速定量檢測SNP位點的突變情況，從而預測腰椎間盤退變發生情況。本發明操作簡便、快速、結果穩定、靈敏度高且特異性強。
【專利說明】—種腰椎間盤退變相關SNP的檢測試劑盒
【技術領域】:
[0001]本發明涉及一種SNP檢測試劑盒。具體而言，本發明涉一種檢測腰椎間盤退變相關SNP的檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]腰背部疼痛是臨床上的常見疾病和多發病，主要癥狀是后背的腰骶部的疼痛或不適感，可伴有或不伴有下肢的放射痛，是引起失能最常見原因。在一生中，約80%人群飽受腰背部疼痛的困擾，嚴重影響了他們的日常工作和生活。其中腰椎間盤退變(lumbar discdegeneration, LDD)為誘因的約占下腰痛的50%，是引起腰背部疼痛的主要原因之一。雖然LDD疾病的發生是遺傳和環境因素的共同作用，但具有很大程度的遺傳易感性，可能與人群中存在的基因單核酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)有關[ValdesA M，Hassett G，Hart D J，et al.Radiographic progression of lumbar spine discdegeneration is influenced by variation at inflammatory genes:a candidate SNPassociation study in the Chingford cohort[J].Spine，2005，30(21):2445-2451.]0SNP分布廣泛，數量多而且相對穩定地存在于人類染色體上。ADAMTS5基因單核苷酸多態性在腰椎間盤退變性疾病的發生中扮演著非常重要的角色，因而有必要對潛在的發病群體進行篩選，以進一步闡明ADAMTS5基因單核苷酸多態性(SNP)與腰椎間盤退變關系，為預防和診斷疾病提供指導。
[0003]基因診斷技術的出現，改變了過去臨床上僅依靠相關臨床特征為判斷依據，有利于疾病的提前預防和確診。由于腰椎間盤退變是骨科的常見病及多發病之一，其病因復雜，到目前為止還沒有診斷腰痛的公認標準，因此對根據相關基因變異，進行分子檢測是預防和診斷該病的有效措施。可以作為一個潛在的定量檢測和敏感的標記物評估早期腰椎間盤退變的方法。研究表明早期腰椎間盤退變時采用干細胞再生移植，將會是治療椎間盤退變的最有效的手段，從而緩解腰背部疼痛，因此對腰椎間盤退變的早期診斷和評價十分重要。

【發明內容】
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[0004]為了能夠檢測出整個社會人群中易患LDD的群體，為易感人群做出預警，盡早采取應對措施，避免LDD的發生，本發明公開了一種可以檢測與腰椎間盤退變相關的SNP熒光定量PCR試劑盒。
[0005]本發明通過檢測489例腰椎間盤退變患者和558份正常人的ADAMTS基因在病例及對照(case-control)中的分布研究，結果顯示ADAMTS的3個SNP位點:rsl51058 (SNP10), rs229052 (SNPll), rsl62502 (SNP18)與腰椎間盤退變具有高度相關性。在 LDD 人群中 ADAMTS-5 的 rsl51058(SNP10)處由 A 突變成 G，rs229052 (SNPll)處由 A 突變成G，或rsl62502 (SNP18)處由G突變成A，而正常人非常小的概率在上述位點發生上述的突變。
[0006]本發明根據基因ADAMTS-5的SNP10、SNP11、SNP18三個突變位點區域的DNA序列設計并合成3對引物和位于正反引物之間的熒光探針，所述的熒光探針包括陽性探針和陰性探針，各自標記不同的熒光，陽性探針與突變的DNA鏈雜交，陰性探針與正常DNA鏈雜交。上述探針在設計時盡量使不同探針的Tm值盡量位于(45±5)°C，使探針長度位于14-20bp，使每對探針所檢測的基因位點位于探針序列中部或中部附近，使探針與相應單鏈靶基因的結合部位盡量靠近單鏈靶基因的5’端至中部區域之間以保障雜交效率。探針的5’端有氨基修飾基團，以便與醛基修飾芯片相結合:不同探針的綜合參數(探針長度、GC%及Tm值)盡量接近，為了減少雜交時的空間位阻。
[0007]本發明公開了針對上述3個ADAMTS-5基因SNP位點rsl51058 (SNPlO)，rs229052 (SNPll)和rsl62502 (SNP18)突變的熒光定量PCR檢測試劑盒，所述試劑盒包括:檢測SNPlO的引物和探針:上游引物I其序列如序列表SEQ ID N0.1所示；下游引物2其序列如序列表SEQ ID N0.2所示；陽性特異性熒光探針3，其序列如序列表SEQ ID N0.3所/Jn ;陰性特異性突光探針4,其序列如序列表SEQ ID N0.4所不；檢測SNPll的引物和探針:上游引物5其序列如序列表SEQ ID N0.5所示；下游引物6其序列如序列表SEQ ID N0.6所示；陽性特異性熒光探針7，其序列如序列表SEQ ID N0.7所示；陰性特異性熒光探針8，其序列如序列表SEQ ID N0.8所示；檢測SNPll的引物和探針:上游引物9其序列如序列表SEQ ID N0.9所示，下游引物10其序列如序列表SEQ ID N0.10所示，陽性特異性熒光探針11，其序列如序列表SEQ ID N0.11所示；陰性特異性熒光探針12，其序列如序列表SEQ IDN0.12所示。本發明的試劑盒還包括:熒光定量PCR mix (DBI);含上述3個SNP位點的突變和未突變的DNA標準品。
[0008]所述的突光探針為Taqman-MGB突光探針,或者用Taqman突光探針。
[0009]本發明最佳的方式是將熒光定量PCR技術結合Taqman-MGB熒光探針來定量檢測ADAMTS-5的點突變。Taqman-MGB熒光探針是一種寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團R和一個淬滅熒光基團Q。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’ -3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，分離后的報告基團會發出熒光，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。
[0010]本發明所述的陽性探針5’端標記VIC熒光，陰性探針5’端標記FAM熒光；或者陰性探針5’端標記VIC熒光，陽性探針5’端標記FAM熒光，陽性探針3’端和陰性探針3’端標有熒光淬滅基團BHQ-1。
[0011] 本發明所述熒光定量PCR試劑盒的使用方法，具體步驟如下:
[0012]A)對基因組DNA待測樣品在相同反應條件下分別加入陽性或陰性探針進行PCR擴增，監測反應體系中熒光信號的變化；
[0013]B)根據濃度已知的標準樣品繪制標準曲線，其中橫坐標表示起始拷貝數的對數，縱坐標表示Ct值，Ct值為每個反應中的熒光信號到達預設域值時經歷的循環數，根據標準曲線與待測樣本的曲線進行模板初濃度的測定；
[0014]C)根據標準曲線求取不同探針顯示的DNA初始反應拷貝數，求取每個探針的至少三個反應所得拷貝數的平均值，確定突變比例，該突變比例為陽性探針熒光顯示的拷貝數與兩種探針熒光顯示的拷貝數之和的比值；不同濃度的樣品測得的拷貝數不同，而同一樣品的突變比例是不變的，由此可確證樣本待檢測位點是否發生了突變。[0015]本發明的所述試劑盒具有以下有益效果:
[0016]1)本發明所述的試劑盒采用陽性探針和陰性探針組合使用，提高了對待檢測基因的靈敏度和準確率。
[0017]2)本發明所述的試劑盒將目前難以診斷的腰椎間盤退變檢測提高到新的水平，有利于進一步對該疾病進行早期診斷和患病風險的預測。
【具體實施方式】
[0018]實施例1 ADAMTS-5基因突變與LDD的相關性及引物開發
[0019]1.材料:489份彼此間無血緣關系的LDD患病和558份正常人的外周血，其中240位女性，249位男性，以及558個正常對照，分別為271位女性，287位男性的受測群體；提取外周血DNA，對群體的ADAMTS基因進行克隆。
[0020]2.方法:對群體的ADAMTS-5基因進行比對，挖掘SNP位點，利用置信區間模型的統計方法，對不同SNP位點進行群體分析，本發明選取ADAMTS-5的以下20個SNP位點為研究對象:rs229070 (SNPl)，rsl51065 (SNP2)，rs229079 (SNP3)，rs226794 (SNP4)，rs2830585 (SNP5)，rs2830586 (SNP6)，rsl62499 (SNP7)，rsl62495 (SNP8)，rsl62489 (SNP9)，rsl51058 (SNPlO), rs229052 (SNPll) , rs229054 (SNP12), rs9984329 (SNP13),rs2249350 (SNP14), rs233896 (SNP15)，rs162509 (SNP16)，rs162506 (SNP17)，rsl62502(SNP18), rs2132824(SNP19)和 rsl974415 (SNP20);其中 SNPl 和 SNP2 在 3，UTR區域，SNP5在外顯子區域，SNP19和SNP20在靠近5’區域，其他SNP位點都分布在內含子區域。
[0021]3、結果:
[0022]1)首先檢測本發明選擇ADAMTS-5的20個SNP位點與LDD的相關性，結果如表1所示:
[0023]表1 ADAMTS-5不同SNP位點與LDD關聯性分析
[0024]
【權利要求】
1.一種SNP位點在制備檢測腰椎間盤退變試劑盒中的應用，其特征在于，所述SNP位點為以下位點的一個或多個，其在GeneBank中的編號分別為:rsl51058、rs229052、rsl62502。
2.一種檢測ADAMTS-5基因SNP位點突變的特異性引物及特異性探針，其特征在于，所述的特異性物及特異性探針為3組，其中每組特異性引物包括上游引物和下游引物，特異性探針包括陽性探針和陰性探針； 其中第一組特異性引物及特異性探針分別為上游引物I其序列如序列表SEQ ID N0.1所示，下游引物2其序列如序列表SEQ ID N0.2所示，陽性特異性熒光探針3，其序列如序列表SEQ ID N0.3所示，陰性特異性熒光探針4，其序列如序列表SEQ ID N0.4所示； 其中第二組特異性物及特異性探針分別為上游引物5其序列如序列表SEQ ID N0.5所示，下游引物6其序列如序列表SEQ ID N0.6所示，陽性特異性熒光探針7，其序列如序列表SEQ ID N0.7所示，陰性特異性熒光探針8，其序列如序列表SEQ ID N0.8所示； 其中第三組特異性物及特異性探針分別為上游引物9其序列如序列表SEQ ID N0.9所示，下游引物10其序列如序列表SEQ ID N0.10所示，陽性特異性熒光探針11，其序列如序列表SEQ ID N0.11所示，陰性特異性熒光探針12，其序列如序列表SEQ ID N0.12所示。
3.根據權利要求2所述的檢測ADAMTS-5基因SNP位點突變的特異性引物及特異性探針，其特征在于，所述的陽性探針5’端標記VIC熒光，陰性探針5’端標記FAM熒光，陽性探針3’端和陰性探針3’端標有熒光淬滅基團BHQ-1 ;或者陰性探針5’端標記VIC熒光，陽性探針5’端標記FAM熒光，陽性探針3’端和陰性探針3’端標有熒光淬滅基團BHQ-1。
4.權利要求2或3中任意一項所述的檢測ADAMTS-5基因SNP位點突變的特異性引物及特異性探針，在制備檢測腰椎間盤退變試劑盒中的用途。.
5.—種檢測腰椎間盤退變的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于，所述試劑盒含有權利要求2所述的任意一組特異性物及特異性探針或其特異性物及特異性探針的組合。
6.根據權利要求5所述的一種檢測腰椎間盤退變的熒光定量PCR試劑盒，還包括:熒光定量PCR mix ;含ADAMTS-5基因rsl51058位點、rsl62502位點和rs229052的突變和未突變的DNA標準品。
7.一種檢測ADAMTS-5基因rsl51058位點、rs229052位點和/或rsl62502位點的方法，具體包括以下步驟: A)對基因組DNA待測樣品在相同反應條件下分別加入陽性或陰性探針進行PCR擴增，監測反應體系中熒光信號的變化。 B)根據濃度已知的標準樣品繪制標準曲線，其中橫坐標表示起始拷貝數的對數，縱坐標表示Ct值，Ct值為每個反應中的熒光信號到達預設域值時經歷的循環數，根據標準曲線與待測樣本的曲線進行模板初濃度的測定。 C)根據標準曲線求取不同探針顯示的DNA初始反應拷貝數，求取每個探針的至少三個反應所得拷貝數的平均值，確定突變比例，該突變比例為陽性探針熒光顯示的拷貝數與兩種探針熒光顯示的拷貝數之和的比值；不同濃度的樣品測得的拷貝數不同，而同一樣品的突變比例是不變的，由此可確證樣本待檢測位點是否發生了突變。
8.ADAMTS-5基因rsl51058位點、rs229052位點和rsl62502位點在制備檢測或治療腰椎間盤退變試劑中的用途。
【文檔編號】C12Q1/68GK103468822SQ201310456540
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月30日 優先權日:2013年9月30日
【發明者】吳南, 邱貴興, 吳志宏, 陳俊, 劉森, 劉嘉琦, 蘇新林, 趙珞 申請人:吳南