艾納香內根-貝殼杉烯合酶基因Bb-KS、其編碼蛋白質以及基因克隆方法
【專利摘要】艾納香內根-貝殼杉烯合酶基因Bb-KS、其編碼蛋白質以及基因克隆方法。本發明涉及一種艾納香內根-貝殼杉烯合酶基因Bb-KS，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1；一種艾納香內根-貝殼杉烯合酶基因Bb-KS編碼的蛋白質，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO:2；同時本發明還涉及RT-PCR和RACE技術相結合來用于克隆艾納香內根-貝殼杉烯合酶基因Bb-KS基因全長的方法。艾納香內根-貝殼杉烯合酶基因Bb-KS的大量表達，有助于提高艾納香的生物學產量，并同時提高植株有效成分內根-貝殼杉烯類化合物的含量，從而同時提高艾納香的產量和品質。
【專利說明】艾納香內根-貝殼杉烯合酶基因Bb-KS、其編碼蛋白質以及基因克隆方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因及其克隆方法，同時也涉及到基因編碼蛋白質，屬于生物【技術領域】，具體涉及一種艾納香內根-貝殼杉烯合酶基因Bb-KS、其編碼蛋白質以及基因克隆方法。
【背景技術】
[0002]艾納香(Blumea balsamifera L.DC.)為菊科艾納香屬多年生木質草本植物,主要分布于我國海南、貴州、廣西、廣東、云南、臺灣等省。以其全草或地上部分入藥，具有鎮痛、發汗、祛風除濕、去痰止咳、通經止血等功效，在黎族、苗族、壯族等少數民族地區有著悠久的用藥歷史，是一種重要的民間藥物。同時艾納香也是獲取天然冰片(艾片)的重要植物來源之一。并且，在精制艾片過程中所產生的艾油具有擴張血管、降低血壓、抑制交感神經的作用，因而被廣泛應用于醫藥行業。另外，艾油因其獨特的芳香氣味，還被廣泛應用于香料以及化妝品行業。雖然以艾納香為原材料的產品眾多，然而關于其化學成分的研究較少。
[0003]對于艾納香而言，其化學成分比較復雜，但具有藥理作用的主要集中在黃酮類和揮發油成分上。鄧芹英等(1996)，曹家慶等(2008)，陳銘等(2009)分別對艾納香中黃酮類成分進行了分析，主要含有艾納香素、木犀草素、槲皮素、兒茶素以及阿亞黃素等。關于艾納香揮發油成分的研究:周欣等(2001)、馬芝玉等(2009)采用GC/MS方法檢測到艾納香中揮發油成分主要為:L_龍腦、樟腦、β -石竹烯、芳樟醇、大葉香烯D、香木蘭烯、順-α-沒藥烯、β_蓽澄茄油烯、Y-依蘭油烯、ent-貝殼杉烯等萜類化合物。除此之外，艾納香中還含有多其他種化合物，如小麥黃素、芹菜素、原兒茶酸(甲酯)、咖啡酸(甲酯)、香草酸等化合物。其中，ent-貝殼杉烯類二萜化合物具有廣泛的生理活性，主要表現為抗腫瘤活性。由于ent-貝殼杉烯類化合物主`要來自于天然產物，化合物供應量非常有限。
[0004]內根-貝殼杉烯合酶(KS)是貝殼杉烯類化合物合成過程中的關鍵酶之一，也是合成赤霉素等信號分子的關鍵酶，對植物的生長發育起著至關重要的作用。目前在研究植物生長發育及抗性中涉及較多研究，而從植物次生代謝及產物藥理藥效活性方面研究較少。KS過去被稱為內根-貝殼杉烯合酶B，位于前質體，具有引導序列，與古巴焦磷酸合酶(Copalyl pyrophosphate synthase, CPS)共同催化物牛兒基物牛兒基焦磷酸(GGPP)形成內根-貝殼杉烯(ent-kaureneXKS最早是從南瓜未成熟的種子中得到的，其突變嚴重影響植株的發育。擬南芥中的GA2蛋白編碼KS基因，在擬南芥的研究中發現，ga2矮化突變體是由KS基因的功能缺失造成的，對突變體ga2-l的序列進行分析，發現其cDNA中單堿基發生突變導致終止密碼子提前出現，從而使得KS基因失活。目前，KS基因在擬南芥、蓖麻、甜葉菊、梨、蘋果等植物上成功克隆，但目前還沒有關于艾納香內根-貝殼杉烯合酶(KS)基因的相關報道。因此，對艾納香內根-貝殼杉烯合酶基因的克隆以及對他們的生物學功能研究，將有助于明確艾納香中二萜類次生代謝的分子機理，為調控其艾納香中有效成分等奠定基礎。
【發明內容】

[0005]鑒于上述問題，本發明的主要目的在于提供一種首次從艾納香種獲得的內根-貝殼杉烯合酶基因。
[0006]本發明的另一個目的是提供艾納香內根-貝殼杉烯合酶編碼的氨基酸序列及編碼蛋白質性質生物信息學預測。
[0007]同時，本發明還提供該艾納香內根-貝殼杉烯合酶基因的克隆方法。
[0008]為了達到上述目的，本發明提供:
[0009]本發明所提供的艾納香內根-貝殼杉烯合酶基因,從艾納香(Blumea balsamiferaDC)中克隆，命名為Bb-KS基因，核苷酸序列如SEQ ID NO:1。
[0010]上述艾納香內根-貝殼杉烯合酶基因編碼的蛋白質，命名為Bb-KS蛋白質，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2。
[0011]一種艾納香內根-貝殼杉烯合酶基因Bb-KS的克隆方法，包括如下步驟:
[0012](I)選用艾納香葉片作為試驗材料，采用TRNzol法提取總RNA ；
[0013](2)米用 TaKaRa 公司生產的 PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit 進行反轉錄獲得cDNA;
[0014](3)根據NCBI上其他植物KS基因保守區域，設計兼并引物PFl =TGGTCR(A\G)TTTGATCR(A\G)TATK(T\G)CAATC和
`[0015]PRl:TC K(T\G)CC ff(A\T)CCA CM(C\A)R(A\G)TTGAT GCAT GT ；
[0016](4) PCR產物回收后與pGEM-T easy Vector連接，連接產物轉化E.coli JM109感受態細胞，采用藍白斑篩選陽性克隆，篩選的陽性克隆經PCR進一步驗證后測序，獲得Bb-KS基因片段；
[0017](5)根據上述片段設計3’和5’末端快速擴增(RACE)引物；Bb_KS基因5’ RACE引物:GCAGCCAATGGATCTGATGATAC ;Bb_KS 基因 3’ RACE 引物:CGCAGCAACA GCAGCTGCTCTT ；
[0018](6)采用SMART? RACE Kit提供的反轉錄引物合成RACE第一鏈cDNA ；
[0019](7) 5，_&3，-RACE PCR 反應體系:TaKaRa Ex Taq(5U/μ 1)0.4 μ I, IOx Ex TaqBuffer(Mg2+plus)5 μ I, dNTP Mixture (各 2.5mmol/L)4 μ I, 3，-RACE-Ready cDNAlμ 1，GSP (10 μ mol/L) I μ 1，UPM(IOx) 5 μ 1，ddH20 補充至 50 μ I ；
[0020](8) PCR產物經檢測、回收、亞克隆和測序，獲得Bb-KS基因3’和5’末端序列，并進行拼接；
[0021](9)根據上述拼接序列，于Bb-KS基因開放閱讀框(ORF)兩端設計全長cDNA擴增引物:
[0022]Bb-KS5 ’端引物:CTCTGGTCATTTCTGAGCCAAGT
[0023]Bb-KS3 ’端引物:TTACCTTGTAATACATTAAAAAAT
[0024](IO)Bb-KS基因全長序列的克隆，其反應體系為:PCR反應總體積為50μ 1，1.5mmol/L MgCl2,4 種 dNTP 各 200ymol/L，引物各 150ng，1.5U Taq plus DNApolymerase (高保真)，IOOng cDNA。
[0025]本發明的有益效果是:
[0026]本發明涉及一種艾納香內根-貝殼杉烯合酶基因Bb-KS與編碼的蛋白質及其克隆方法。本發明采用RT-PCR與RACE技術相結合的方法，對艾納香種Bb-KS基因進行了研究，首次從艾納香葉片中克隆得到Bb-KS基因全長序列，并對其所編碼的氨基酸序列進行了分析，為進一步研究艾納香Bb-KS基因的表達、調控奠定了基礎，為Bb-KS基因參與植物的赤霉素調控途徑及艾納香揮發油組成及調控機制研究提供參考，同時也為菊科植物Bb-KS基因功能和進化研究提供了新的背景資料。
【具體實施方式】
[0027]以下通過【具體實施方式】的描述對本發明作進一步說明，但這并非是對本發明的限制，本領域技術人員根據本發明的基本思想，可以做出各種修改或改進，但是只要不脫離本發明的基本思想，均在本發明的范圍之內。
[0028]實施例1
[0029]本發明所提供的艾納香內根-貝殼杉烯合酶基因,從艾納香(Blumea balsamiferaDC)中克隆，命名為Bb-KS基因，核苷酸序列如SEQ ID NO:1。
[0030]上述艾納香內根-貝殼杉烯合酶基因編碼的蛋白質，命名為Bb-KS蛋白質，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2。
[0031]上述艾納香內根-貝殼杉烯合酶基因Bb-KS的克隆方及引物組，包括如下步驟:
[0032]步驟1:選用艾納香(Blumea balsamifera DC)葉片作為試驗材料,采用TRNzol法提取總RNA ；
[0033]步驟2:米用 TaKaRa公司生產的 PrimeScriptTMlst Strand cDNA Synthesis Kit進行反轉錄獲得cDNA;
[0034]步驟3:根據NCBI上其他植物KS基因保守區域，設計兼并引物PFl
【權利要求】
1.一種從艾納香種獲得的內根-貝殼杉烯合酶基因Bb-KS，其特征在于，其核苷酸序列如 SEQ ID NO:1 所示。
2.一種由權利要求1所述艾納香內根-貝殼杉烯合酶基因Bb-KS編碼的蛋白質，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
3.—種權利要求1所述艾納香內根-貝殼杉烯合酶基因Bb-KS的克隆方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)選用艾納香葉片作為試驗材料，采用TRNzol法提取總RNA； (2)米用TaKaRa 公司生產的 PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit 進行反轉錄獲得cDNA; (3)根據NCBI上其他植物KS基因保守區域，設計兼并引物
PFl =TGGTCR(A\G)TTTGATCR(A\G)TATK(T\G)CAATC 和
PRl:TC K (T\G) CC ff(A\T) CCA CM (C\A) R (A\G) TTGAT GCAT GT; (4)PCR產物回收后與pGEM-Teasy Vector連接，連接產物轉化E.coli JM109感受態細胞，采用藍白斑篩選陽性克隆，篩選的陽性克隆經PCR進一步驗證后測序，獲得Bb-KS基因片段； (5)根據上述片段設計3，和5，末端快速擴增(RACE)引物；Bb-KS基因5，RACE引物:GCAGCCAATGGATCTGATGATAC ;Bb-KS 基因 3’ RACE 引物:CGCAGCAACA GCAGCTGCTCTT ； (6)采用SMART?RACE K`it提供的反轉錄引物合成RACE第一鏈cDNA ； (7)5，_&3，-RACE PCR 反應體系:TaKaRa Ex Taq(5U/μ 1)0.4 μ I, IOx Ex TaqBuffer(Mg2+plus)5 μ I, dNTP Mixture (各 2.5mmol/L)4 μ I,3，-RACE-Ready cDNAlμ I,GSP(10ymol/L)ly 1，UPM(IOx) 5 μ 1，ddH20 補充至 50 μ I ； (8)PCR產物經檢測、回收、亞克隆和測序，獲得Bb-KS基因3’和5’末端序列，并進行拼接； (9)根據上述拼接序列，于Bb-KS基因開放閱讀框(ORF)兩端設計全長cDNA擴增引物: Bb-KS5’ 端引物:CTCTGGTCATTTCTGAGCCAAGT Bb-KS3’ 端引物:TTACCTTGTAATACATTAAAAAAT (10)Bb-KS基因全長序列的克隆，其反應體系為:PCR反應總體積為50μ 1，1.5mmol/LMgCl2,4 種 dNTP 各 200 μ mol/L,引物各 150ng, 1.5U Taq plus DNA polymerase (高保真)，IOOng cDNA。
【文檔編號】C12N15/10GK103525848SQ201310456535
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年9月30日 優先權日:2013年9月30日
【發明者】官玲亮, 龐玉新, 胡雄飛, 吳麗芬, 于福來, 張影波, 王丹, 韋睿斌, 陳振夏 申請人:中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所, 龐玉新