一種中華絨螯蟹性早熟個體活體分子檢測方法
【專利摘要】本發明公布了一種中華絨螯蟹性早熟個體活體分子檢測方法。利用本發明提供的引物組從中華絨螯蟹組織中克隆到了EsEcR基因全長cDNA序列，以此基因序列為基礎，本發明提供了一種檢測中華絨螯蟹性早熟個體活體分子檢測方法，本發明不僅提供了一種中華絨螯蟹性早熟個體的活體檢測方法，而且對中華絨螯蟹性早熟個體的早期發現提供了重要的檢測手段。
【專利說明】一種中華絨螯蟹性早熟個體活體分子檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于基因工程領域，特別涉及一種中華絨螯蟹EsEcR基因克隆方法及以EsEcR基因為基礎的中華絨螯蟹性早熟個體的活體分子檢測方法。
【背景技術】
[0002]中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)屬節肢動物門，甲殼綱,十足目，爬行亞目，短尾族，方蟹科，弓腿亞科，絨螫蟹屬，俗稱河蟹，廣泛分布于我國東南部沿海的咸淡水或淡水水域中，其肉質鮮美，風味獨特，河蟹是中國養殖產量最大的淡水蟹類。作為一種甲殼動物，河蟹的生長是通過蛻皮形式體現的。蛻皮即蛻去舊的外骨骼并長出新的外骨骼的過程，是甲殼動物最顯著的生理特征。河蟹性成熟對脫殼有抑制作用，也就不再生長，脫殼次數直接決定了河蟹個體的規格，大規格河蟹的經濟價值遠高于小規格河蟹，但目前在河蟹養殖生產中，普遍存在著有20%-30%的河蟹性早熟現象，早熟河蟹個體很小，性腺已經成熟不再脫殼，也即不再生長，商品價值極低。性腺成熟程度可以通過性腺成熟指數(gonadosomaticindex, GSI)直觀反應，要獲得性腺指數必須通過解剖稱重性腺，無法活體檢測。
[0003]ife兌皮激素受體(ecdysteroid receptor, ECR)是動物核受體(nuclear receptor)超家族成員之一，主要在無脊椎動物中發現。RXR具有重要的生物學功能，與維甲酸X受體(RXR, retinoid x receptor)作用形成異源二聚體，脫皮激素進入細胞內與之結合形成有功能的形式從而調控下游一系列蛻皮相關的基因的表達，最終觸發動物的蛻皮反應。RXR-ECR異源二聚體是甲殼類等蛻皮分子信號途徑必不可少的關鍵節點。
[0004]目前，有幾種奸蟹類EcR基因已被克隆，包括:Marsupenaeus japonicas、Fenneropenaeus chinensis>Crangon crangon等，而中華絨螯蟹的EcR基因(這里命名為:EsEcR)還未見報道。`
【發明內容】

[0005]本發明的目的在于為了克服現有技術的不足而提供一種中華絨螯蟹性早熟個體活體分子檢測方法。
[0006]我們利用RACE(rapid-amplification of cDNA ends)克隆技術克隆了中華絨螯蟹的EcR基因全長cDNA，通過定量PCR分析發現性早熟個體中EcR基因的表達量顯著低于正常個體，只有正常個體表達量的27% (P < 0.001)，該結果可應用于河蟹性早熟個體的活體分子檢測。
[0007]本發明是通過以下技術手段實現的:
[0008]一種中華絨螯蟹EsEcR基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所示。
[0009]一種用于PCR擴增以上所述的中華絨螯蟹EsEcR基因的引物組，由如下引物組成:
[0010]3'正向外引物3aEsEcR-Fl:序列如SEQ ID N0.3所示；
[0011]3'正向內引物3aEsEcR-F2:序列如SEQ ID N0.4所示；[0012] 5'反向外引物5aEsEcR-Rl:序列如SEQ ID N0.5所示；
[0013]5'反向內引物5aEsEcR_R2:序列如SEQ ID N0.6所示。
[0014]一種擴增以上所述的中華絨螯蟹EsEcR基因的方法，其特征在于，包括如下步驟:
[0015]步驟1:獲得中華絨螯蟹組織的總RNA ；
[0016]步驟2:從GenBank中華絨螯蟹核酸數據庫中篩選到一個EcR基因同源序列，作為中間序列，以此序列作為模板，設計擴增EsECR基因的3’和5’端片段的特異性引物組；
[0017]步驟3:以步驟I所得總RNA反轉錄產物為模板，分別以SEQ N0.3和4所示的引物、和SEQ N0.5和SEQ ID N0.6所示的引物對模板的3’端和5’端進行巢式兩輪PCR擴增，得到中華絨螯蟹EsEcR基因的3'和5'端片段；
[0018]步驟4:將步驟2中所述中間序列、步驟3中所述中華絨螯蟹EsEcR基因的3'和5'端片段拼接，即得擴增后的中華絨螯蟹EsEcR基因。
[0019]以上所述的擴增中華絨螯蟹EsEcR基因的方法，其中3’端和5’端進行巢式兩輪PCR 擴增的 3’端第一輪 PCR 擴增的條件為 94°C,3min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 2min，20 個循環；72°C, 1Omin ;4°C保存。
[0020]以上所述的擴增中華絨螯蟹EsEcR基因的方法，其中3’端和5’端進行巢式兩輪PCR 擴增的 3’端第二輪 PCR 擴增的條件為 94°C,3min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 2min，30 個循環；72°C, 1Omin。
[0021]以上所述的擴增中華絨螯蟹EsEcR基因的方法，其中3’端和5’端進行巢式兩輪PCR 擴增的 5’端第一輪 PCR 擴增的條件為 94°C,3min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 2min，20 個循環；72°C, IOmin ;4°C保存。
[0022]以上所述的擴增中華絨螯蟹EsEcR基因的方法，其中3’端和5’端進行巢式兩輪PCR 擴增的 5’端第二輪 PCR 擴增的條件為 94°C,3min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 2min，25 個循環；72°C, IOmin0
[0023]對所得序列用NCBI網站進行blastx在線分析,與EsEcR序列一致性(Sequencesproducing significant alignments)最高的前100個序列都是EcR的同源蛋白(e〈lX 10_144)，其中前16個序列分別來自于9種不同的蝦蟹類:Uca pugilator (召潮蟹)、Scylla paramamosain (擬穴青蟹)、Homarus americanus (美洲海鰲蟲下)、Callinectessapidus (藍蟹)、Portunus trituberculatus (三撫梭子蟹)、Crangon crangon (褐蟲下)、Gecarcinus lateralis (地蟹)Marsupenaeus japonicus (日本囊對蟲下)和 Carcinus maenas(普通濱蟹)的EcR (包括不同的可變剪切體)，顯著性檢驗達到極大(e=0)，可以確定所得序列為中華絨螯蟹EcR基因。中華絨螯蟹EsEcR基因推測的氨基酸序列具有典型的EcR核受體序列特征，包括N端DNA結合結構域(DNA binding domain, DBD), C端配體結合結構域(ligand binding domain, LBD)。
[0024]通過對中華絨螯蟹EsEcR，包括兩種可變剪切體EsEcR-L和EsEcR-S所編碼的氨基酸序列與其他物種EcR氨基酸序列利用Clustalxl.81軟件進行序列比對分析和使用MEGA3.1軟件構建NJ系統發育樹(如圖1)，由系統發育樹可見，甲殼類EcR聚類在一個大的分支上。
[0025]以克隆到的EsEcR基因序列為基礎，本發明還提供了一種用于PCR檢測以EsEcR基因為基礎的中華絨螯蟹性早熟個體的特定引物組，其由如下引物組成:[0026]正向引物preco-EsEcR-F:序列如 SEQ ID N0.7 所不；
[0027]反向引物preco-EsEcR-R:序列如 SEQ ID N0.8 所不。
[0028]以克隆到的EsEcR基因序列為基礎，本發明還提供了一種以EsEcR基因為基礎的中華絨螯蟹性早熟個體的活體分子檢測方法，包括如下步驟:
[0029]步驟1:獲得中華絨螯蟹幼蟹肌肉組織的總RNA并反轉錄；
[0030]步驟2:以步驟I所得總反轉錄產物為模板，以如上所述的特定引物組為引物，通過定量PCR擴增獲得EsEcR基因的相對表達水平；
[0031]步驟3:以性腺成熟指數小于1%的中華絨螯蟹蟹個體為正常個體，當檢測個體EsEcR基因表達水平低于正常個體50%時，確定為中華絨螯蟹性早熟個體。
[0032]本發明利用逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、嵌套聚合酶鏈式反應(nested-PCR)、3 '端 cDNA 快速擴增(3 ' RACE)以及 5 '端 cDNA 快速擴增(5 ' RACE)的方法，對中華絨螯蟹EsEcR基因進行了研究，首次從中華絨螯蟹中克隆到了 EsEcR基因全長cDNA序列，并對其所編碼的EsEcR的序列特征、同源性及進化地位進行了分析，確定其為EsEcR 基因。、
[0033]以獲得的EsEcR基因為基礎，用定量PCR方法研究了性早熟個體和正常個體EsEcR基因表達水平的差異，發現性早熟個體中EcR基因的表達量顯著低于正常個體，只有正常個體表達量的27%(p < 0.001)，以該結果為基礎建立了一種河蟹性早熟個體的活體分子檢測方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
`[0034]圖1是不同種類的動物EcR核受體的NJ系統進化樹；
[0035]圖2是中華絨螯蟹性早熟個體與正常個體EsEcR基因表達水平的差異。
【具體實施方式】
[0036]下面結合實施例，進一步闡述本發明。
[0037]本發明中中華絨螯蟹由無錫太湖漁民提供，試劑均可由市場購得，RNA純化等試劑購自美國Promega公司等，3' RACE和V RACE試劑盒購自寶生物(大連)有限公司(Takara)0
[0038]擴增中華絨螯蟹EsEcR基因的方法，包括如下步驟:
[0039]( I)總 RNA 提取:
[0040]取IOOmg中華絨螯蟹組織在研缽中加液氮研磨,用Trizol法提取總RNA, Trizol試劑采用Invitrogen公司，提取方法根據使用說明書。
[0041](2)中華絨螯蟹EsEcR基因全長cDNA序列的克隆:
[0042]從GenBank中華絨螯蟹核酸數據庫中篩選到一個217bp的EcR基因同源序列(GenBank accession number: JR736395.1),以此序列作為中間序列，設計擴增EsEcR基因的3'端和5'端片段的特異性引物組，用于3'端和5'端快速擴增:
[0043](a)EsEcR基因cDNA3/端快速擴增(3/ RACE):
[0044]根據EsEcR基因部分序列，設計特異性3'正向外引物3aEsEcR_Fl和3'正向內引物3aEsEcR-F2，其中，3'正向外引物3aEsEcR-Fl與3' RACE試劑盒中提供的3' RACEOuter Primer組成引物對進行第一輪PCR擴增，對擴增產物用3'正向內引物3aEsEcR_F2和:V RACE Inner Primer進行第二輪PCR擴增，獲得中華絨螯蟹EsEcR基因的3’端片段；
[0045]3aEsEcR-Fl:5/ TTCTTTGATATTGCACCACATTTTAG3' (SEQ ID N0.3)
[0046]3aEsEcR-F2:5/ GTAACTACGGTGCCGACTCCTAC3' (SEQ ID N0.4)
[0047]3' RACE Outer Primer:5/ TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT3' (SEQ ID N0.9)
[0048]3 ' RACE Inner Primer:5 ' CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG3 ' (SEQIDN0.10)
[0049](b)反轉錄:
[0050]按照3' RACE試劑盒中的使用說明書進行，獲得3'反轉錄液，反應體系如下:
[0051]
Total RNAI μ§
3fRACE Adaptor (5 μΜ)I μL
5XM-M LV Buffer2 pL
dNTP Mixture (10 mM each)I μ?
RNase Inhibitor (40 U/pL)0.25 μ?
Reverse Transcriptasc M-MLV (RNase H-) (200 U/pL)0.25 |iL
RNasc Free dH20up 1 10 μ?
[0052]反應條件為:42°C，60min；70°C，15min ；-20°C，保存。
[0053]第一輪PCR:
[0054]擴增反應體系如下:
[0055]
3*反料?液0.6μΙ.1xcDNADilLilion EiuiTcrII2.4uL
3aEsEcR-Fl (10 μΜ)0.6μΙ
3,RACE Outer Primer (10 μΜ)0.6μ?
IOxLA PCR Buffer II (Mg2— Free)1.2μ?
MgCl2 (25 mM)0.9μ￡
TaKaRa LA Taq (5 U/pL)0.1 μΕ
dH?0up to 15pL
[0056]第一輪PCR 反應條件為:94°C，3min ；94°C 30s，55°C 30s, 72 °C 2min，20 個循環；72°C, IOmin ;4°C保存。
[0057]第二輪 PCR:
[0058]擴增反應體系如下:[0059]
【權利要求】
1.一種中華絨螯蟹EsEcR基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1或SEQ IDN0.2所示。
2.一種用于PCR擴增如權利要求1所述的中華絨螯蟹EsEcR基因的引物組，其特征在于，由如下引物組成: 3'正向外引物3aEsEcR-Fl:序列如SEQ ID N0.3所示； 3'正向內引物3aEsEcR-F2:序列如SEQ ID N0.4所示； 5'反向外引物5aEsEcR-Rl:序列如SEQ ID N0.5所示； 5'反向內引物5aEsEcR-R2:序列如SEQ ID N0.6所示。
3.一種擴增如權利要求1所述的中華絨螯蟹EsEcR基因的方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟1:獲得中華絨螯蟹組織的總RNA ； 步驟2:從GenBank中華絨螯蟹核酸數據庫中篩選到一個EcR基因同源序列，作為中間序列，以此序列作為模板，設計擴增EsECR基因的3’和5’端片段的特異性引物組； 步驟3:以步驟I所得總RNA反轉錄產物為模板，分別以SEQ N0.3和4所示的引物、和SEQ N0.5和SEQ ID N0.6所示的引物對模板的3’端和5’端進行巢式兩輪PCR擴增，得到中華絨螯蟹EsEcR基因的3'和5'端片段； 步驟4:將步驟2中所述中間序列、步驟3中所述中華絨螯蟹EsEcR基因的3'和5'端片段拼接，即得擴增后的中華絨螯蟹EsEcR基因。
4.根據權利要求3所述的擴增`中華絨螯蟹EsEcR基因的方法，其特征在于，3’端和5’端進行巢式兩輪PCR擴增的3’端第一輪PCR擴增的條件為94°C，3min ；94°C 30s, 55°C30s, 72°C 2min，20 個循環；72°C，10 min ;4°C保存。
5.根據權利要求3所述的擴增中華絨螯蟹EsEcR基因的方法，其特征在于，3’端和5’端進行巢式兩輪PCR擴增的3’端第二輪PCR擴增的條件為94°C，3min ；94°C 30s, 55°C30s, 72°C 2min，30 個循環；72°C，10 min。
6.根據權利要求3所述的擴增中華絨螯蟹EsEcR基因的方法，其特征在于，3’端和5’端進行巢式兩輪PCR擴增的5’端第一輪PCR擴增的條件為94°C，3 min ；94°C 3 Os, 55°C30s, 72°C 2min，20 個循環；72°C，10 min ;4°C保存。
7.根據權利要求3所述的擴增中華絨螯蟹EsEcR基因的方法，其特征在于，3’端和5’端進行巢式兩輪PCR擴增的5’端第二輪PCR擴增的條件為94°C，3min ；94°C 30s, 55°C30s, 72°C 2min，25 個循環；72°C，10 min。
8.一種用于PCR檢測以EsEcR基因為基礎的中華絨螯蟹性早熟個體的特定引物組，其特征在于，其由如下引物組成: 正向引物preco-EsEcR-F:序列如SEQ ID N0.7所示； 反向引物preco-EsEcR-R:序列如SEQ ID N0.8所示。
9.一種以EsEcR基因為基礎的中華絨螯蟹性早熟個體的活體分子檢測方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟1:獲得中華絨螯蟹幼蟹肌肉組織的總RNA并反轉錄； 步驟2:以步驟I所得總反轉錄產物為模板，以如權利要求8所述的特定引物組為引物，通過定量PCR擴增獲得EsEcR基因的相對表達水平；步驟3:以性腺成熟指數小于1%的中華絨螯蟹蟹個體為正常個體，當檢測個體EsEcR基因表達水平低于正常個體50`%時，確定為中華絨螯蟹性早熟個體。
【文檔編號】C12N15/12GK103555727SQ201310478940
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月14日 優先權日:2013年10月14日
【發明者】沈懷舜, 周鑫 申請人:中國水產科學研究院淡水漁業研究中心