尿激酶型纖溶酶原激活劑轉基因小鼠的制作方法
【專利摘要】本發明提供雖然以雜合體型具有uPA基因，但是對來源于小鼠的肝細胞的損傷度高的肝損傷小鼠及其高效的制作方法。以雜合體型具有uPA基因的肝損傷小鼠的制作方法，包括以下工序：(i)利用DNA片段轉化小鼠ES細胞的工序，所述DNA片段含有肝特異性啟動子/增強子以及在它們的控制下可驅動地被連接的編碼尿激酶型纖溶酶原激活劑的cDNA；(ii)將工序(i)得到的轉化了的小鼠ES細胞注入宿主胚胎的工序；(iii)將工序(ii)得到的注入了ES細胞的宿主胚胎移植到代孕母小鼠的子宮獲得嵌合體小鼠的工序；以及(iv)將工序(iii)得到的嵌合體小鼠交配，得到以雜合體型導入了該DNA片段的轉基因小鼠的工序。
【專利說明】尿激酶型纖溶酶原激活劑轉基因小鼠
【技術領域】
[0001] 本發明涉及將含有肝特異性啟動子/增強子和在它們的控制下可驅動地被連接 的編碼尿激酶型纖溶酶原激活劑的cDNA的DNA片段導入ES細胞并使用該ES細胞制作的 以雜合體型導入該DNA片段的肝損傷小鼠。
【背景技術】
[0002] 通常，在人疾病的研究中期望使用人的細胞進行實驗。特別是，在確認物種特異性 的多個藥物代謝酶、宿主局限于人的病毒等所參與的疾病的研究中，需要使用人細胞，特別 是人肝細胞。但是，人肝細胞的供給受到限制，維持人肝細胞的分化狀態的狀態下在體外 (in vitro)進行增殖是非常困難的。對于人肝細胞的增殖，利用生物體內的環境是比較高 效的。即，嘗試通過將人肝細胞移植到對以免疫缺陷化的小鼠作為遺傳背景的小鼠導入促 進小鼠肝細胞死亡的基因而成的轉基因小鼠，使人肝細胞增殖，從而大量地將小鼠肝細胞 置換為人肝細胞。
[0003] 病毒對人的肝臟感染所引起的肝疾病是近年來醫療領域所面對的難以治療的疾 病之一。對這些感染人肝細胞的病毒具有感受性的動物種類局限于人、猩猩。為了開發針 對這些病毒感染的治療藥，需要使用人的肝細胞的試驗。另外，也認為肝細胞對藥物代謝發 揮重要的作用，各個藥物在人體中的代謝途徑的闡明與新的醫藥品的開發相關。但是，很多 的藥物代謝酶存在物種特異性，為了闡明人體中的藥物代謝途徑，需要使用人肝細胞進行 試驗。
[0004] 對于丙型肝炎病毒（HCV)，據推測在日本丙型肝炎病毒的持續感染者（HCV攜帶 者）有約150萬人，除此以外約40-50萬人正在接受治療，據說接受干擾素給藥的丙型慢性 肝炎的患者一年有3-4萬人。最近，將病毒基因組的各種部位作為靶標的新的抗病毒藥正 在開發中，但是，由于沒有可信性、再現性高的HCV用動物模型，因此其進展受到很大阻礙。 這并不局限于HCV，也可以說乙型肝炎病毒（HBV)等其它病毒性肝炎也是同樣的。由于這些 病毒僅以人和猩猩作為宿主，因此在使用動物的大規模抗病毒藥的開發研究中，人肝細胞 與宿主肝細胞置換的小型模型動物的開發受到期待。
[0005] 脂肪肝是以中性脂肪向肝臟的蓄積為原因而發病，但是，近年來通過脂肪在肝臟 中蓄積而引起的肝炎，即非酒精性脂肪性肝炎（NASH :Non_alcoholic steatohepatitis) 增加，這一疾病是有可能發展為慢性肝炎、肝硬化、肝細胞癌等預后不良疾病的疾病。另一 方面，指出不存在對這樣的肝疾病有效的治療藥（非專利文獻1)。在這一治療藥開發中也 需要最合適的動物模型的存在。
[0006] 對于以上的疾病研究，如果能夠利用置換為人肝細胞的模型動物，則有助于很多 藥物開發研究。但是，對于該模型動物的制作而言，將人肝細胞移植到作為宿主的動物之 后，需要人肝細胞高效地增殖，與宿主的肝細胞進行置換。
[0007] 目前為止，通過使尿激酶型纖溶酶原激活劑（以下簡稱"uPA"）基因肝臟特異性 表達，制作了若干對小鼠肝細胞造成損傷的轉基因小鼠，報告了若干對該小鼠移植人肝細 胞的例子。報告了使用uPA基因組序列制作的uPA轉基因小鼠（非專利文獻2)、使用uPA 的cDNA制作的uPA轉基因小鼠（非專利文獻3)。這些uPA轉基因小鼠均以雜合體型具有 uPA基因的情況下，被移植的人肝細胞生存是困難的，因此需要以純合體型具有uPA基因。 但是，為了制作以純合體型具有uPA基因的轉基因小鼠，需要至少2代，最短也需要6個月， 而且相對得到的小鼠的總數，僅能以約25%的比例得到純合體型小鼠，在短時間內制作大 量的以純合體型具有uPA基因的轉基因小鼠是困難的。另外，基于同樣的理由，制作與其它 的轉基因小鼠的雜交系是困難的。而且，以往使用uPA基因組序列的轉基因小鼠隨著時間 的經過，肝臟中導入的uPA基因發生重組，觀察到uPA基因的脫落，uPA基因脫落的小鼠細 胞再生為二次肝細胞，因此即使將人肝細胞移植入雜合體型小鼠，生存也是困難的。此外， 即使是純合體型，也頻繁發現由于uPA基因的脫落所致的小鼠肝細胞的再生而引起生存的 人肝細胞漸漸減少的小鼠。在本領域期望能夠高效地大量生產的以及能夠容易制作與其它 轉基因小鼠的雜交系的uPA轉基因小鼠。
[0008] 現有技術文獻
[0009] 非專利文獻
[0010] 非專利文獻 1:N Engl J Med. 346 :1221-31(2002)
[0011] 非專利文獻 2:Cell66 :245-256(1991)
[0012] 非專利文獻 3:BBRC377 :248-252(2008)
【發明內容】
[0013] 本發明提供雖然以雜合體型具有uPA基因，但是對來源于小鼠的肝細胞的損傷度 高的肝損傷小鼠及其高效的制作方法。
[0014] 本發明人等為了解決上述課題進行銳意研究，結果發現將可驅動地連接有肝特異 性啟動子/增強子和在它們的控制下編碼尿激酶型纖溶酶原激活劑的CDNA的DNA片段導 入小鼠 ES細胞，通過利用該ES細胞，能夠高效制作雖然以雜合體型具有uPA基因但是對來 源于小鼠的肝細胞的損傷度高的轉基因小鼠。另外，發現該轉基因小鼠中，即使經過時間， 導入的uPA基因也不發生或基本不發生脫落。
[0015] 進而發現，使用該轉基因小鼠制作的免疫缺陷肝損傷小鼠，能夠使移植的人肝細 胞生存。
[0016] 本發明是基于這些發現的發明。
[0017] gp，本發明包含以下內容。
[0018] [1] 一種以雜合體型具有UPA基因的肝損傷小鼠的制作方法，其具有以下工序：
[0019] (i)利用DNA片段轉化小鼠 ES細胞的工序，所述DNA片段含有肝特異性啟動子/ 增強子和在它們的控制下可驅動地被連接的編碼尿激酶型纖溶酶原激活劑的cDNA ;
[0020] (ii)將工序⑴得到的轉化了的小鼠 ES細胞注入宿主胚胎的工序；
[0021] (iii)將工序（ii)得到的注入了 ES細胞的宿主胚胎移植到代孕母小鼠的子宮獲 得嵌合體小鼠的工序；以及
[0022] (iv)將工序（iii)得到的嵌合體小鼠交配，得到以雜合體型導入該DNA片段的轉 基因小鼠的工序。
[0023] [2]根據[1]所述的方法，進一步具有（V)獲得2?3周齡的血清ALT值是 30 (Karmen單位）以上的轉基因小鼠的工序。
[0024] [3]根據[1]或[2]所述的方法，其中，肝特異性啟動子是白蛋白啟動子。
[0025] [4]利用[1]?[3]的方法制作的肝損傷小鼠及其一部分。
[0026] [5] -種免疫缺陷肝損傷小鼠，是通過將[4]所述的肝損傷小鼠與SCID小鼠交配 而得到的。
[0027] [6] -種嵌合體小鼠的制作方法，其特征在于，包括將人肝細胞移植到[5]所述的 免疫缺陷肝損傷小鼠，該嵌合體小鼠具有含有人肝細胞的嵌合體肝。
[0028] [7] -種嵌合體小鼠，其特征在于，具有利用[6]所述的方法制作的含有人肝細胞 的嵌合體肝。
[0029] [8] -種嵌合體小鼠，其特征在于，其免疫缺陷，以雜合體型具有DNA片段，且具有 含有人肝細胞的嵌合體肝，所述DNA片段含有肝特異性啟動子/增強子以及在它們的控制 下可驅動地被連接的編碼尿激酶型纖溶酶原激活劑的cDNA。
[0030] [9]根據[7]或[8]所述的嵌合體小鼠，其中，人肝細胞占嵌合體肝的肝細胞的至 少 10%。
[0031] [10]根據[7]或[8]所述的嵌合體小鼠，其中，人肝細胞在嵌合體肝中保持其功能 和特性至少2周以上。
[0032] [11] -種對人肝功能產生影響的物質的篩選方法，具有以下的（a)?（C)工序：
[0033] (a)將被檢物質給予到[7]?[10]中任一項所述的嵌合體小鼠的工序；
[0034] (b)對在（a)中給予了該被檢物質的該嵌合體小鼠的選自人白蛋白濃度、體重曲 線、肝重量體重比、總白蛋白值、總蛋白值、ALT值、AST值和總膽紅素值中的一個以上進行 測定的工序；以及
[0035] (c)與未給予該被檢物質的該嵌合體小鼠的人白蛋白濃度、體重曲線、肝重量體重 比、總白蛋白值、總蛋白值、ALT值、AST值、和總膽紅素值進行比較，選擇（b)中測定的人白 蛋白濃度、體重曲線、肝重量體重比、總白蛋白值、總蛋白值、ALT值、AST值和總膽紅素值中 的任意一個以上產生增減的被檢物質的工序。
[0036] [12] -種評價被檢物質對人肝細胞的毒性的方法，具有以下的（a)?（C)工序：
[0037] (a)將被檢物質給予到[7]?[10]中任一項所述的嵌合體小鼠的工序；
[0038] (b)對在（a)中給予了該被檢物質的該嵌合體小鼠的選自人白蛋白濃度、體重曲 線、肝重量體重比、總白蛋白值、總蛋白值、ALT值、AST值和總膽紅素值中的一個以上進行 測定的工序；以及
[0039] (C)與未給予該被檢物質的該嵌合體小鼠的人白蛋白濃度、體重曲線、肝重量體重 t匕、總白蛋白值、總蛋白值、ALT值、AST值和總膽紅素值進行比較，將（b)中測定的人白蛋白 濃度、體重曲線、肝重量體重比、總白蛋白值、總蛋白值、ALT值、AST值和總膽紅素值中的任 意一個以上的增減作為指標，評價該被檢物質對人肝細胞的影響的工序。
[0040] [13] -種對病毒性肝炎的治療有效的物質的篩選方法，具有以下的（a)?（d)工 序：
[0041] (a)對[7]?[10]中任一項所述的嵌合體小鼠接種肝炎病毒的工序；
[0042] (b)對在（a)中接種了肝炎病毒的該嵌合體小鼠給予被檢物質的工序；
[0043] (C)對在（b)中給予了被檢物質的該嵌合體小鼠的選自人白蛋白濃度、體重曲線、 肝重量體重比、總白蛋白值、總蛋白值、ALT值、AST值、總膽紅素值、病毒量和來源于病毒的 蛋白質量中的一個以上進行測定的工序；以及
[0044] (d)與未給予該被檢物質的該嵌合體小鼠的人白蛋白濃度、體重曲線、肝重量體重 t匕、總白蛋白值、總蛋白值、ALT值、AST值、總膽紅素值、病毒量和來源于病毒蛋白質量進 行比較，選擇在（c)中測定的人白蛋白濃度、體重曲線、肝重量體重比、總白蛋白值、總蛋白 值、ALT值、AST值、總膽紅素值、病毒量和來源于病毒的蛋白質量中的任意一個以上產生變 化的被檢物質的工序。
[0045] [14]根據[13]所述的方法，其中，肝炎病毒是甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型 肝炎病毒、丁型肝炎病毒或戊型肝炎病毒。
[0046] 本說明書包含作為本申請優先權基礎的日本國專利申請2012-102814號的說明 書和/或附圖記載的內容。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0047] 圖1是表示受精卵用的uPA基因插入用載體"mAlb uPAInt2"的示意圖。SV40pA : SV40polyA信號；mAlbPro/En :小鼠白蛋白的增強子/啟動子；uPAcDNA :小鼠 uPA的ORF部 分；exon-intron-exon :兔β球蛋白的第2外顯子、內含子、第3外顯子；polyA+約50bp : 兔β球蛋白的第3外顯子中的polyA信號。
[0048] 圖2是表示ES細胞用的uPA基因插入用載體"mAlb uPAInt2ES"的示意圖。 SV40pA :SV40polyA信號；mAlbPro/En :小鼠白蛋白的增強子/啟動子；uPAcDNA :小鼠 uPA 的ORF部分；exon-intron-exon:兔β球蛋白的第2外顯子、內含子、第3外顯子；polyA+ 約50bp :兔β球蛋白的第3外顯子中的polyA信號。
[0049] 圖3表示介由ES細胞制作的uPA轉基因小鼠中的ALT值等的測定結果。
[0050] 圖4表示向#1C2小鼠移植人肝細胞后14周齡前的小鼠血中人白蛋白濃度（上） 和體重（下）的測定結果。實線表示純合小鼠，點線表示雜合小鼠。
[0051] 圖5表示向#2C7小鼠移植人肝細胞后14周齡前的小鼠血中人白蛋白濃度（上） 和體重（下）的測定結果。實線表示純合小鼠，點線表示雜合小鼠。
[0052] 圖6表示使用#1C2純合小鼠、雜合小鼠、#2C7純合小鼠制作的嵌合體小鼠肝臟切 片的利用人細胞角蛋白8/18抗體的免疫染色照片。
[0053] 圖7表示使用14周齡（上）和30周齡（下）的#1C2純合小鼠、雜合小鼠、#2C7 純合小鼠制作的嵌合體小鼠肝臟的置換率和小鼠血中人白蛋白濃度的測定結果。
[0054] 圖8-1表示使用#1C2純合小鼠、雜合小鼠制作的嵌合體小鼠的、接種HCV前的小 鼠血中人白蛋白濃度（左）和接種后的小鼠血清中各病毒的拷貝數（右）。實線表示純合 小鼠，點線表示雜合小鼠。
[0055] 圖8-2表示使用#1C2純合小鼠、雜合小鼠制作的嵌合體小鼠的、接種HBV前的小 鼠血中人白蛋白濃度（左）和接種后的小鼠血清中各病毒的拷貝數（右）。實線表示純合 小鼠，點線表示雜合小鼠。
[0056] 圖9-1表示使用#2C7純合小鼠制作的嵌合體小鼠的、接種HCV前的小鼠血中人白 蛋白濃度（左）和接種后的小鼠血清中HCV拷貝數（右）。
[0057] 圖9-2表示使用#2C7純合小鼠制作的嵌合體小鼠的、接種HBV前的小鼠血中人白 蛋白濃度（左）和接種后的小鼠血清中HBV拷貝數（右）。
[0058] 圖10表示向#1C2小鼠移植人肝細胞后30周齡前的小鼠血中人白蛋白濃度（上） 和體重（下）的測定結果。實線表示純合小鼠，點線表示雜合小鼠。
[0059] 圖11表示向#2C7小鼠移植人肝細胞后30周齡前的小鼠血中人白蛋白濃度（上） 和體重（下）的測定結果。實線表示純合小鼠，點線表示雜合小鼠。
【具體實施方式】
[0060] 以下，對本發明做詳細說明。
[0061] 本發明的肝損傷小鼠，以雜合體型具有DNA片段，該DNA片段含有肝特異性啟動子 /增強子和在它們的控制下可驅動地被連接的編碼尿激酶型纖溶酶原激活劑的cDNA，由此 uPA被肝臟特異性表達，來源于小鼠的肝臟細胞（特別是肝細胞）至少20%、至少30%、至 少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或其以上受到損 傷，增殖被抑制和/或發生壞死。
[0062] 本發明的肝損傷小鼠雖然以雜合體型具有UPA基因，但是對來源于小鼠的肝細胞 的損傷度高，與已有公知的uPA轉基因小鼠不同，可以不以純合體型具有uPA基因。
[0063] 本發明的肝損傷小鼠，按照已有公知的轉基因動物的制作方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA77 :7380-7384(1980))，將含有肝特異性啟動子/增強子和在它們的控制下可驅動 地被連接的編碼uPA的cDNA的DNA片段導入小鼠 ES細胞，使用得到的ES細胞而能夠制作。
[0064] "啟動子/增強子"是指具有能夠提供啟動子和增強子兩種功能的序列的DNA。
[0065] 作為"肝特異性啟動子"，只要能夠肝臟特異性誘導與其3'端連接的基因的表達即 可，沒有特別限制，例如可舉出白蛋白啟動子、α-胎蛋白啟動子、α 1-抗胰蛋白酶啟動子、 轉鐵蛋白轉甲狀腺素蛋白啟動子、血清淀粉樣蛋白A啟動子、轉甲狀腺素蛋白啟動子、肝細 胞核因子6 (HNF-6)啟動子等。優選為白蛋白啟動子。
[0066] "肝特異性啟動子/增強子"能夠肝臟特異性表達目的基因即可，可以是內源性、 外源性、同種、異種、人工的任意一個啟動子，優選使用來源于小鼠的肝特異性啟動子/增 強子。來源于小鼠的肝特異性啟動子/增強子在本領域是公知的，例如可以利用白蛋白啟 動子/增強子。來源于小鼠的白蛋白啟動子/增強子是公知的（Herbst RS et al，Proc Natl Acad Sci USA. 1989Mar ；86(5) :1553-7 ；Heckel JL et al. , Celll990Augl0 ；62(3)： 447-56)，通過進行對該白蛋白啟動子/增強子使用特異性引物，以小鼠基因組文庫作為模 板的PCR而能夠得到。
[0067] 編碼uPA的cDNA，可以是內源性、外源性、同種、異種的任意一個，優選使用來源于 小鼠的編碼uPA的cDNA。編碼uPA的cDNA，通過本領域技術人員公知的常用的方法就能夠 得到，即，通過以從肝臟提取的RNA為模板，對編碼uPA的基因使用特異性引物進行逆轉錄 PCR就能夠得到。編碼uPA的基因，在上述公開的數據庫中以登錄號：NM008873被登錄，本 發明中可以利用該基因信息（本說明書中，記載了編碼uPA的基因作為序列號11)。應予說 明，本說明書中，關于本發明而記載的uPA基因是指編碼uPA的cDNA，這些術語可以相互交 換使用。
[0068] "肝特異性啟動子/增強子和在它們的控制下可驅動地被連接的編碼uPA的cDNA" 是指肝特異性啟動子/增強子和以在它們的控制下uPA被表達的方式配置編碼uPA的 cDNA。
[0069] 將含有肝特異性啟動子/增強子和在它們的控制下可驅動地被連接的編碼uPA的 cDNA的DNA片段導入ES細胞（胚胎干細胞）。
[0070] DNA片段導入ES細胞的方法，可以通過磷酸鈣法、電脈沖法、脂轉染法、凝集法、微 注射法、粒子槍法、DEAE-葡聚糖法等（不受這些方法的限制）進行。
[0071] 導入了 DNA片段的ES細胞能夠在體外培養，由此能夠篩選出導入成功的和/或導 入的DNA片段不脫落的細胞。接下來，將得到的ES細胞注入宿主胚胎、優選小鼠胚泡，然 后，移植到代孕母小鼠的子宮角，通過使其發育從而誕生轉基因小鼠（嵌合體小鼠）。代孕 母小鼠，通常利用與切斷輸精管的雄鼠交配并處于假妊娠狀態的雌鼠。
[0072] 在確認出生的轉基因小鼠（嵌合體小鼠）引入上述DNA片段的基礎上，為了 Fl小 鼠的誕生，使其與野生型小鼠交配。該交配的結果為，在誕生的Fl小鼠中，體細胞中具有上 述DNA片段的小鼠（雜合體型）是能將上述DNA片段傳給生殖細胞的轉基因小鼠。
[0073] 本發明的肝損傷小鼠只要是導入的上述DNA片段是雜合體型，則可以是上述轉基 因小鼠的任意一個代小鼠。雜合體型的選擇，例如，將從Fl小鼠尾部分離提取的染色體DNA 利用Southern Hybridization或PCR法進行篩選從而能夠檢測。
[0074] 而且，對于得到的轉基因小鼠，選擇血清ALT (丙氨酸氨基轉移酶）值在2?3周齡 是30 (Karmen單位）以上的小鼠。優選在3周齡或4周齡血清ALT值為30 (Karmen單位） 以上的小鼠，進一步優選在6周齡血清ALT值為45、50或55 (Karmen單位）以上的小鼠，特 別優選在8周齡血清ALT值為60、65、或70 (Karmen單位）以上的小鼠。血清ALT值成為肝 損傷程度的指標，該值越高表示肝損傷程度越高。
[0075] 本發明的肝損傷小鼠制作中使用的上述ES細胞、胚泡，沒有特別限制，能夠利用 來源于各種小鼠系統的細胞，例如，能夠利用來源于129SvEv小鼠、C57BL/6J小鼠等的細 胞。
[0076] 根據本發明的肝損傷小鼠的制作方法，由于能夠以雜合體型具有導入基因，因此 能夠高效地大量制作該轉基因小鼠，雖然得到的轉基因小鼠以雜合體型具有UPA基因，但 是通過篩選肝損傷度高的小鼠，能夠高效選擇?制作期望的轉基因小鼠。
[0077] 另外，由于本發明的肝損傷小鼠能夠以雜合體型具有UPA基因，因此與以純合體 型具有uPA基因的已有轉基因小鼠相比，小鼠的生產率高。即，為了得到大量純合體型小 鼠，首先一度需要大量生產雜合體型雌小鼠。然后，需要通過該雜合體型小鼠之間的體外受 精、自然交配來獲得純合體型小鼠，這一過程需要2代，最短也要6個月。而且相對于得到的 小鼠總數，僅以約25%的比例得到純合體型小鼠。與此相對，雜合體型小鼠與由飼養員多次 購入的野生型小鼠進行體外受精或自然交配，在次代（1代）中得到大量雜合體型小鼠。這 一過程需要的時間最短是3個月。而且，其中得到的小鼠總數的約50%是雜合體型小鼠，其 能夠在短時間內高率地大量生產必要的小鼠。另外，使用與其它基因突變小鼠（基因缺失、 導入的基因等）的雜交系進行實驗時，在能夠使用雜合體型uPA轉基因小鼠的情況下，能夠 高效得到可用于實驗的小鼠。例如，使用導入的uPA基因是雜合體型且另1種基因突變也 是雜合體型的小鼠彼此，生產該uPA基因和另1種基因突變兩者是純合體型小鼠的情況下， 得到兩基因是純合體型小鼠的比例只不過是得到的小鼠中的約6%，而且，為了得到實驗中 使用的總計數量的小鼠，在得到雌雄純合體型小鼠的基礎上，有必要進行繁殖、生產。另一 方面，得到uPA基因是雜合體型且另1種基因突變是純合體型的小鼠的比例為約12. 5%，與 制作兩基因為純合體型的小鼠相比能夠以高的制作效率在該時刻得到實驗必要的小鼠。這 比制作兩基因是純合體型的小鼠早1代，得到僅供實驗中使用的總計數量的小鼠。如上文 所述，能夠使用雜合體型小鼠的情況能夠得到高的制作效率，作為其結果，對為了得到實驗 必要的小鼠而進行飼養的動物室的節省空間化有貢獻，且與制作前的時間縮短，使用的小 鼠數量大幅削減，實驗者的勞力減輕相關。
[0078] 本發明中，"肝損傷小鼠"也包括該小鼠的一部分。"小鼠的一部分"是指，例如來 源于小鼠的組織、體液、細胞、以及它們的破碎物或提取物等（不特別地受到這些的限制）。 作為組織，可舉出心臟、肺、腎臟、肝臟、膽囊、胰臟、脾臟、腸、肌肉、血管、腦、精巢（睪丸）、 卵巢、子宮、胎盤、髓、甲狀腺、胸腺、乳腺等，但是不特別地受到這些的限制。作為體液，可舉 出血液、淋巴液、尿，但是不特別受到這些限制。作為細胞，是指包含于上述組織或體液的細 胞，也包括從這些組織分離和培養得到的培養細胞、精子、卵子、受精卵。作為培養細胞，包 括初代培養細胞及其細胞系細胞。發展階段（胚胎期）中的組織、體液、細胞、以及它們的破 碎物或提取物等也包含于該小鼠的一部分。應予說明，來源于本發明的肝損傷小鼠的細胞 系細胞，能夠利用公知的方法建立（胎仔細胞的初代培養方法（新生化學實驗講座、18卷、 125頁?129頁東京化學同人、和小鼠胚的操作指南、262頁?264頁、近代出版））。
[0079] 此外，本發明提供免疫缺陷肝損傷小鼠。本發明的免疫缺陷肝損傷小鼠能夠作為 用于移植人肝細胞的宿主小鼠來利用。本發明的免疫缺陷肝損傷小鼠，通過上述肝損傷小 鼠與免疫缺陷小鼠交配能夠得到。
[0080] 作為"免疫缺陷小鼠"，是對來源于異種動物的肝細胞（特別是人肝細胞）沒有排 斥反應的小鼠即可，例如，可舉出顯示T細胞和B細胞系缺陷的重癥復合免疫缺陷癥（SCID : severe combined immunodeficiency)小鼠、因遺傳性的胸腺缺失而喪失T細胞功能的小鼠 (NUDE小鼠）、利用公知的基因靶向法（Science，244 :1288-1292，1989)將RAG2基因敲除的 小鼠（RAG2敲除小鼠）等，不受到這些限制。優選為SCID小鼠。
[0081] 本發明的免疫缺陷肝損傷小鼠，以純合體型具有規定免疫缺陷性狀的基因。另 夕卜，可以以雜合體型也可以以純合體型具有包含來源于上述肝損傷小鼠的上述UPA基因的 DNA片段。本發明的免疫缺陷肝損傷小鼠即使以雜合體型具有UPA基因，移植的人肝細胞 也能夠長期生存。作為本發明的免疫缺陷肝損傷小鼠的基因型，例如，可舉出uPA(+/ -）/ SCID (+/+)、uPA (+/+)/SCID (+/+)等。但是不受到這些的限制。
[0082] 雜合體型和純合體型的選擇，如上文所述，將從得到的仔鼠的尾部分離提取的染 色體DNA利用Southern Hybridization或PCR法來篩選從而能夠進行。
[0083] 本發明中，"免疫缺陷肝損傷小鼠"也包括該小鼠的一部分。"小鼠的一部分"如上 文定義所示。
[0084] 進而，本發明提供具有人肝細胞的嵌合體小鼠。本發明的嵌合體小鼠免疫缺陷，以 雜合體型導入DNA片段，且具有含有人肝細胞的嵌合體肝，所述DNA片段含有肝特異性啟動 子/增強子以及在它們的控制下可操作地被連接的編碼尿激酶型纖溶酶原激活劑的cDNA。
[0085] 本發明的嵌合體小鼠，能夠通過對上述本發明的免疫缺陷肝損傷小鼠移植人肝細 胞而制作。
[0086] 用于移植的人肝細胞，可以使用從正常的人肝組織，通過膠原酶灌流法這樣的常 規方法而分離的肝細胞。另外，也可以將分離的肝細胞暫時冷凍保存后解凍使用。或者，也 可以將使用膠原酶灌流法這樣的方法從用人肝細胞置換的嵌合體小鼠肝臟分離的人肝細 胞（嵌合體小鼠肝細胞）以新鮮的狀態或將冷凍保存的嵌合體小鼠肝細胞融解使用。
[0087] 這樣的人肝細胞能夠經由上述免疫缺陷肝損傷小鼠的脾臟而移植入肝臟。另外， 也能夠直接從門靜脈移植。移植的人肝細胞的數量可以為1?200萬個左右，優選為20 萬?100萬個左右。免疫缺陷肝損傷小鼠的性別沒有特別限制。另外，移植時的免疫缺陷肝 損傷小鼠的日齡沒有特別限制，但是在小鼠低周齡時移植人肝細胞，則伴隨小鼠的成長人 肝細胞會更活躍地增殖，基于這一點，使用出生后〇?40天左右、其中優選使用出生后8? 40天左右的小鼠。
[0088] 移植后的小鼠，能夠利用常用方法飼養。移植后定期從小鼠尾部采取血液，測定小 鼠血中人白蛋白濃度。由于人白蛋白濃度與小鼠肝臟的人肝細胞的置換率相關，因此能夠 推測人肝細胞的生存、增殖的程度。由小鼠血中人白蛋白濃度推測置換率為70%以上的小 鼠，作為高置換嵌合體小鼠，能夠用于藥物動態試驗、肝炎病毒感染實驗等。對于小鼠的情 況而言，移植1?10 X IO5個左右人肝細胞時，通過飼養40?100天左右，能夠獲得10萬? 3000萬ng/mL的血中人白蛋白濃度。
[0089] 被移植的人肝細胞占該嵌合體小鼠的肝臟中肝細胞的至少10%、20%以上、30% 以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、或其以上。
[0090] 被移植的人肝細胞在該嵌合體小鼠的肝臟中，至少2周以上、3周以上、4周以上、5 周以上、10周、20周、30周、40周、最優選小鼠生存期間保持正常人肝細胞的功能和特性。
[0091] 作為"人肝細胞的功能和特性"，可舉出藥物代謝功能、蛋白質合成、糖異生、尿素 合成、膽汁合成、脂質合成、糖代謝、解毒、對肝炎病毒的感染等，但是不局限于此。
[0092] 被移植的人肝細胞將上述的功能和特性保持人正常肝臟內的功能和特性的50% 以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、或其以上。
[0093] 另外，本發明提供一種使用上述嵌合體小鼠篩選對人肝功能產生影響的物質的方 法。
[0094] 本方法例如能夠舉出包含以下工序的評價方法。
[0095] (a)將被檢物質給予到上述嵌合體小鼠的工序；
[0096] (b)對（a)中給予該被檢物質的該嵌合體小鼠的選自人白蛋白濃度、體重曲線、肝 重量體重比、總白蛋白值、總蛋白值、ALT值、AST值和總膽紅素值的一個以上進行測定的工 序；以及
[0097] (C)與未給予該被檢物質的該嵌合體小鼠的人白蛋白濃度、體重曲線、肝重量體重 比、總白蛋白值、總蛋白值、ALT值、AST值、和總膽紅素值進行比較，選擇在（b)中測定的人 白蛋白濃度、體重曲線、肝重量體重比、總白蛋白值、總蛋白值、ALT值、AST值和總膽紅素值 中的任意一個以上產生增減的被檢物質的工序。
[0098] 作為本發明的方法中的"被檢物質"，沒有特別限制，例如，能夠舉出天然化合物、 有機化合物、無機化合物、蛋白質、抗體、肽、氨基酸等單一化合物、核酸、以及化合物文庫、 基因文庫的表達產物、細胞提取物、細胞培養上清、發酵微生物產生物、海洋生物提取物、植 物提取物、原核細胞提取物、真核單細胞提取物或動物細胞提取物等。這些可以是精制物， 另外也可以是植物、動物或微生物等的提取物等這類粗精制物。而且被檢物質的制造方法 沒有特別限制，可以是從天然物分離的被檢物質，可以是化學或生物化學合成的被檢物質， 還可以是基因工程所制備的被檢物質。
[0099] 上述被檢物質根據需要可以進行適宜標記來使用。作為標記，例如，可舉出放射標 記、熒光標記等。此外，除上述被檢試樣之外，也包含將這些被檢試樣多種混合的混合物。 [0100] 本方法中，被檢物質對小鼠的給予方法沒有特別限制。根據給予被檢物質的種類， 可以適宜選擇經口給予或皮下、靜脈、局部、經皮或者經腸（直腸）等非經口給予。
[0101] 通過利用ELISA、免疫比濁法等測定小鼠血中的人白蛋白濃度，能夠預測小鼠肝臟 中人肝細胞的置換率。為了預測，預先有必要制作如下所述的人白蛋白濃度與置換率的相 關曲線。嵌合體小鼠剖檢前采取血液，求出人白蛋白濃度。制作剖檢中采取的肝臟的全部 或部分葉的冷凍切片或石蠟切片，使用人特異性細胞角蛋白8/18(hCK8/18)抗體等對人肝 細胞特異性抗體，進行免疫染色。在顯微鏡下對切片進行照片拍攝，求出每個肝臟切片的 hCK8/18陽性面積比例，將其作為置換率。將人白蛋白的濃度和置換率繪制成圖求出相關 式。相關式中通過輸入小鼠血中人白蛋白濃度，能夠計算大致的置換率。另外，通過經時測 定體重，能夠預測小鼠的健康狀態。通過進行剖檢時采取的血液的生化學檢查，例如總白蛋 白值、總蛋白值等的測定，能夠獲知小鼠的健康狀態。通過測定肝重量體重、ALT、AST、總膽 紅素值等，能夠獲知嵌合體小鼠肝臟的損傷程度。即，將這些數值的增減作為指標，能夠判 定被檢物質對人肝細胞的影響。
[0102] 另外，本發明提供使用上述嵌合體小鼠的評價被檢物質對人肝細胞的肝毒性的方 法。
[0103] 本方法例如，可舉出包含以下工序的評價方法。
[0104] (a)將被檢物質給予到上述嵌合體小鼠的工序；
[0105] (b)對（a)中給予了該被檢物質的該嵌合體小鼠的選自人白蛋白濃度、體重曲線、 肝重量體重比、總白蛋白值、總蛋白值、ALT值、AST值和總膽紅素值中的一個以上進行測定 的工序；以及
[0106] (C)與未給予該被檢物質的該嵌合體小鼠的人白蛋白濃度、體重曲線、肝重量體重 比、總白蛋白值、總蛋白值、ALT值、AST值、和總膽紅素值進行比較，將（b)中測定的人白蛋 白濃度、體重曲線、肝重量體重比、總白蛋白值、總蛋白值、ALT值、AST值和總膽紅素值中的 任意一個以上的增減作為指標，評價被檢物質對肝細胞的影響的工序。
[0107] 作為"被檢物質"和其"給予方法"，可舉出上述定義的內容。
[0108] 如上文所述，由人白蛋白濃度、體重曲線、肝重量體重比、總白蛋白值、總蛋白值、 ALT值、AST值和總膽紅素值能夠獲知嵌合體小鼠肝臟損傷的程度，將這些數值的增減作為 指標，能夠判定·評價被檢物質對人肝細胞的毒性。
[0109] 進而本發明提供使用上述嵌合體小鼠的篩選對病毒性肝炎治療有效的物質的方 法。
[0110] 本方法例如，可舉出包含以下工序的評價方法。
[0111] (a)對上述嵌合體小鼠接種肝炎病毒的工序；
[0112] (b)對（a)中接種肝炎病毒的該嵌合體小鼠給予被檢物質的工序；
[0113] (C)對（b)中給予被檢物質的該嵌合體小鼠的選自人白蛋白濃度、體重曲線、肝重 量體重比、總白蛋白值、總蛋白值、ALT值、AST值、總膽紅素值、病毒量和來源于病毒的蛋白 質量中的一個以上進行測定的工序；以及
[0114] (d)與未給予被檢物質該的上述嵌合體小鼠的人白蛋白濃度、體重曲線、肝重量體 重比、總白蛋白值、總蛋白值、ALT值、AST值、總膽紅素值、病毒量和來源于病毒的蛋白質量 進行比較，選擇（c)中測定的人白蛋白濃度、體重曲線、肝重量體重比、總白蛋白值、總蛋白 值、ALT值、AST值、總膽紅素值、病毒量和來源于病毒的蛋白質量中的任意一個以上發生變 化的被檢物質的工序。
[0115] 作為接種的肝炎病毒，可舉出甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型 肝炎病毒或戊型肝炎病毒。病毒能夠由脈、腹腔內給予而接種。
[0116] 本方法中使用的上述嵌合體小鼠優選為滿足以下任意一個以上的小鼠：人肝細胞 移植后經過3周以上的血中人白蛋白濃度為lmg/mL以上，肝細胞全體的10%以上是人肝細 胞。
[0117] "被檢物質"和其"給予方法"可舉出上面定義的內容。
[0118] 由人白蛋白濃度、體重曲線、肝重量體重比、總白蛋白值、總蛋白值、ALT值、AST 值、總膽紅素值、病毒量和來源于病毒的蛋白質量，能夠獲知肝炎病毒所致的肝臟的損傷程 度，將這些數值的變化作為指標，能夠判定?評價被檢物質在病毒性肝炎的治療中的有效 性。
[0119] 應予說明，本說明書中引用的全部現有技術文獻，作為參照引入本說明書。
[0120] 由以下實施例進一步具體說明本發明。
[0121] 實施例1
[0122] 使用DNA微注射法的uPA轉基因小鼠的制作
[0123] (1)含有uPA基因和白蛋白啟動子的載體的制作
[0124] uPA 基因，從小鼠肝臟用 AGPC 法（acid-guanidinium-isothiocya nate-phenol-chloroform)提取總RNA，溶解于RNase-free水。使用上述得到的總RNA，利 用由公開的數據庫登錄的uPA基因序列（登錄號：NM008873 (序列號11))制成的uPA基 因特異性引物（從第1341號堿基開始1360堿基長的反義序列）和Long RangeReverse Transcriptase (Qiagen公司生產）進行逆轉錄反應，在25°C進行10分鐘，然后在42°C進行 90分鐘，在85°C進行逆轉錄酶非活化處理5分鐘后，添加 RN aseH(Invitrogen公司生產） 在37°C處理20分鐘，消化mRNA，僅使cDNA殘存。將合成的cDNA作為PCR反應的模板進行 PCR。添加總量的1/10的上述反應液，酶使用Phusion DNA polymerase (Fynnzym es公司 生產）。PCR引物（從第39號堿基開始61堿基長的正義序列），由uPA基因序列（登錄號： NM008873)制作。擴增的片段是PCR反應中堿基號39-1360的長度。將得到的DNA片段導 入后述的具有小鼠白蛋白啟動子/增強子的表達質粒，構建"mAlb uPAIntZZ'WmAlb uPA Int2"基因的構成由圖1示出。在小鼠白蛋白的增強子/啟動子的下游，結合兔β球蛋白 的第2外顯子、內含子、第3外顯子?小鼠 uPA的OR F部分?兔β球蛋白的第3外顯子中 的polyA信號。
[0125] (2)DNA向受精卵原核的微注射
[0126] 將DNA片段的濃度制備為3ng/ μ L之后，注入到從CB-17/Icr和Scid-beige雜交 系小鼠采取的原核期受精卵。利用微注射法向受精卵注入DNA。注入DNA的受精卵748個 中生存635個，其中469個分化為2細胞期胚。將該2細胞期胚移植入預先假妊娠了的受胚 小鼠 ICR系統的輸卵管內。得到產仔108只。得到的產仔是否含有uPA基因，利用PCR法解 析（臨床研究）。PCR的結果，確認1個體中含有目的DNA。基于這1只小鼠確立了 Iline 的uPA轉基因小鼠系統。
[0127] (3)uPA轉基因小鼠的血清中ALT值的測定解析
[0128] 從得到的保有uPA基因的小鼠采血，得到血清。然后，通過測定ALT值，解析肝臟 中的uPA基因表達所引起的影響，S卩，肝細胞的損傷。ALT值的測定方法使用和光純藥工業 "Transaminase CII -Test Wakou"cat#431_30901進行。樣品血清在米取后測定之前，以一 80°C保存。
[0129] ALT測定方法按照"Transaminase C II -Test Wakou"添加的標準操作法1的1/20 規模實施。首先，ALT用底物酶液:ALT用酶劑1瓶中添加 ALT用底物緩沖液10mL，溶解。進 一步添加顯色試液：顯色劑1瓶中添加顯色劑溶解液40mL，溶解。
[0130] 接下來，在冰上準備C0RNING25850 96well U底板。將樣品血清IyL加入板中。 將板從冰上移開，添加底物酶液25 μ L，在37°C加溫5分鐘。將STND (X 1/2稀釋：1 μ L，X 1 : l，2yL)加入空的well中，將顯色試液25yL添加到各well。STND的well中添加底物酶 液25 μ L，在37°C加溫20分鐘。向各well添加反應終止液100 μ L，用板攪拌機充分攪拌之 后，測定60分鐘以內570nm處的吸光度。用STND的測定值制作標準曲線，計算樣品的活性 值。
[0131] 測定的小鼠中不能確認ALT值為高值的小鼠。作為目的的uPA轉基因小鼠，uPA基 因的表達量必須是對之后的肝細胞移植顯示最佳條件的表達量，在制作多個uPA轉基因小 鼠基礎上，有必要選擇顯示最佳表達量的小鼠，本方法中，從轉基因小鼠的制作效率的界限 出發，可知不適合于按照概率論制作這次這樣的最佳的小鼠的方法。
[0132] 實施例2
[0133] 介由ES細胞的uPA轉基因小鼠的制作
[0134] (1)插入uPA基因的ES細胞的建立
[0135] 本實施例中，構建uPA基因插入用載體"mAlb uPAInt2ES"（圖2)并使用。該載體 是，為了賦予ES細胞的藥劑選擇性，對"mAlb uPAInt2"質粒進一步導入由SV40啟動子表 達的新霉素耐性基因的載體。利用電穿孔法導入到由129SvEv小鼠得到的ES細胞，接下來 利用G418進行選擇培養。關于得到的G418耐性集落，利用PCR進行基因導入的ES細胞的 測試。以下，做具體說明。
[0136] 利用限制性內切酶將相同的重組用載體（uPA)DNA25_30y g切斷從而使其線狀 化，精制。將該DNA混懸于含有小鼠 ES細胞3X106個的電穿孔用緩沖液（20mM HEPES pH7.0、137mM NaCl、5mM KCl、6mM D-glucose、0.7mM Na2HPO4)中，在 Field Strengthl85V/ cm、Capacitance500 μ F的條件下，進行基因導入。從導入經過24小時后，用終濃度200 μ g/ mL的G418 (Geniticin) (SIGMA公司G-9516)進行選擇培養。ES細胞的培養中，使用 Dulbecco' s Modified Eagle's 培養基（DMEM) (Gibco/BRL 公司 11965-084)培養液中添加終 濃度15%的胎牛血清（Hyclone公司SH30071)、終濃度2mM的L-谷氨酰胺（Gibco/BRL公 司25030-081)、終濃度分別為100 μ M的非必需氨基酸（Gibco/BRL公司11140-050)、終濃 度IOmM的HEPES (Gibco/BRL公司15630-080)、終濃度分別為lOOU/mL的青霉素/鏈霉素 (Gibco/BRL公司15140-122)、終濃度100μΜ的β-巰基乙醇（SiGMA公司M-7522)、以及終 濃度l〇〇〇U/mL的ESGRO(LiF) (Gibco/BRL公司13275-029)而得的培養基（以下簡寫為ES 培養基）。
[0137] 此外，作為ES細胞用的飼養細胞，使用從E14. 5胚分離的MEF(Mouse Embryonic Fibroblast)細胞，培養液使用DMEM(Gibco/BRL公司11965-084)培養液中添加終濃度 10 %的胎牛血清（Hyclone公司SH30071)、終濃度2mM的L-谷氨酰胺（Gibco/BRL公司 25030-081)、終濃度分別為100 μ M的非必需氨基酸（Gibco/BRL公司11140-050)、終濃度 分別為lOOU/mL的青霉素/鏈霉素（Gibco/BRL公司15140-122)而得的培養基（以下簡寫 為MEF培養基）。將150cm 2培養瓶中鋪滿為止地培養的MEF細胞用胰蛋白酶/EDTA (0. 05 % /lmM、Gibco/BRL公司25300-047)進行剝離，分別以最佳的濃度重新播種到4個IOcm培養 皿、2塊24孔板、2塊6孔板、6個25cm 2培養瓶、2個75cm2培養瓶。
[0138] (2)基因型解析用ES細胞的制備
[0139] 基因導入后第5天開始，按照以下方式，將出現的G418耐性集落在24孔板上傳 代。即，使用移液槍（Gilson)，將G418耐性集落轉移至含有150yL胰蛋白酶/EDTA溶液的 96孔微孔板，在20分鐘37°C的孵育器內處理之后，通過使用移液槍移液得到單一細胞。將 該細胞懸浮液轉移至24孔板繼續培養。2天后，將24孔板上的細胞分為冷凍保存用和DNA 提取用2批。即，細胞中添加胰蛋白酶/EDTA500 μ L，在37°C孵育器內處理20分鐘，添加 ES 培養基500 μ L，通過用移液槍輕輕移液得到單一細胞。然后，向加入ImLES培養基的24孔 板移入細胞懸浮液的一半，向原24孔板也添加 ES培養基lmL。進而在2天后，去除一側的 24孔板的培養基，向ES培養基加入添加有終濃度為10%的胎牛血清和終濃度為10%的二 甲基亞砜（DMSO) (Sigma公司D-5879)的冷凍用培養基lmL，密封后一 70°C冷凍保存。
[0140] 基因導入ES細胞的測試，利用PCR按照以下所示的方式進行。即，從細胞增殖到鋪 滿的狀態的24孔板的各孔去除培養基，用PBS清洗后添加溶解緩沖液（1 % SDS、20mM EDTA、 20mM Tris pH7.5)250yL 和 Proteinase K(20mg/mL)5yL，充分振蕩，52°C加溫溶解。從溶 解的樣品，通過苯酚/氯仿提取來提取DNA，作為PCR用的模板DNA使用。
[0141] (3)ES細胞的基因型解析方法：按照uPA基因導入ES細胞的選擇如下的順序進 行。
[0142] 使用的PCR引物在兔β球蛋白中設定。序列是正義引物：GGGCGGCGGTACCGATCCTG AGAACTTCAGGGTGAG(序列號 1)、反義引物：GGGCGGCGGTACCAATTCTTTGCCAAAATGATGAGA(序列 號2)。反應按照AmpiTaqGolcKABI公司）的添加方法進行。95°C經過9分鐘使酶活化后， 重復94°C、30秒鐘（變性），63°C、30秒鐘（退火），72°C、1分鐘（延伸）的反應40次。終 止后將反應液用2 %瓊脂糖凝膠泳動，進行PCR產物的確認。
[0143] 由PCR解析被確認基因導入的克隆，通過將冷凍保存的96孔板加溫至37°C進行融 解，傳代至24孔板。該24孔板在37°C培養24小時后，交換培養基除去DMSO和液體石蠟。 各個克隆達到75?90%鋪滿的時刻，從24孔傳代至6孔板。進而，在6孔板中得到2孔份 增殖到75?90%鋪滿的克隆，冷凍保存1孔份，剩余的1孔份用于注入胚泡和DNA提取。
[0144] 冷凍保存按照以下方式進行。即，用PBS將細胞清洗2次后，添加0. 5mL的 Trypsin，在37°C保溫15?20分鐘進行胰蛋白酶處理后，進而添加0. 5mL的ES細胞培養 基，進行35?40次移液，將ES細胞塊完全解離。將該細胞懸浮液移入15mL離心管，進而 用ImL的ES細胞培養基清洗孔回收到管中。將管以IOOOrpm離心7分鐘，去除培養基再次 混懸于0. 25mL ES細胞培養基，添加0. 25mL的2X冷凍培養基。將孔的內容物移入凍存 管，一 80°C冷凍，在液氮中保存。
[0145] 用于注入胚泡和DNA提取的細胞，在將ES細胞塊完全解離后，細胞的四分之一用 于注入胚泡，剩余細胞的三分之一和三分之二分別在明膠覆蓋的60mm培養皿中傳代。前者 在細胞增殖到鋪滿為止的后提取PCR解析用的基因組DNA,后者細胞在增殖到鋪滿為止后， 分為3個冷凍。
[0146] (4)利用具有uPA基因的ES細胞的嵌合體小鼠的制作
[0147] 關于被確認基因導入的ES細胞克隆，將C57BL/6J系小鼠的胚泡作為宿主胚胎制 作嵌合胚，將其移植到假妊娠小鼠的子宮角得到產仔。宿主胚胎的采取，可通過懷孕第3 天用添加100 μ M胰蛋白酶/EDTA的Whitten' s培養基，對輸卵管和子宮灌流來進行。用 Whitten' s培養基培養8細胞期胚或桑椹胚24小時，將得到的胚泡用于注入。用于注入 的ES細胞，在傳代開始第2天或者第3天通過TE處理使其分散，用于顯微操作前4°C下靜 置。作為ES細胞注入用移液器，使用Sutter公司生產的glass capillary tubing (內徑約 20 μ m)。作為胚固定用移液器，將外徑Imm微小玻璃管（NARISHIGE)使用微小電極制作器 (Sutter公司P-97/IVF)延伸拉細后，使用顯微拉制儀（DeFonburun)在外徑50?100 μ m 的部分切斷，進而使用將口徑加工為10?20 μ m的玻璃管。注入用移液器和固定用移液器 與連接有壓電系統（PR頂ETECH PAMS-CT150)的微型操作器（Lica)連接。作為用于顯微操 作的容器，使用在開孔載玻片用蜜蠟粘結蓋玻片的容器，在該容器上放置2個添加約10 μ L 的0. 3% BSA的Hepes-buffered Whitten's培養基液滴，用礦物油（Sigma)覆蓋上面。在 一個液滴中，添加約100個ES細胞，在另一個添加20個左右擴張胚泡，每個胚注入約15個 ES細胞。顯微操作均在倒置顯微鏡下進行。將操作胚移植到假妊娠第2天的ICR系受孕 雌鼠的子宮角。對于即使到了分娩預期日也不娩出產仔的受孕雌鼠，實施剖腹產，由義親哺 育。在C57BL/6J系小鼠的胚泡中注入45克隆的ES細胞，結果39克隆中得到雄嵌合體小 鼠。
[0148] (5) uPA基因向生殖系列傳遞的測試
[0149] 使嵌合體小鼠與C57BL/6J系小鼠交配，測試是否得到來源于ES細胞的產仔。 如果嵌合體小鼠的生殖細胞來源于ES細胞，則被娩出的產仔的毛色呈野生色，如果來源 C57BL/6J系小鼠的胚泡則呈黑色。通過交配在251ine中誕生野生色小鼠，確認ES細胞向 生殖系列傳遞。
[0150] 接下來，從這些野生色小鼠的尾部的一部分提取DNA，利用PCR確認uPA基因是否 被傳遞。其結果確認在Hline的來源于ES細胞的產仔中uPA基因被傳遞。
[0151] (6) uPA轉基因小鼠的血清中的ALT值的測定解析
[0152] 從得到的保有uPA基因的小鼠采血，得到血清。然后，通過測定ALT值，解析肝臟 中由uPA基因表達引起的影響，即肝細胞的損傷。ALT值的測定方法，使用和光純藥工業 "Transaminase CII - Test Wakou"cat#431_30901進行。樣品血清在米取后測定之前一 80°C保存。
[0153] ALT測定方法按照"Transaminase C II -Test Wakou"添加的標準操作法1的1/20 規模實施。首先，ALT用底物酶液：在ALT用酶劑1瓶中添加 ALT用底物緩沖液10mL，溶解。 另外顯色試液：在顯色劑1瓶中添加顯色劑溶解液40mL，溶解。
[0154] 接下來，在冰上準備C0RNING25850 96well U底板。板中加入樣品血清lyL。將 板從冰上移開。添加底物酶液25 μ L，37°C加溫5分鐘。將STND (X 1/2稀釋：1 μ L，Xl :1， 2 μ L)加入空的well。各well添加顯色試液25 μ L。向STND的well添加底物酶液25 μ L， 37°C加溫20分鐘。向各well添加反應終止液100 μ L，用板攪拌器充分攪拌后，60分鐘以 內測定570nm處吸光度。用STND的測定值制成標準曲線，計算樣品的活性值。
[0155] 確認測定的Hline小鼠中，31ine雜合小鼠的ALT值是高值的小鼠（圖3)。
[0156] 得到的31 ine中，使用ALT值為高值的21 ine (#IC2和#2C7)，進行以下的人肝細胞 的移植實驗。
[0157] 實施例3
[0158] 嵌合體小鼠的制作
[0159] (1)免疫缺陷肝損傷小鼠
[0160] 使上述實施例2中制作的uPA-Tg小鼠（hemizygote，+/ -）與SCID-bg小鼠 2 次回交，得到具有uPA-Tg(+/-）SCID(+/+)基因型的小鼠。從該小鼠的雄體采取精子，與 SCID小鼠（homozygote，+/+)的未受精卵體外受精后，返回借腹。選擇在誕生的仔小鼠體內 植入Tg基因的小鼠，通過自然交配，得到具有兩方特性的小鼠 uPA-Tg (+/ -）/SCID (+/+)。 uPA-Tg(+/-）和uPA-Tg( -/ 一）的識別是將對導入基因特異性序列應用于引物，通過基 因組PCR法進行。
[0161] 正向引物：5 ' -GGGCGGCGGTACCGATCCTGAGAACTTCAGGGTGAG-3 '（序列號 3)
[0162] 反向引物：5 ' -GGGCGGCGGTACCAATTCTTTGCCAAAATGATGAGA-3 '（序列號 4)。
[0163] 另外，SCID (+/+)、SCID (+/ -）和 SCID ( - / 一）的識別是通過 PCR-RFLP 法進行。
[0164] 接下來，使得到的 uPA-Tg (+/ -）/SCID (+/+)之間交配，得到 uPA - Tg (+/+) / SCID (+/+)和 uPA-Tg (+/ -）/SCID (+/+)。uPA-Tg (+/+)和 uPA-Tg (+/ -）的識別利 用Southern blot法實施。將出生后第8?10天的小鼠的尾部切斷約5mm，利用3SDS、 proteinaseK溶液將其可溶化，利用苯酚和氯仿提取除去混雜的蛋白質成分。使用 DNase-free RNase A將混雜的RNA分解后，通過異丙醇沉淀使高分子基因組DNA析出。用 70%乙醇將上述的基因組DNA清洗并風干后，再溶解于TE。用EcoRl完全消化從樣本提取 的基因組DNA、陽性和陰性對照的基因組DNA各自5 μ g，將生成的DNA片段通過瓊脂糖電泳 分離，轉移至尼龍膜。使用限制性內切酶EcoRl，從uPA cDNA探針/TA精制（379bp)適用于 Southern Hybridization探針的DNA片段。利用隨機引物法，將上述的DNA片段進行[32P] 標記。使轉移到尼龍膜的DNA片段與RI標記的uPA cDNA探針雜交。通過清洗去除非特異 結合的探針，將來源于導入至mAlb-uPA-Int2Tg小鼠候選個體的外來基因的放射活性信號 對X射線膜感光來檢測。檢測來源于野生型基因位點的I. 5kb的特異性信號和來源于突變 型基因位點的〇. 4kb(wt :1. 5kb)的特異性信號，判定mAlb-uPA-Int2Tg小鼠個體的基因型。
[0165] (2)人肝細胞移植
[0166] 作為人肝細胞，使用從BD Gentest公司購入的肝細胞（Lot No. BD85、男孩、5歲）。 該冷凍肝細胞按照已有公知的方法（Chise Tateno et al，Near-completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs. Am J Patholl65 ： 901-912,2004)融解使用。
[0167] 用乙醚麻醉出生后2?4周齡的#1C2純合小鼠7只、雜合小鼠4只、#2C7純合小 鼠4只、雜合小鼠7只的uPA-Tg/SCID小鼠，將肋腹切開約5mm，從脾頭注入2. 5X IO5個人 肝細胞后，將脾臟放回腹腔縫合。#1C2純合小鼠1只在移植后第30天死亡。
[0168] 移植后3、6周，然后每周從小鼠尾靜脈采取2 μ L血液，添加到LX_Buffer200 μ L。 通過免疫比濁法使用自動分析裝置JEOL ΒΜ6050(日本電子），測定小鼠血中的人白蛋白濃 度。結果發現#1C2純合小鼠、雜合小鼠、#2C7純合小鼠中人白蛋白增加，發現人白蛋白> 7mg/mL(圖4、圖5)。#2C7雜合小鼠沒有發現人白蛋白的增加（圖5)。均觀察到順利的體 重增加，但是#2C7雜合小鼠中總體上體重是高值（圖5)。
[0169] 移植后10-12周后（13-15周齡）解剖嵌合體小鼠，采取肝臟、血液。制作肝臟7個 葉的冷凍切片，使用人特異性細胞角蛋白8/18 (hCK8/18)抗體進行免疫染色（圖6)。求出 冷凍切片單位面積的hCK8/18陽性面積，作為置換率。其結果可確認#1C2純合小鼠、#2C7 純合小鼠中置換率70%以上（圖7)。#1C2的雜合小鼠觀察到60%以上的置換率（圖7)。 發現小鼠血中人白蛋白濃度和置換率與已有公知的嵌合體小鼠 （Chise Tateno et al，如 上文所述）的血中人白蛋白濃度和置換率有同樣的相關關系（圖7)。另外，在相關關系中， #1C2和#2C7之間，以及雜合小鼠和純合小鼠之間沒有發現明顯的差異（圖7)。
[0170] 向出生后2?4周齡的#1C2純合小鼠28只、雜合小鼠28只、#2C7純合小鼠18 只、雜合小鼠15只uPA-Tg/SCID小鼠移植人肝細胞。其結果為，成為小鼠人白蛋白濃度是 7mg/mL以上的高置換嵌合體小鼠的是#1C2純合小鼠61%、雜合小鼠是36%、#2C7純合小 鼠28%、雜合小鼠0% (圖8-1，2、圖9-1，2、圖10、圖11)。
[0171] 一部分小鼠（#1C2純合小鼠6只、雜合小鼠6只、#2C7純合小鼠4只）在14或15 周齡時從眼窩靜脈竇以IX IO4拷貝/每只接種HBV或HCV(圖8-1，2、9-1，2)。接種后第1 周開始，每周從眼窩靜脈竇采取血液，利用real-time quantitative PCR法和real-time quantitative RT-PCR 法求出 HBV 和 HCV 病毒滴度。
[0172] 對從接種HCV的小鼠采取的血清5μ L使用S印aGene RV-R(三光純藥株式會 社，東京）進行RNA提取，將RNA溶解于含有ImM DTT (Promega株式會社、東京）和0.4U/ μ L ribonuclease inhibitor (Takara_bio 株式會社、滋賀)白勺 10 μ L Nuclease-free water (Life Technologies Corporation，Carlsbad，CA, USA)。溶解的 RNA 在定量血清中 HCV RNA之前一 80°C保存。
[0173] PCR反應液，使用溶解的RNA原液或者稀釋的RNA2.5y L通過TaqMan EZ RT-PCR Core Reagents (Life Technologies Corporation)進行。PCR 反應按照 50 °C 2 分鐘 (Uracil-N-Glycosylase 處理）一60°C 30 分鐘（逆轉錄反應）一95°C 5 分鐘（PCR 初期 活化）一[95°C 20秒鐘（變性）一62°C 1分鐘（退火?延伸反應）]X 50循環進行，利用 ABI Prism7500(Life Technologies Corporation)進行反應和解析。使用引物和探針如以 下所示。
[0174] 正向引物：5 ' -CGGGAGAGCCATAGTGG-3 '（序列號 5)
[0175] 反向引物：5 ' -AGTACCACAAGGCCTTTCG-3 '（序列號 6)
[0176] 探針：5' -CTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3'（序列號 7)
[0177] (5 末端：FAM、3 末端：TAMRA)
[0178] HCV RNA標準品使用從HCV感染嵌合體小鼠得到的血清。該血清是由人工HCV RNA確定HCV RNA量的血清，在血清中HCV RNA定量之前一 80°C保存。血清中HCV RNA濃 度測定時，從該血清進行RNA提取，將梯度稀釋10倍的RNA作為HCV RNA標準品使用。使 用該HCV RNA標準品的血清中HCV RNA定量的定量范圍是血清中2. IX 104copies/ml? 2. lX107copies/mL〇
[0179] 對從接種HBV的小鼠采取的血清10 μ L，使用SMI TEST EX-R&D(Code :R-35、株 式會社醫學生物學研究所、長野）進行DNA提取，將DNA溶解于20 μ L的Nuclease-free water。溶解的DNA，在HBV DNA定量之前在一 20°C以下保存。
[0180] PCR 反應液，使用溶解的 DNA5 μ L，通過 TaqMan PCR Core Reagents Kit with AmpliTaq Gold(Applied Biosystems Japan 株式會社、東京）進行。PCR 反應按照 50°C 2 分鐘（引物的退火）一95°C 10分鐘（PCR初期活化）一[95°C 20秒鐘（變性）一60°C 1 分鐘（退火?延伸反應）]X53 循環進行，通過 ABI Prism7500 (Applied Biosystems Japan 株式會社、東京）進行反應。另外，解析中以2孔的平均值計算HBV DNA量。應予說明，計算 值大于0且小于4. OX 104copies/mL時設為PCR陽性，計算值為0時設為PCR陰性，測定對 象的2孔中均是PCR陽性時：記為" + "（HBV陽性）、2孔中均為PCR陰性時：記為"一"（HBV 陰性）、2孔中某一個為陽性時：記為" ± "（HBV假陽性）。
[0181] 使用引物和探針按照以下序列進行。
[0182] 正向引物：5-CACATCAGGATTCCTAGGACC-3 (序列號 8)
[0183] 反向引物：5-AGGTTGGTGAGTGATTGGAG-3 (序列號 9)
[0184] 探針：5-CAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTC-3 (序列號 10)
[0185] (5 末端：FAM、3 末端：TAMRA)
[0186] HBV標準品使用插入HBV基因（nucleotidesl?2182)的質粒，使用由0D260nm 濃度換算拷貝數的物質。血清中HBV DNA定量的測定界限是4.0X104C〇pieS/mL? 4. OX 109copies/mL。另外關于顯示4. OX 109copies/mL以上的樣本，進行稀釋在測定范圍 實施。
[0187] 其結果，感染的全部小鼠中，確認HBV、HCV的感染（圖8_1，2、圖9_1，2)。接種HCV 的小鼠中，7/8例在接種后第1周開始發現HCV，第4周左右開始達到坪值（圖8-1、圖9-1)。 1/8例在第4周開始檢出HCV(圖8-1、圖9-1)。HBV中7/8例在接種后3周中小鼠血清中 檢出HBV，第4周全部小鼠感染。接種后第8周達到坪值（圖8-2、圖9-2)。關于感染效率、 病毒的增殖速度，#1C2和#2C7之間，以及#1C2的雜合小鼠和純合小鼠之間沒有發現明顯 差異（圖8-1，2、圖9-1，2)。應予說明，#2C7雜合小鼠中由于沒有得到小鼠人白蛋白濃度 為7mg/mL以上的高置換嵌合體小鼠，因此沒有用于感染實驗。
[0188] 剩余的小鼠（#1C2純合小鼠22只、雜合小鼠22只、#2C7純合小鼠14只、雜合小 鼠15只）飼養至30周齡，1周進行1次人白蛋白濃度的測定，第30周解剖，同樣求出肝臟 的置換率。人白蛋白濃度，即使超過14周齡也繼續增加（圖10、11)。30周前，大多數動物 中，沒有發現小鼠血中人白蛋白濃度的降低。解剖時的人白蛋白濃度和置換率之間觀察到 相關關系（圖7)。
[0189] 產業上的可利用性
[0190] 根據本發明，能夠提供雖然以雜合體型具有UPA基因，但是對來源于小鼠的肝細 胞的損傷度高的肝損傷小鼠及其高效的制作方法。
[0191] 本說明書中引用的全部期刊、專利和專利申請直接作為參考引入本說明書。
【權利要求】
1. 一種以雜合體型具有uPA基因的肝損傷小鼠的制作方法，其特征在于，具有以下工 序： (i) 利用DNA片段轉化小鼠ES細胞的工序，所述DNA片段含有肝特異性啟動子/增強 子以及在它們的控制下可驅動地被連接的編碼尿激酶型纖溶酶原激活劑的cDNA ; (ii) 將工序（i)得到的轉化了的小鼠ES細胞注入宿主胚胎的工序； (iii) 將工序（ii)得到的注入了 ES細胞的宿主胚胎移植到代孕母小鼠的子宮獲得嵌 合體小鼠的工序；以及 (iv) 將工序（iii)得到的嵌合體小鼠交配，得到以雜合體型導入了該DNA片段的轉基 因小鼠的工序。
2. 根據權利要求1所述的方法，進一步具有（v)獲得2?3周齡的血清ALT值是 30Karmen單位以上的轉基因小鼠的工序。
3. 根據權利要求1或2所述的方法，其中，肝特異性啟動子是白蛋白啟動子。
4. 一種肝損傷小鼠及其一部分，其特征在于，是利用權利要求1?3的方法制作的。
5. -種免疫缺陷肝損傷小鼠，其特征在于，是通過將權利要求4所述的肝損傷小鼠與 SCID小鼠交配而得到的。
6. -種嵌合體小鼠的制作方法，其特征在于，包括對權利要求5所述的免疫缺陷肝損 傷小鼠移植人肝細胞，該嵌合體小鼠具有含有人肝細胞的嵌合體肝。
7. -種嵌合體小鼠，其特征在于，具有由權利要求6所述的方法制作的含有人肝細胞 的嵌合體肝。
8. -種嵌合體小鼠，其特征在于，其免疫缺陷，以雜合體型具有DNA片段，且具有含有 人肝細胞的嵌合體肝，所述DNA片段含有肝特異性啟動子/增強子以及在它們的控制下可 驅動地被連接的編碼尿激酶型纖溶酶原激活劑的cDNA。
9. 根據權利要求7或8所述的嵌合體小鼠，其中，人肝細胞占嵌合體肝的肝細胞的至少 10%。
10. 根據權利要求7或8所述的嵌合體小鼠，其中，人肝細胞在嵌合體肝中保持其功能 和特性至少2周以上。
11. 一種對人肝功能產生影響的物質的篩選方法，其特征在于，包括以下的（a)?（c) 工序： (a) 將被檢物質給予到權利要求7?10中任一項所述的嵌合體小鼠的工序； (b) 對在（a)中給予了該被檢物質的該嵌合體小鼠的選自人白蛋白濃度、體重曲線、肝 重量體重比、總白蛋白值、總蛋白值、ALT值、AST值和總膽紅素值中的一個以上進行測定的 工序；以及 (c) 與未給予該被檢物質的該嵌合體小鼠的人白蛋白濃度、體重曲線、肝重量體重比、 總白蛋白值、總蛋白值、ALT值、AST值、和總膽紅素值進行比較，選擇（b)中測定的人白蛋白 濃度、體重曲線、肝重量體重比、總白蛋白值、總蛋白值、ALT值、AST值和總膽紅素值中的任 意一個以上產生增減的被檢物質的工序。
12. -種評價被檢物質對人肝細胞的毒性的方法，其特征在于，包括以下的（a)?（c) 工序： (a)將被檢物質給予到權利要求7?10中任一項所述的嵌合體小鼠的工序； (b) 對在（a)中給予了該被檢物質的該嵌合體小鼠的選自人白蛋白濃度、體重曲線、肝 重量體重比、總白蛋白值、總蛋白值、ALT值、AST值和總膽紅素值中的一個以上進行測定的 工序；以及 (c) 與未給予該被檢物質的該嵌合體小鼠的人白蛋白濃度、體重曲線、肝重量體重比、 總白蛋白值、總蛋白值、ALT值、AST值和總膽紅素值進行比較，將（b)中測定的人白蛋白濃 度、體重曲線、肝重量體重比、總白蛋白值、總蛋白值、ALT值、AST值和總膽紅素值中的任意 一個以上的增減作為指標，評價該被檢物質對人肝細胞的影響的工序。
13. -種對病毒性肝炎的治療有效的物質的篩選方法，其特征在于，包括以下的（a)? (d)工序： (a) 對權利要求7?10中任一項所述的嵌合體小鼠接種肝炎病毒的工序； (b) 對在（a)中接種了肝炎病毒的該嵌合體小鼠給予被檢物質的工序； (c) 對在（b)中給予了被檢物質的該嵌合體小鼠的選自人白蛋白濃度、體重曲線、肝重 量體重比、總白蛋白值、總蛋白值、ALT值、AST值、總膽紅素值、病毒量和來源于病毒的蛋白 質量中的一個以上進行測定的工序；以及 (d) 與未給予該被檢物質的該嵌合體小鼠的人白蛋白濃度、體重曲線、肝重量體重比、 總白蛋白值、總蛋白值、ALT值、AST值、總膽紅素值、病毒量和來源于病毒的蛋白質量進行 比較，選擇在（c)中測定的人白蛋白濃度、體重曲線、肝重量體重比、總白蛋白值、總蛋白 值、ALT值、AST值、總膽紅素值、病毒量和來源于病毒的蛋白質量中的任意一個以上產生變 化的被檢物質的工序。
14. 根據權利要求13所述的方法，其中，肝炎病毒是甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙 型肝炎病毒、丁型肝炎病毒或戊型肝炎病毒。
【文檔編號】C12N15/09GK104334017SQ201380022371
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2013年4月25日 優先權日:2012年4月27日
【發明者】小原道法, 寺社下浩一, 川瀬洋介, 向谷知世, 大下浩樹, 浜村理子 申請人:公益財團法人東京都醫學綜合研究所, 中外制藥株式會社, 飛氏生物株式會社