一種基于雙阻遏策略增強(qiáng)大腸桿菌t7表達(dá)系統(tǒng)穩(wěn)定性的方法
【專利摘要】一種基于雙阻遏策略增強(qiáng)大腸桿菌T7表達(dá)系統(tǒng)穩(wěn)定性的方法，屬于大腸桿菌表達(dá)調(diào)控領(lǐng)域。本發(fā)明利用基因工程技術(shù)，以細(xì)菌來源的普魯蘭酶為表達(dá)蛋白，構(gòu)建了表達(dá)普魯蘭酶的重組大腸桿菌。通過使用含有l(wèi)ac操縱子和阻遏物基因lacI的pET表達(dá)載體pET-22b(+)和pET-28a(+)，構(gòu)建了重組菌E.coliBL21/pET-22b(+)-pul和E.coliBL21/pET-28a(+)-PelB-pul，利用lac操縱子嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾p阻遏調(diào)控策略，基本消除了毒性外源蛋白的本底表達(dá)，提高了冷凍甘油菌種的表達(dá)穩(wěn)定性和乳糖自誘導(dǎo)后的目標(biāo)蛋白表達(dá)量，增強(qiáng)了大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)穩(wěn)定性。本發(fā)明解決了大腸桿菌T7表達(dá)系統(tǒng)中常見的系統(tǒng)穩(wěn)定性問題，開發(fā)了增強(qiáng)大腸桿菌T7表達(dá)系統(tǒng)穩(wěn)定性的方法。
【專利說明】—種基于雙阻遏策略增強(qiáng)大腸桿菌T7表達(dá)系統(tǒng)穩(wěn)定性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]—種基于雙阻遏策略增強(qiáng)大腸桿菌T7表達(dá)系統(tǒng)穩(wěn)定性的方法,屬于大腸桿菌表達(dá)調(diào)控領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]重組技術(shù)已廣泛用于目標(biāo)蛋白的高水平表達(dá)。在多種可用于異源蛋白表達(dá)的系統(tǒng)中，大腸桿菌系統(tǒng)始終是最常用的表達(dá)宿主。與其他表達(dá)宿主相比，大腸桿菌具有眾多優(yōu)勢(shì)，如遺傳背景清楚、生長(zhǎng)迅速、可在價(jià)格低廉的培養(yǎng)基中達(dá)到高密度和擁有過量表達(dá)目標(biāo)蛋白的能力。基于T7 RNA聚合酶的T7系統(tǒng)表達(dá)的目標(biāo)蛋白量可高達(dá)細(xì)胞總蛋白量的50%，因此顯示了與其他大腸桿菌系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)。
[0003]T7 RNA聚合酶合成mRNA的速度是大腸桿菌自身RNA聚合酶的5倍，其高活力賦予了 T7系統(tǒng)強(qiáng)大的合成重組蛋白的能力。但T7 RNA聚合酶的高活力已被證明了對(duì)表達(dá)系統(tǒng)存在一些負(fù)面作用，主要表現(xiàn)為:雖然T7 RNA聚合酶的編碼基因，位于大腸桿菌宿主BL21(DE3)染色體上的T7基因受到7acUV5啟動(dòng)子和Iac操縱子序列的調(diào)控，只有極少量的T7RNA聚合酶“滲漏”表達(dá)，但由于T7 RNA聚合酶活力過高，即使沒有誘導(dǎo)物存在，目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄也能被引發(fā)，產(chǎn)生本底表達(dá)。如果目標(biāo)蛋白對(duì)大腸桿菌細(xì)胞有毒性，這種本底表達(dá)將會(huì)影響表達(dá)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和目標(biāo)蛋白的正常表達(dá)，甚至表達(dá)菌株可能不穩(wěn)定或積累有害突變。
[0004]已有一些研究致力于減少大腸桿菌T7表達(dá)系統(tǒng)的本底表達(dá)。一種減少本底表達(dá)的方法是使用含有與PET載體兼容的pLysS或pLysE質(zhì)粒的宿主菌。這兩種載體表達(dá)的T7溶菌酶，是T7 RNA聚合酶的天然抑制劑，能與T7 RNA聚合酶結(jié)合并抑制后者的活性。然而，雖然BL21 (DE3) pLysS菌株的本底表達(dá)水平幾乎只有BL21 (DE3)菌株的十分之一，但前者的本底表達(dá)依然存在，并且依然可能引起系統(tǒng)不穩(wěn)定的問題。而且，T7溶菌酶是一種雙功能的蛋白，它對(duì)大腸桿菌細(xì)胞壁具有破壞作用，因此含有PLysS或pLysE質(zhì)粒的菌株生長(zhǎng)較慢。另外誘導(dǎo)后，T7溶菌酶將減弱表達(dá)，使目標(biāo)蛋白表達(dá)量很低。向培養(yǎng)基中添加0.5-1%葡萄糖，產(chǎn)生的代謝阻遏效應(yīng)也能夠降低T7 RNA聚合酶的本底表達(dá)。
[0005]以上的方法都是直接針對(duì)T7 RNA聚合酶的本底表達(dá)而設(shè)計(jì)的，目標(biāo)都是減少T7RNA聚合酶的本底表達(dá)。本發(fā)明開發(fā)出一種不直接減弱T7 RNA聚合酶的本底表達(dá)，但可以阻止T7 RNA聚合酶引發(fā)表達(dá)質(zhì)粒上外源基因轉(zhuǎn)錄的方法。在pET載體的T7啟動(dòng)子下游插入Iac操縱子，形成TJ-1ac啟動(dòng)子，能有效地降低目標(biāo)蛋白的本底表達(dá)。'l-lac啟動(dòng)子可提供一個(gè)he阻遏物的結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)體系中不存在誘導(dǎo)物時(shí)，Iac阻遏物可緊緊地結(jié)合于Π-lac啟動(dòng)子的Iac操縱子序列上，阻止由本底表達(dá)產(chǎn)生的T7 RNA聚合酶通過，干擾了mRNA鏈的延伸，從而減少 外源基因在未誘導(dǎo)狀態(tài)下的本底轉(zhuǎn)錄。如果系統(tǒng)中存在足夠量的he阻遏物以占據(jù)細(xì)胞中所有的操縱子位點(diǎn)，未誘導(dǎo)細(xì)胞中目標(biāo)蛋白的本底表達(dá)將幾乎被完全地消除，表達(dá)系統(tǒng)也將獲得穩(wěn)定。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006](一)要解決的技術(shù)問題
本發(fā)明的目的是提供增強(qiáng)大腸桿菌T7表達(dá)系統(tǒng)穩(wěn)定性的方法。本發(fā)明以細(xì)菌來源的普魯蘭酶為表達(dá)蛋白，使用了含有he操縱子和阻遏物基因IeicI的pET表達(dá)載體，利用Iac操縱子嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾p阻遏調(diào)控策略，基本消除了毒性報(bào)道蛋白的本底表達(dá)，提高了大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)穩(wěn)定性，從而開發(fā)了增強(qiáng)大腸桿菌T7表達(dá)系統(tǒng)穩(wěn)定性的方法。
[0007](二)技術(shù)方案
一種基于雙阻遏策略增強(qiáng)大腸桿菌T7表達(dá)系統(tǒng)穩(wěn)定性的方法，首先構(gòu)建了表達(dá)長(zhǎng)野芽胞桿菌naganoensis^ CCTCC M 2012388普魯蘭酶的重組大腸桿菌萬.BL21 (DE3) / pET-20b (+) -pul，該重組菌攜帶的表達(dá)載體pET_20b (+)不含有Iac操縱子和阻遏物基因IacI。在誘導(dǎo)表達(dá)過程中發(fā)現(xiàn)報(bào)道蛋白存在本底表達(dá)，并且重組菌的冷凍甘油管在凍存過程中表達(dá)水平不斷下降，表明表達(dá)系統(tǒng)存在不穩(wěn)定的現(xiàn)象。因此使用含有Iac操縱子和阻遏物基因IacI的載體pET_22b (+)及pET_28a (+)，利用Iac操縱子嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾p阻遏調(diào)控策略，構(gòu)建了重組菌萬.co7iBL21/ pET-22b (+)-pul和萬.co7iBL21/pET-28a(+)-PelB- pul。比較了三株重組大腸桿菌的本底表達(dá)水平、冷凍甘油管表達(dá)量穩(wěn)定性和乳糖自誘導(dǎo)后的目標(biāo)蛋白表達(dá)量。
[0008]( I)普魯蘭酶基因的獲得
長(zhǎng)野芽孢桿菌naganoensis) CCTCC M 2012388 培養(yǎng)基:CaCl2 0.25 g/L,MgSO4.7Η20 0.5 g/L, (NH4)2SO4 0.2 g/L，酵母提取物 2 g/L，無水葡萄糖 5 g/L, KH2PO4 3g/L,無機(jī)鹽溶液I mL/L, pH 5.0,雙蒸水配制。
[0009]無機(jī)鹽溶液=ZnSO4.7H20 0.1 g/L, MnCl2.H2O 0.03 g/L, H3BO3 0.3 g/L,CoCl2.6H20 0.2 g/L, CuCl2.2H20 0.01 g/L, NiCl2.6H20 0.02 g/L, Na2MoO4.2H20 0.03g/L,雙蒸水配制。
[0010]將長(zhǎng)野芽孢桿菌UaciBw1S naganoensis) CCTCC M 2012388菌種接種于含有25mL培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，于37°C、200 rpm振蕩培養(yǎng)72小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，將菌體離心并用生理鹽水洗漆兩次，收集細(xì)胞利用基因組DNA提取試劑盒Genomic DNA ExtractionMiniprep System (VIOGENE 公司)提取基因組。
[0011]引物1:5，- gaacaGGATCCagatgggaacaccacaaaC _3，，
引物 2:5，- attccctcgagtttaccatcagatgggct _3，。
[0012]引物I含有BamHl限制性酶切位點(diǎn)，引物2含有Xho I限制性酶切位點(diǎn)。
[0013]PCR 反應(yīng)體系:ddH20 37 μ L，10 X Reaction Buffer 5 μ L, dNTP(25 mmol/L)0.5yL，引物 I (50 pmol/μ L) I yL，引物 2 (50 pmol/μ L) I μ L，基因組 DNA 5 μ L，TaqDNA polymerase (5 U/μ L) 0.5 μ L。
[0014]以長(zhǎng)野芽孢桿菌naganoensis') CCTCC M 2012388基因組為模板,米用PCR方法擴(kuò)增普魯蘭酶基因。PCR反應(yīng)過程:95°C預(yù)變性5 min ；95°C I min,60°C 0.5 min、72°C 2 min，進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 10 min。
[0015]利用3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit(上海申能博彩生物科技有限公司)純化DNA片斷。[0016]DNA溶液中加入1/10體積的乙酸鈉溶液(3 mol/L, pH 5.2)和2倍體積無水乙醇，-20°C沉淀I小時(shí)。12000 rpm于4°C離心30 min。加入75%乙醇500 μ L洗滌，12000rpm于4°C離心30 min，無菌操作臺(tái)吹干后溶于適量TE緩沖液中，立即使用或_20°C保存。
[0017](2)含有普魯蘭酶基因的重組大腸桿菌的構(gòu)建 a> pET-20b (+) -pul 的構(gòu)建
利用質(zhì)粒提取試劑盒Min1-Plasmid Rapid Isolation Kit (北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司)提取質(zhì)粒pET20b (+)。
[0018]按照水、緩沖液、PCR產(chǎn)物或質(zhì)粒DNA、酶的順序加到Eppendorf管中，蓋好管蓋，振蕩使液體充分混勻，置于離心機(jī)內(nèi)離心2秒鐘使液體集中于管底，37°C水浴3小時(shí)，在管中加入1/10體積的Loading Buffer或?qū)⒐苤糜?5°C保溫10分鐘，終止酶切反應(yīng)。酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析并切膠回收目的片段，濃縮。
[0019]反應(yīng)體系組成:10XHBuffer 4 μ L，DNA 10 μ L, BamHl 2 μ L, Xhol 2 μ L,ddH20將體系補(bǔ)足40 μ L0
[0020]目的基因與質(zhì)粒pET20b(+)的連接
將普魯蘭酶基因與質(zhì)粒pET20b(+)連接，反應(yīng)體系組成如下:質(zhì)粒pET-20b(+) 0.8μ L，普魯蘭酶基因4.2 μ L, Ligation Solution 5 μ L0混合連接液，將其置于16°C培養(yǎng)箱中連接反應(yīng)12小時(shí)。
[0021 ] 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌
在100 μ L大腸桿菌萬.coli BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入10 μ L連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰浴中靜置30分鐘。轉(zhuǎn)入42°C水浴中，熱擊90秒。快速轉(zhuǎn)移至冰浴中，冷卻2分鐘。加入700 μ L的LB液體培養(yǎng)基，37°C、100 rpm搖床溫育培養(yǎng)I小時(shí)。培養(yǎng)后菌液3000rpm離心2分鐘，棄上清600 μ L，剩余菌液混勻后涂布到含有50 μ g/mL氨芐抗生素的LB平板上，37°C倒置培養(yǎng)。獲得含有目的普魯蘭酶基因的重組大腸桿菌疋coli BL21 (DE3)/pET-20b (+) -pul。
[0022]b、pET-22b (+) -pul 和 pET_28a (+) -PelB- pul 的構(gòu)建
將重組質(zhì)粒pET-20b (+)-/^/7和表達(dá)載體pET-28a(+)、pET_22b (+)分別用限制性內(nèi)切酶油al和通ol分步單酶切。按照水、緩沖液、質(zhì)粒、酶的順序加到Eppendorf管中，蓋好管蓋，振蕩使液體充分混勻，置于離心機(jī)內(nèi)離心2秒使液體集中于管底，37°C水浴3小時(shí)，在管中加入1/10體積的Loading Buffer或?qū)⒐苤糜?5°C保溫10分鐘，終止酶切反應(yīng)。酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析并切膠回收目的片段，濃縮。反應(yīng)體系組成:10XH Buffer 4μ L, DNA 10 μ I, IbaI 2 μ Ι,Ι?οΙ 2 μ L，ddH20 將體系補(bǔ)足 40 μ L。
[0023]將膠回收線性化的目標(biāo)片段分別與pET_28a(+)及pET_22b (+)載體連接，反應(yīng)體系組成如下:質(zhì)粒載體I μ L,目標(biāo)片段4 μ L, Ligation Solution 5 μ L。混合連接液,將其置于16°C培養(yǎng)箱中連接反應(yīng)12小時(shí)。
[0024]重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌
在100 μ L大腸桿菌E.coli BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入10 μ L連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰浴中靜置30分鐘。轉(zhuǎn)入42°C水浴中，熱擊90秒。快速轉(zhuǎn)移至冰浴中，冷卻2分鐘。加入700 μ L的LB液體培養(yǎng)基，37°C、100 rpm搖床溫育培養(yǎng)I小時(shí)。培養(yǎng)后菌液3000rpm離心2分鐘，棄上清600 μ L，剩余菌液混勻后涂布到含有50 μ g/mL卡那霉素的LB平板上，37°C倒置培養(yǎng)。獲得含有目的普魯蘭酶基因的重組大腸桿菌萬.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-PelB-/w/7 及疋 coli BL21 (DE3)/pET_22b (+)-/?/人
[0025]雙阻遏效應(yīng)基本上消除了重組大腸桿菌的本底表達(dá)現(xiàn)象，重組大腸桿菌冷凍甘油管的表達(dá)顯示雙阻遏效應(yīng)可維持表達(dá)系統(tǒng)的穩(wěn)定性，及重組大腸桿菌自誘導(dǎo)表達(dá)的穩(wěn)定性得到提聞。
[0026]( 3 )、重組大腸桿菌的本底表達(dá)比較
LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L,NaCl 10 g/L，pH7.0，雙蒸水配制。需要時(shí)使用前加入氨節(jié)青霉素(100 μ g/mL)或卡那霉素(50 μ g/mL),固體培養(yǎng)基添加15 g/L瓊脂粉。
[0027]挑取新轉(zhuǎn)化的重組大腸桿菌單菌落接種于3 mL含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C、200 rpm振蕩培養(yǎng)過夜。取0.5 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于50 mL含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C、200 rpm振蕩培養(yǎng)至OD6tltl約為1.2。培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入20°C中繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，將發(fā)酵液于10000 rpm離心10分鐘，菌體沉淀超聲破碎，破碎液于12000rpm離心20分鐘，取上清液用于胞內(nèi)普魯蘭酶酶活測(cè)定。
[0028]經(jīng)酶活檢測(cè)，厶coli BL21(DE3)/pET-20b(+)-/w7的胞內(nèi)組分酶活約為1.9 U/mL，而萬.BL21 (DE3)/pET28a(+)-Pe 1B-/W/7 及萬.coli BL21(DE3) /pET-22b (+) -pul的胞內(nèi)組分則沒有測(cè)到酶活，表明由于表達(dá)載體pET-22b(+)和pET-28a(+)中的Iac操縱子和阻遏物基因IeicI的存在，阻遏物可同時(shí)結(jié)合于大腸桿菌染色體上T7基因上游的Iac操縱子和表達(dá)載體的Iac操縱子上，這種雙阻遏效應(yīng)基本上消除了本底表達(dá)現(xiàn)象。
[0029]普魯蘭酶測(cè)定方法` 取100 μ L用100 mM、pH 5.0的醋酸緩沖液適當(dāng)稀釋的酶液與等體積的溶于100 mM、pH 5.0醋酸緩沖液中的10 g/L普魯蘭相混合于50 °C水浴中保溫30分鐘。加入DNS試劑300 μ L搖勻，置于沸水中煮沸15分鐘，取出以流動(dòng)水迅速冷卻后，于540 nm波長(zhǎng)處，以0.5 cm比色杯，測(cè)定反應(yīng)液的吸光度值。
[0030]酶活單位定義:在上述指定的條件下，每分鐘催化分解普魯蘭多糖生成相當(dāng)于Iμ mo I葡萄糖的還原糖所需的酶為I個(gè)酶活單位(U)。
[0031](4)、重組大腸桿菌冷凍甘油管的表達(dá)穩(wěn)定性比較
三種重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化萬.co7i BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出后立刻接種于3 mL含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C、200 rpm振蕩培養(yǎng)過夜。取0.5 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于50 mL含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C、200 rpm振蕩培養(yǎng)至OD6tltl約為1.2。培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入20°C中繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，將發(fā)酵液于10000 rpm離心10分鐘，上清留樣為胞外組分。菌體沉淀超聲破碎，破碎液于12000 rpm離心20分鐘，取上清液為胞內(nèi)組分。測(cè)定胞內(nèi)外酶活結(jié)果為第一批的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果。剩余試管種子液用于保存冷凍甘油管，于_70°C中冷凍保存。分別在凍存2天及4天后取出用于第二、第三批誘導(dǎo)表達(dá)。測(cè)定比較各工程菌的胞內(nèi)外總酶活。
[0032]比較不同發(fā)酵批次的酶活結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著在-70°C中凍存天數(shù)的增加，E.coliBL21(DE3)/pET-20b {+)~pul的產(chǎn)酶能力不斷下降。菌種在_70°C中凍存4天，在LB培養(yǎng)基中發(fā)酵后胞內(nèi)酶活下降到新轉(zhuǎn)化菌種發(fā)酵酶活的38%，說明該工程菌在凍存狀態(tài)下性能不穩(wěn)定，目標(biāo)蛋白的表達(dá)能力會(huì)迅速下降。而萬.coli BL21 (DE3)/pET_22b (+)和疋coliBL21 (DE3) /pET-28a (+) -PelB- /^/7的酶活水平則一直約為15 U/mL，即一直保持著最初的產(chǎn)酶能力，說明載體中Iac操縱子產(chǎn)生的雙阻遏效應(yīng)可維持表達(dá)系統(tǒng)的穩(wěn)定性，使這兩株工程菌在凍存狀態(tài)下可保持正常的產(chǎn)酶性能。
[0033]( 5 )、重組大腸桿菌自誘導(dǎo)表達(dá)的比較
自誘導(dǎo)培養(yǎng)基(g/L):β_乳糖I~50，無水葡萄糖0.5，甘油5，KH2PO4 6.8，MgSO4 0.24，胰蛋白胨10，酵母提取物5，Na2HPO4 7.LNa2SO4 0.71，NH4Cl 2.67，痕量元素溶液400 μ L/L, pH 7.5^8.0,雙蒸水配制。
[0034]痕量元素溶液(g/L)=FeCl3 8.125，CaCl2 2.22, MnCl2 2.52, ZnSO4 1.61, CoCl20.26，CuCl2 0.27，NiCl2 0.26，Na2MoO4 0.41，Na2SeO3 0.346，H3BO3 0.124，HCl 2.19，雙蒸水配制。
[0035]三種重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化萬.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出后立刻接種于3 mL含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C、200 rpm振蕩培養(yǎng)過夜。取2mL培養(yǎng)液接種于50mL含相應(yīng)抗生素的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，37°C、200rpm下培養(yǎng)2小時(shí)后轉(zhuǎn)入20°C中繼續(xù)培養(yǎng)70小時(shí)。分別測(cè)定胞內(nèi)外酶活水平。
[0036]發(fā)酵結(jié)束后，厶coli BL21(DE3)/pET-20M+)-/^7的胞內(nèi)外總酶活為23 U/mL,而厶 coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-/w7 及萬.coli BL21(DE3)/ pET_28a (+)-PelB-/w7 的總酶活均為550 U/mL，表明由于載體中Iac操縱子的雙阻遏效應(yīng)消除了目標(biāo)蛋白的本底表達(dá)，表達(dá)系統(tǒng)的穩(wěn)定性得到提高，使菌種在發(fā)酵過程中也能保持目標(biāo)蛋白的表達(dá)能力，不會(huì)發(fā)生退化。
[0037](三)有益效果
成功克隆了長(zhǎng)野芽孢桿菌naganoensis ) CCTCC NO:M 2012388普魯蘭酶編碼基因，該基因全長(zhǎng)2781 bp，編碼926個(gè)氨基酸殘基，其基因的核苷酸序列為:SEQ ID NO:1，其氨基酸組成為SEQ ID NO:2。利用不含有操縱子和阻遏物基因hc/的載體pET-20b(+)構(gòu)建了含有普魯蘭酶基因的重組大腸桿菌疋coli BL21(DE3) /pET-20b (+) -pul，利用含有Iac操縱子和阻遏物基因IacI的載體pET_28a (+)和pET-22b⑴分別構(gòu)建了含有普魯蘭酶基因的重組大腸桿菌疋coli BL21 (DE3) /pET-28a(+)-PelB-/w/7 和萬.coli BL21 (DE3)/pET_22b (+)-/?/人
[0038]使用不含操縱子和阻遏物基因的pET載體系統(tǒng)疋coli BL21(DE3)/pET-20b (+) -pul表達(dá)毒性報(bào)道蛋白時(shí)，發(fā)現(xiàn)存在明顯的本底表達(dá)和隨之引起的表達(dá)系統(tǒng)不穩(wěn)定的現(xiàn)象。表達(dá)系統(tǒng)的不穩(wěn)定引起了重組菌冷凍甘油管的表達(dá)水平下降和在自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中表達(dá)量偏低的問題。通過使用含有he操縱子和阻遏物基因的pET載體系統(tǒng)疋coliBL21 (DE3) /pET-22b (+) -pul 和萬.coli BL21 (DE3)/pET-28a(+)-PelB-/w7，毒性報(bào)道蛋白的本底表達(dá)基本被消除，重組菌冷凍甘油管的蛋白表達(dá)能力得到穩(wěn)定，在自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的蛋白表達(dá)量大幅提高。表明Iac操縱子嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾p阻遏調(diào)控策略，增強(qiáng)了大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。這些工作為增強(qiáng)重組大腸桿菌的系統(tǒng)穩(wěn)定性提供了有效策略，對(duì)高效表達(dá)目標(biāo)蛋白具有重要意義。
[0039]該長(zhǎng)野芽抱桿菌naganoensis)CCTCC M 2012388 ;保藏單位:中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡(jiǎn)寫CCTCC，地址:中國武漢武漢大學(xué)，保藏編號(hào)CCTCC NO:M 2012388，保藏日期為2012年9月28日。在以前專利申請(qǐng)中已用過，“一種基因重組大腸桿菌及其高效生產(chǎn)普魯蘭酶的方法”，申請(qǐng)?zhí)?01210481749.3，申請(qǐng)日2012年11月24日。
【具體實(shí)施方式】
[0040]實(shí)施例1
LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L,NaCl 10 g/L，pH7.0，雙蒸水配制。需要時(shí)使用前加入氨節(jié)青霉素(100 μ g/mL)或卡那霉素(50 μ g/mL),固體培養(yǎng)基添加15 g/L瓊脂粉。
[0041]挑取新轉(zhuǎn)化的疋coli BL21(DE3)/pET-20b (+)-/^/7單菌落接種于3 mL含卡那霉素(50 μ g/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C、200 rpm振蕩培養(yǎng)過夜。取0.5 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于50 mL含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C、200 rpm振蕩培養(yǎng)至0D_約為1.2。培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入20°C中繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，將發(fā)酵液于10000 rpm離心10分鐘，菌體沉淀超聲破碎，破碎液于12000 rpm離心20分鐘，取上清液為胞內(nèi)組分，普魯蘭酶酶活為 1.9 U/mL ο 而萬.coli BL21 (DE3)/pET28a(+)-PelB-/w7 及疋 coli BL21(DE3) /pET-22b (+) -pul的胞內(nèi)組分則沒有測(cè)到酶活。
[0042]實(shí)施例2
LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L,NaCl 10 g/L，pH7.0，雙蒸水配制。需要時(shí)使用前加入氨節(jié)青霉素(100 μ g/mL)或卡那霉素(50 μ g/mL),固體培養(yǎng)基添加15 g/L瓊脂粉。
[0043]重組質(zhì)粒pET_20b (+) -pul轉(zhuǎn)化萬.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出后立刻接種于3 mL含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C、200 rpm振蕩培養(yǎng)過夜。取0.5 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于50 mL含相應(yīng)抗 生素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C、200 rpm振蕩培養(yǎng)至0D_約為1.2。培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入20°C中繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，將發(fā)酵液于10000 rpm離心10分鐘，上清留樣為胞外組分。菌體沉淀超聲破碎，破碎液于12000 rpm離心20分鐘，取上清液為胞內(nèi)組分。胞內(nèi)外總酶活為15 U/mL，作為第一批的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果。剩余試管種子液用于保存冷凍甘油管，于_70°C中冷凍保存。分別在凍存2天和4天后取出用于第二、第三批誘導(dǎo)表達(dá)，酶活結(jié)果分別為8.6 U/mL和5.1 U/mL。而萬.coli BL21(DE3)/pET-22b (+) -pul 和萬.coli BL21 (DE3) /pET_28a (+) -PelB- pul 的酶活水平則一直約為 15U/mL ο
[0044]實(shí)施例3
自誘導(dǎo)培養(yǎng)基(g/L):β_乳糖I~50，無水葡萄糖0.5，甘油5，KH2PO4 6.8，MgSO4 0.24，胰蛋白胨10，酵母提取物5，Na2HPO4 7.LNa2SO4 0.71，NH4Cl 2.67，痕量元素溶液400 μ L/L, pH 7.5^8.0,雙蒸水配制。
[0045]痕量元素溶液(g/L)=FeCl3 8.125，CaCl2 2.22, MnCl2 2.52, ZnSO4 1.61, CoCl20.26，CuCl2 0.27，NiCl2 0.26，Na2MoO4 0.41，Na2SeO3 0.346，H3BO3 0.124，HCl 2.19，雙蒸水配制。
[0046]重組質(zhì)粒pET_22b (+) -pul轉(zhuǎn)化萬.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出后立刻接種于3 mL含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C、200 rpm振蕩培養(yǎng)過夜。取2mL培養(yǎng)液接種于50mL含相應(yīng)抗生素的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，37°C、200rpm下培養(yǎng)2小時(shí)后轉(zhuǎn)入20°C中繼續(xù)培養(yǎng)70小時(shí)。測(cè)得胞內(nèi)外總酶活為23 U/mL。而疋coli BL21 (DE3) /pET-22b (+) -pulRE.coli BL21(DE3)/ pET-2 8a(+)-PelB-/7?7 的總酶活均為 550 U/mL。
【權(quán)利要求】
1.一種基于雙阻遏策略增強(qiáng)大腸桿菌T7表達(dá)系統(tǒng)穩(wěn)定性的方法，其特征在于:以來源于長(zhǎng)野芽孢桿菌心naganoensis) CCTCC M 2012388的普魯蘭酶為表達(dá)蛋白，使用含有操縱子和阻遏物基因IacI的pET表達(dá)載體pET_22b (+)及pET_28a (+)，利用Iac操縱子嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾p阻遏調(diào)控策略，構(gòu)建了重組菌萬.co7iBL21/pET-22b (+) -pul RE.co7iBL21/pET-28a(+)-PelB- /^/7，作為對(duì)照，構(gòu)建了不含有操縱子和阻遏物基因IacI的表達(dá)系統(tǒng)萬.coli BL21(DE3)/ pET-20b (+) -pul ;步驟為: (1)普魯蘭酶基因的獲得
長(zhǎng)野芽孢桿菌naganoensis) CCTCC M 2012388 培養(yǎng)基:CaCl2 0.25 g/L,MgSO4.7Η20 0.5 g/L, (NH4)2SO4 0.2 g/L，酵母提取物 2 g/L，無水葡萄糖 5 g/L, KH2PO4 3g/L,無機(jī)鹽溶液I mL/L, pH 5.0,雙蒸水配制；
無機(jī)鹽溶液=ZnSO4.7H20 0.1 g/L, MnCl2.H2O 0.03 g/L, H3BO3 0.3 g/L, CoCl2.6H20.0.2 g/L, CuCl2.2H20 0.01 g/L, NiCl2.6H20 0.02 g/L, Na2MoO4.2H20 0.03 g/L，雙蒸水配制； 將長(zhǎng)野芽孢桿菌UaciBm naganoensis ) CCTCC M 2012388菌種接種于含有25 mL培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，于37°C、200 rpm振蕩培養(yǎng)72小時(shí)，培養(yǎng)結(jié)束后，將菌體離心并用生理鹽水洗滌兩次，收集細(xì)胞利用V10GENE公司的基因組DNA提取試劑盒Genomic DNAExtraction Miniprep System 提取基因組； 引物1:5’ -gaa caG GAT CCa gat ggg aac acc aca aaC _3，，
弓丨物2:5，- att ccc tcg agt tta cca tea gat ggg ct _3’ ； 引物I含韋BamHl限制性酶切位點(diǎn)，引物2含有通ο I限制性酶切位點(diǎn)； PCR 反應(yīng)體系:ddH20 37 μ L，10 X Reaction Buffer 5 μ L,25 mmol/L 的 dNTP 0.5μ L,50 pmol/yL 的引物 I I yL，50 pmol/yL 的引物 2 I μ L，基因組 DNA 5 yL,5 U/μ L 白勺 Taq DNA polymerase 0.5 μ L ； 以長(zhǎng)野芽孢桿菌CCTCC M 2012388基因組為模板，采用PCR方法擴(kuò)增普魯蘭酶基因，PCR反應(yīng)過程:95°C預(yù)變性5 min ；95°C I min,60°C 0.5 min、72°C 2 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72°C延伸 10 min ； 利用上海申能博彩生物科技有限公司的3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit純化DNA片斷； DNA溶液中加入1/10體積的pH 5.2,3 mol/L的乙酸鈉溶液和2倍體積無水乙醇，-20°C沉淀I小時(shí)，12000 rpm于4°C離心30 min，加入75%乙醇500 μ L洗滌，12000rpm于4°C離心30 min，無菌操作臺(tái)吹干后溶于適量TE緩沖液中，立即使用或_20°C保存； (2)含有普魯蘭酶基因的重組大腸桿菌的構(gòu)建 a> pET-20b (+) -pul 的構(gòu)建 利用北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司的質(zhì)粒提取試劑盒Min1-Plasmid RapidIsolation Kit 提取質(zhì)粒 pET_20b (+)； 按照水、緩沖液、PCR產(chǎn)物或質(zhì)粒DNA、酶的順序加到Eppendorf管中，蓋好管蓋，振蕩使液體充分混勻，置于離心機(jī)內(nèi)離心2秒鐘使液體集中于管底，37°C水浴3小時(shí)，在管中加入1/10體積的Loading Buffer或?qū)⒐苤糜?5°C保溫10分鐘，終止酶切反應(yīng)，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析并切膠回收目的片段，濃縮；反應(yīng)體系組成:10 XH Buffer 4 μ L,DNA 10 μ L,BamHl 2 μ L,Xhol 2 μ L，ddH20 將體系補(bǔ)足40 μ L ； 目的基因與質(zhì)粒pET-20b (+)的連接 將普魯蘭酶基因與質(zhì)粒pET-20b(+)連接，反應(yīng)體系組成如下:質(zhì)粒pET-20b(+) 0.8μ L，普魯蘭酶基因4.2 yL,Ligation Solution 5 μ L ;混合連接液，將其置于16°C培養(yǎng)箱中連接反應(yīng)12小時(shí)； 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 在100 μ L大腸桿菌疋BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入10 μ L連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰浴中靜置30分鐘，轉(zhuǎn)入42°C水浴中，熱擊90秒，快速轉(zhuǎn)移至冰浴中，冷卻2分鐘，加入700 μ L的LB液體培養(yǎng)基，370C、100 rpm搖床溫育培養(yǎng)I小時(shí)，培養(yǎng)后菌液3000rpm離心2分鐘，棄上清600 μ L，剩余菌液混勻后涂布到含有50 μ g/mL氨芐抗生素的LB平板上，37°C倒置培養(yǎng)，獲得含有目的普魯蘭酶基因的重組大腸桿菌疋coli BL21 (DE3)/pET-20b (+) -pul ；
b、pET-22b (+) -pul 和 pET_28a (+) -PelB- pul 的構(gòu)建 將重組質(zhì)粒pET-20b (+)-/^/7和表達(dá)載體pET-28a(+)、pET_22b (+)分別用限制性內(nèi)切酶油al和通ol分步單酶切，按照水、緩沖液、質(zhì)粒、酶的順序加到Eppendorf管中，蓋好管蓋，振蕩使液體充分混勻，置于離心機(jī)內(nèi)離心2秒使液體集中于管底，37°C水浴3小時(shí)，在管中加入1/10體積的Loading Buffer或?qū)⒐苤糜?5°C保溫10分鐘，終止酶切反應(yīng)，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析并切膠回收目的片段，濃縮；反應(yīng)體系組成:10XH Buffer 4μ L, DNA 10 μ I, IbaI 2 μ Ι,Ι?οΙ 2 μ L, ddH20 將體系補(bǔ)足 40 μ L ; 將膠回收線性化的目標(biāo)片段分別與pET-28a(+)及pET-22b(+)載體連接，反應(yīng)體系組成如下:質(zhì)粒載體I μ L,目標(biāo)片段4 μ L, Ligation Solution 5 μ L,混合連接液,將其置于16°C培養(yǎng)箱中連接反應(yīng)12小時(shí)； 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 在100 μ L大腸桿菌疋BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入10 μ L連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰浴中靜置30分鐘，轉(zhuǎn)入42°C水浴中，熱擊90秒:快速轉(zhuǎn)移至冰浴中，冷卻2分鐘；加入700 μ L的LB液體培養(yǎng)基，370C、100 rpm搖床溫育培養(yǎng)I小時(shí)，培養(yǎng)后菌液3000rpm離心2分鐘，棄上清600 μ L，剩余菌液混勻后涂布到含有50 μ g/mL卡那霉素的LB平板上，37°C倒置培養(yǎng)，獲得含有目的普魯蘭酶基因的重組大腸桿菌萬.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-PelB-/w/7 及疋 coli BL21 (DE3) /pET-22b (+) -pul ； 雙阻遏效應(yīng)基本上消除了重組大腸桿菌的本底表達(dá)現(xiàn)象，重組大腸桿菌冷凍甘油管的表達(dá)顯示雙阻遏效應(yīng)可維持表達(dá)系統(tǒng)的穩(wěn)定性，及重組大腸桿菌自誘導(dǎo)表達(dá)的穩(wěn)定性得到提聞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于雙阻遏策略增強(qiáng)大腸桿菌T7表達(dá)系統(tǒng)穩(wěn)定性的方法，其特征在于:重組大腸桿菌的本底表達(dá)比較； 挑取新轉(zhuǎn)化的重組大腸桿菌單菌落接種 于3 mL含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，于370C >200 rpm振蕩培養(yǎng)過夜；取0.5 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于50 mL含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C、200 rpm振蕩培養(yǎng)至OD6tltlS 1.2 ;培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入20°C中繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)，培養(yǎng)結(jié)束后，將發(fā)酵液于10000 rpm離心10分鐘，菌體沉淀超聲破碎，破碎液于12000 rpm離心20分鐘，取上清液用于胞內(nèi)普魯蘭酶酶活測(cè)定；經(jīng)酶活檢測(cè)，厶coli BL21 (DE3) /pET_20b (+) -pul的胞內(nèi)組分酶活為1.9 U/mL，而E.coli BL21 (DE3) /pET_28a (+) -?el^>-pul RE.coli BL21 (DE3) / pET_22b (+) -pul 的胞內(nèi)組分則沒有測(cè)到酶活，表明由于表達(dá)載體pET-22b(+)及pET-28a(+)中的操縱子和阻遏物基因IacI的存在，阻遏物可同時(shí)結(jié)合于大腸桿菌染色體上T7基因上游的Iac操縱子和表達(dá)載體的Iac操縱子上，這種雙阻遏效應(yīng)基本上消除了本底表達(dá)現(xiàn)象。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于雙阻遏策略增強(qiáng)大腸桿菌T7表達(dá)系統(tǒng)穩(wěn)定性的方法，其特征在于:重組大腸桿菌冷凍甘油管的表達(dá)穩(wěn)定性比較； 三種重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化萬.co7i BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出后立刻接種于3 mL含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C、200 rpm振蕩培養(yǎng)過夜；取0.5 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于50 mL含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C、200 rpm振蕩培養(yǎng)至OD6tltl約為1.2 ;培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入20°C中繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)；培養(yǎng)結(jié)束后，將發(fā)酵液于10000 rpm離心10分鐘，上清留樣為胞外組分；菌體沉淀超聲破碎，破碎液于12000 rpm離心20分鐘，取上清液為胞內(nèi)組分；測(cè)定胞內(nèi)外酶活結(jié)果為第一批的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果，剩余試管種子液用于保存冷凍甘油管，于-70°C中冷凍保存，分別在凍存2天及4天后取出用于第二、第三批誘導(dǎo)表達(dá)，測(cè)定比較各工程菌的胞內(nèi)外總酶活； 比較不同發(fā)酵批次的酶活結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著在-70°C中凍存天數(shù)的增加，疋coliBL21(DE3)/pET-20b {+)~pul的產(chǎn)酶能力不斷下降，菌種在_70°C中凍存4天，在LB培養(yǎng)基中發(fā)酵后胞內(nèi)酶活下降到新轉(zhuǎn)化菌種發(fā)酵酶活的38%，說明該工程菌在凍存狀態(tài)下性能不穩(wěn)定，目標(biāo)蛋白的表達(dá)能力會(huì)迅速下降；而萬.coli BL21 (DE3)/pET-22b(+)-/w/7&i?.coliBL21 (DE3) /pET-28a (+) -PelB- /^/7的酶活水平則一直為15 U/mL，即一直保持著最初的產(chǎn)酶能力，說明載體中Iac操縱子產(chǎn)生的雙阻遏效應(yīng)可維持表達(dá)系統(tǒng)的穩(wěn)定性，使這兩株工程菌在凍存狀態(tài)下可保持正常的產(chǎn)酶性能。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于雙阻遏策略增強(qiáng)大腸桿菌T7表達(dá)系統(tǒng)穩(wěn)定性的方法，其特征在于:重組大腸桿菌自誘導(dǎo)表達(dá)的比較； 自誘導(dǎo)培養(yǎng)基g/L: β -乳糖I~50，無水葡萄糖0.5，甘油5，KH2PO4 6.8，MgSO4 0.24，胰蛋白胨 10，酵母提取物 5，Na2HPO4 7.1,Na2SO4 0.71 ,NH4Cl 2.67，痕量元素溶液 400 μ L/L，pH 7.5^8.0,雙蒸水配制；
痕量元素溶液 g/L =FeCl3 8.125，CaCl2 2.22，MnCl2 2.52，ZnSO4 1.61，CoCl2 0.26，CuCl2 0.27，NiCl2 0.26，Na2MoO4 0.41，Na2SeO3 0.346，H3BO3 0.124，HCl 2.19，雙蒸水配制； 三種重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化萬.co7i BL21感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出后立刻接種于3 mL含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C、200 rpm振蕩培養(yǎng)過夜；取2mL培養(yǎng)液接種于50mL含相應(yīng)抗生素的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，37°C、200rpm下培養(yǎng)2小時(shí)后轉(zhuǎn)入20°C中繼續(xù)培養(yǎng)70小時(shí)，分別測(cè)定胞內(nèi)外酶活水平； 發(fā)酵結(jié)束后，S coli BL21(DE3)/pET-20b(+)-/?7的胞內(nèi)外總酶活為23 U/mL，而S coliBL21 (DE3) /pET-22b (+) -pul RE.coli BL21 (DE3) / pET_28a (+) -?el^>-pul 的總酶活均為 550U/mL，表明由于載體中Iac操縱子的雙阻遏效應(yīng)消除了目標(biāo)蛋白的本底表達(dá)，表達(dá)系統(tǒng)的穩(wěn)定性得到提高，使菌種在發(fā)酵過程中也能保持目標(biāo)蛋白的表達(dá)能力，不會(huì)發(fā)生退化。
【文檔編號(hào)】C12R1/19GK103555751SQ201310505664
【公開日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月24日
【發(fā)明者】聶堯, 徐巖 申請(qǐng)人:江南大學(xué)