專利名稱：一種基于大腸桿菌原核表達系統的制備死亡素的方法
技術領域：
本發明涉及到用大腸桿菌的原核表達系統制備死亡素，屬于基因工程技術領域。
背景技術：
死亡素(thanatin)又稱死亡肽，是在昆蟲斑腹刺益蝽(Podisus maculiventris)中發現的，迄今為止在所有已知昆蟲抗菌肽中，抗菌譜最廣、抗菌活性最強的抗菌蛋白，由21個氨基酸殘基組成，結構簡單，具有抗腫瘤活性，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和某些真菌都有抑制作用，對哺乳動物細胞不表現出溶血性。然而，天然抗菌肽在昆蟲體內含量甚微，分離提純難度大，得率低。而目前的相關研究表明，采用分子生物學和基因工程方法在微生物中直接表達抗菌肽基因，可能造成宿 主微生物自殺而不能獲得表達產物，且易被蛋白酶降解，近期尚不能直接進行工業化生產。因此很有必要對已有的抗菌肽進行結構的修飾加工，或探索一種新型的技術路線進行大規模生產。

發明內容
由于大腸桿菌表達系統具有生長快、遺傳背景清晰、表達水平高、產物易純化、穩定性好、抗污染能力強、適用范圍廣以及成本低的特點，是理想的外源蛋白表達系統，為了克服現有技術的不足，本發明公開了一種基于大腸桿菌原核表達系統的制備死亡素的方法。本發明采用了如下技術方案
本發明提供一種重組基因，包括依次相連的融合伴侶基因序列、甲硫氨酸密碼子、死亡素重復序列和終止密碼子；死亡素重復序列由廣15個死亡素基因串聯而成，死亡素基因序列由死亡素的氨基酸序列逆推而來。作為優選，融合伴侶基因序列前還設有導肽序列，這樣翻譯出來的重組蛋白主要積累于宿主的周質空間，不會對宿主造成傷害。作為優選，所述融合伴侶基因序列為多角體蛋白基因從起始密碼子開始的90個堿基序列；融合伴侶的作用是促進死亡素的表達，有利于形成包涵體蛋白。本發明還提供包含上述重組基因的原核表達質粒。本發明還提供包含上述原核表達質粒的大腸桿菌。本發明還提供了制備死亡素的方法，包括如下步驟
(1)誘導如上所述的大腸桿菌內表達重組蛋白；
(2)分離純化重組蛋白；
(3)用溴化氰處理，將重組蛋白切割成多個獨立完整的死亡素；
(4)分離純化死亡素。本發明的原理如下
溴化氰具有專一性裂解甲硫氨酸殘基的羧基側肽鍵的性質；由于死亡素C末端的最后一個氨基酸殘基為甲硫氨酸，內部無甲硫氨酸，另外由于在死亡素重復序列的5端設有甲硫氨酸密碼子，故用溴化氰處理重組蛋白能得到多個獨立完整的死亡素；而融合伴侶內含有甲硫氨酸，因此被切割成多個小片段，方便與死亡素進行分離。本發明的創新之處在于，通過溴化氰裂解，可一次性獲得多個獨立完整的死亡素；為了提高蛋白的表達量，將死亡素和融合伴侶融合表達，這為死亡素快速、有效、大量的制備提供了新思路、新途徑，同時為相關領域的科學研究和藥物開發等方面奠定了良好的基礎，同時還避免了對宿主的毒性作用。


圖I為重組蛋白SDS-PAGE檢測圖，其中，Lane M :低分子量蛋白質標準；Lane I 未誘導空載體；Lane 2 :誘導后空載體；Lane 3 :未誘導重組菌；Lane4 :誘導后重組菌，黑色箭頭所示為重組蛋白。圖2為重組基因全序列圖黑框表示的序列分別為甲硫氨酸密碼子和終止密碼 子，二者之間為5重序基因序列；單下劃線部分為導肽序列，雙下劃線部分為多角體蛋白基因從起始密碼子開始的90個堿基序列。
具體實施例方式下面結合實施例詳細闡述本發明的具體內容。實驗例I構建重組質粒
化學合成重組基因，包括依次相連的導肽序列、多角體蛋白基因從起始密碼子開始的90個堿基序列、甲硫氨酸密碼子、死亡素重復序列和終止密碼子；死亡素重復序列由5個死亡素基因串聯而成，死亡素基因序列由死亡素的氨基酸序列逆推而來。重組基因序列見SEQID NO : I。將該重組基因裝載于表達載體，得到重組質粒。用Sanger法測序，以驗證重組基因序列的正確性。需要明確說明的是，構建原核表達質粒的方式有多種，是本領域普通技術人員容易做到的，化學合成重組基因后載入表達載體只是其中的一種方式而矣；另外，這里采用5個死亡素基因串聯，是為了操作、檢測的方便，以現有技術來看，廣15的死亡素基因串聯都是允許的。
實驗例2誘導重組蛋白的表達及SDS-PAGE檢測
用IPTG誘導含重組質粒的大腸桿菌表達重組蛋白，分離純化重組蛋白，并通過SDS-PAGE檢測重組蛋白的大小。如圖I所示，誘導后，重組蛋白表達非常明顯。分離純化的重組蛋白不包括導肽，導肽完成引導功能后，在大腸桿菌內被切除。包含導肽的完整的重組蛋白氨基酸序列見SEQ ID NO 2。
實驗例3用溴化氰處理重組蛋白
用溴化氰處理實驗例2得到的重組蛋白，將重組蛋白切割成多個獨立完整的死亡素；分離純化死亡素。
實驗例4檢測死亡素活性
大腸桿菌抑菌實驗表明實驗例3制備·的死亡素具有強抗菌活性。
權利要求
1.一種重組基因，其特征在于，包括依次相連的融合伴侶基因序列、甲硫氨酸密碼子、死亡素重復序列和終止密碼子；死亡素重復序列由廣15個死亡素基因串聯而成，死亡素基因序列由死亡素的氨基酸序列逆推而來。
2.如權利要求I所述的重組基因，其特征在于，融合伴侶基因序列前還設有導肽序列。
3.如權利要求I所述的重組基因，其特征在于，所述融合伴侶基因序列為多角體蛋白基因從起始密碼子開始的90個堿基序列。
4.含權利要求f3任一項所述重組基因的原核表達質粒。
5.含權利要求4所述重組基因的原核表達質粒的大腸桿菌。
6.一種制備死亡素的方法，包括如下步驟 (1)誘導如權利要求5所述的大腸桿菌內表達重組蛋白； (2)分離純化重組蛋白； (3)用溴化氰處理，將重組蛋白切割成多個獨立完整的死亡素； (4)分離純化死亡素。
全文摘要
本發明涉及到用大腸桿菌的原核表達系統制備死亡素，屬于基因工程技術領域。本發明一種重組基因，包括依次相連的融合伴侶基因序列、甲硫氨酸密碼子、死亡素重復序列和終止密碼子。本發明還提供含上述重組基因的原核表達質粒以及含該原核表達質粒的大腸桿菌。本發明還提供一種基于大腸桿菌原核表達系統的制備死亡素的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)誘導上述大腸桿菌表達重組蛋白；(2)分離純化重組蛋白；(3)用溴化氰處理，將重組蛋白切割成多個獨立完整的死亡素；(4)分離純化死亡素。本發明的創新之處在于，通過溴化氰裂解，可一次性獲得多個獨立完整的死亡素；而且死亡素表達量高。
文檔編號C12N1/21GK102943077SQ201210507640
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月30日 優先權日2012年11月30日
發明者陳利淼, 王濤, 劉云龍, 任飛, 呂正兵 申請人:杭州蠶寶生物技術有限公司