內(nèi)含a型流感病毒m基因裝甲rna標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種A型流感病毒核酸檢測(cè)裝甲R(shí)NA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是利用MS2噬菌體裝甲R(shí)NA技術(shù)，將A型流感病毒M基因用MS2噬菌體的衣殼蛋白包裝而成，本發(fā)明制備的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)具有穩(wěn)定、無(wú)生物傳染性、可真實(shí)模擬病毒粒子結(jié)構(gòu)、耐RNase等特性，適用于A型流感病毒以M基因?yàn)榘袠?biāo)的核酸檢測(cè)方法的質(zhì)量控制，以及檢測(cè)試劑和實(shí)驗(yàn)室能力的評(píng)價(jià)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】?jī)?nèi)含A型流感病毒M基因裝甲R(shí)NA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于疫病檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種內(nèi)含A型流感病毒M基因的裝甲R(shí)NA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，可用于針對(duì)A型流感病毒M基因建立的核酸檢測(cè)方法和試劑的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]A型流感病毒感染范圍很廣，能引起人和動(dòng)物流感的流行和大流行，歷史上多次流感的暴發(fā)均由A型流感病毒引起，如2004年?yáng)|南亞發(fā)生的高致病性禽流感和2009年席卷全球的甲型HlNl流感等。幾乎所有的動(dòng)物流感均由A型流感引起，主要有禽流感，豬流感，馬流感等。由于流感的發(fā)生對(duì)動(dòng)物和人類(lèi)健康構(gòu)成了巨大威脅，因此全球?qū)λ叨汝P(guān)注，雖然各國(guó)對(duì)動(dòng)物流感防制策略不盡相同，但都把動(dòng)物流感的快速診斷和及時(shí)監(jiān)測(cè)作為首要步驟。核酸檢測(cè)技術(shù)因具有快速、靈敏、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，已成為A型流感病毒的主要檢測(cè)技術(shù)，廣泛用于臨床樣品的檢測(cè)和分子流行病學(xué)調(diào)查。
[0003]A型流感病毒(Inf luenza Virus)屬于正粘病毒科(Orthomyxoviridae),為單股負(fù)鏈RNA病毒，其基因組由8個(gè)RNA節(jié)段組成，其中第7片段M基因最為保守，是流感病毒通用核酸檢測(cè)的主要靶基因。目前，國(guó)內(nèi)外針對(duì)A型流感病毒M基因建立了多種核酸檢測(cè)方法，其中應(yīng)用最多是RT-PCR和熒光RT-PCR方法，市場(chǎng)上也有多種不同廠家生產(chǎn)的核酸檢測(cè)試劑盒，這些試劑盒在檢測(cè)特異性、靈敏度等方面均有不同，直接影響檢測(cè)結(jié)果的一致性和準(zhǔn)確性。此外，目前A型流感病毒通用核酸檢測(cè)方法和試劑使用的質(zhì)控樣品多選擇滅活的全病毒、質(zhì)粒DNA和體外轉(zhuǎn)錄cRNA制備,滅活的全病毒存在生物安全隱患，裸露核酸又極易被廣泛存在的核酸酶降解，且不能實(shí)現(xiàn)核酸提取過(guò)程的有效監(jiān)控，難以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，研制一種既穩(wěn)定又沒(méi)有傳染性可用于A型流感病毒通用核酸檢測(cè)的質(zhì)控樣品和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)于其檢測(cè)方法和試劑的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化使用及臨床檢測(cè)具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有質(zhì)控樣品或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不足，利用MS2噬菌體裝甲R(shí)NA技術(shù)，制備了一種內(nèi)含A型流感病毒M基因裝甲R(shí)NA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)具有穩(wěn)定、無(wú)生物傳染性、可真實(shí)模擬病毒粒子結(jié)構(gòu)、耐RNase等特性，可用于多種A型流感病毒通用核酸檢測(cè)方法和試劑盒的質(zhì)量控制。
[0005]本發(fā)明提供的內(nèi)含A型流感病毒M基因裝甲R(shí)NA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是通過(guò)如下方案制備:
[0006]I)獲得用于A型流感病毒核酸檢測(cè)的M基因序列，如序列表中SEQ ID NO:1所示；
[0007]所述M基因可以通過(guò)合成或者RT-PCR擴(kuò)增獲得，該片段覆蓋了目前多數(shù)A型流感病毒通用核酸檢測(cè)方法和試劑盒檢測(cè)的區(qū)域。
[0008]2)將包含MS2噬菌體成熟酶蛋白基因和衣殼蛋白基因的序列及通過(guò)步驟I)獲得的M基因序列克隆于原核表達(dá)載體；
[0009]具體的:將MS2噬菌體基因組中5’非編碼區(qū)序列、成熟酶蛋白基因、衣殼蛋白基因、包裝位點(diǎn)和復(fù)制酶基因部分起始位點(diǎn)的cDNA序列克隆于原核表達(dá)載體pET32a中，在其下游插入M基因的cDNA序列，獲得表達(dá)載體pET32a-ACP-1VM。
[0010]3)將原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株中，誘導(dǎo)表達(dá)，然后采用超聲波裂解，離心，收集上清液，獲得表達(dá)產(chǎn)物；
[0011]具體的:將pET32a-ACP-1VM質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21 (DE3)，陽(yáng)性菌落接種到含氨芐霉素(100mg/L)LB液體培養(yǎng)基中，37°C、200r/min培養(yǎng)至0D600為0.6時(shí)加入異丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)至終濃度lmmol/L，誘導(dǎo)5h，收集菌體采用超聲波裂解處理(200W,間隔10s，共超聲作用30次)，12000r/min離心20min,收集上清液，用0.45 μ m微孔濾膜過(guò)濾，得到表達(dá)產(chǎn)物。 [0012]4)經(jīng)Cellufine Sulfate樹(shù)脂柱純化、聚乙二醇沉淀和DNase消化,去除殘留質(zhì)粒DNA,得到內(nèi)含A型流感病毒M基因裝甲R(shí)NA病毒樣顆粒(VLPs)。
[0013]5)將內(nèi)含流感病毒M基因的裝甲R(shí)NA病毒樣顆粒通過(guò)熒光定量RT-PCR方法定值，稀釋分裝，即得內(nèi)含A型流感病毒M基因裝甲R(shí)NA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。
[0014]發(fā)明人發(fā)現(xiàn)裝甲R(shí)NA VLPs的表達(dá)產(chǎn)物中會(huì)混雜有大量的細(xì)菌蛋白、核酸以及質(zhì)粒DNA，如果不去除將直接影響到質(zhì)控樣品的性能，特別是質(zhì)粒DNA，未經(jīng)核酸提取和反轉(zhuǎn)錄過(guò)程即可檢測(cè)為陽(yáng)性，即便只有微量殘留，在指數(shù)級(jí)擴(kuò)增后也會(huì)對(duì)結(jié)果構(gòu)成顯著影響。因此，要去除混雜的其他細(xì)菌組分和質(zhì)粒DNA。現(xiàn)有技術(shù)中通常使用蔗糖密度梯度離心對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，但該方法無(wú)法去除DNA，因此，本發(fā)明采用了 Cellufine Sulfate樹(shù)脂柱純化、聚乙二醇沉淀和DNase消化結(jié)合的方式，解決了上述技術(shù)問(wèn)題。
[0015]具體的:將獲得的表達(dá)產(chǎn)物用Cellufine sulfate樹(shù)脂柱純化，以去除混雜的其他細(xì)菌組分和質(zhì)粒DNA。取10倍柱體積的平衡緩沖液(含有0.1M氯化鈉的濃度為IOmM的磷酸鈉緩沖液，pH7.5)平衡Cellufine sulfate樹(shù)脂柱,流速3mL/min ;將表達(dá)上清液上柱結(jié)合，上樣流速3mL/min，之后利用平衡緩沖液沖洗約10個(gè)柱體積；用洗滌緩沖液I (含0.3M氯化鈉的濃度為IOmM磷酸鈉緩沖液，pH7.5)洗脫30個(gè)柱體積以上。用洗脫緩沖液II (含2M氯化鈉的濃度為IOmM磷酸鈉緩沖液，pH7.5)洗脫，分管收集作為VLPs溶液。
[0016]VLPs溶液中加入固體聚乙二醇(PEG6000)至終濃度為10% (W / V)，室溫?cái)嚢枋蛊渫耆芙?，冰?h以上使VLPs形成沉淀,4°C 11000r/min離心lOmin,用適量RNase freedH20懸浮沉淀。之后利用DNase I消化溶液中殘留的質(zhì)粒DNA，加入等體積的氯仿CH3Cl抽提后4°C 11000r/min離心lOmin，回收含VLPs的水相，即為內(nèi)含流感病毒M基因的裝甲R(shí)NA(AR-1VM)懸浮液。
[0017]本發(fā)明所述的內(nèi)含A型流感病毒M基因裝甲R(shí)NA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中沒(méi)有質(zhì)粒DNA的殘留。
[0018]進(jìn)一步地，將內(nèi)含流感病毒M基因的裝甲R(shí)NA溶液通過(guò)熒光定量RT-PCR方法定值后，稀釋分裝后作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使用，內(nèi)含A型流感病毒M基因裝甲R(shí)NA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度為IO6Copies/ μ L0
[0019]本發(fā)明還要保護(hù)內(nèi)含A型流感病毒M基因裝甲R(shí)NA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在A型流感病毒核酸檢測(cè)中作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的應(yīng)用。
[0020]本發(fā)明制備的裝甲R(shí)NA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的顯著優(yōu)點(diǎn)是:
[0021]I)該裝甲R(shí)NA內(nèi)部包含的M基因片段，覆蓋了目前多數(shù)A型流感病毒通用核酸檢測(cè)方法和試劑盒檢測(cè)的區(qū)域，如國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T27539-2011《Α型流感病毒通用熒光RT-PCR檢測(cè)方法》，2009年WHO⑶C和我國(guó)衛(wèi)生部推薦的《Α型流感病毒通用熒光RT-PCR檢測(cè)方法》等。因此該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可用于現(xiàn)有A型流感病毒通用核酸檢測(cè)方法和試劑的質(zhì)量控制
[0022]2)該裝甲R(shí)NA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度高，無(wú)質(zhì)粒DNA殘留，具有良好的質(zhì)控性能。裝甲R(shí)NAVLPs的表達(dá)產(chǎn)物中會(huì)混雜有大量的細(xì)菌蛋白、核酸以及質(zhì)粒DNA，如果不去除將直接影響到質(zhì)控樣品的性能，特別是質(zhì)粒DNA，未經(jīng)核酸提取和反轉(zhuǎn)錄過(guò)程即可檢測(cè)為陽(yáng)性，即便只有微量殘留，在指數(shù)級(jí)擴(kuò)增后也會(huì)對(duì)結(jié)果構(gòu)成顯著影響。研究中，我們?cè)噲D通過(guò)超速離心、病毒沉淀以及DNase消化的方法純化VLPs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)殘留質(zhì)粒DNA均無(wú)法徹底去除。為此，我們進(jìn)行了多種方法的嘗試，包括硅粉吸附、超速離心以及Cellufine Sulfate親和層析法等試驗(yàn)，結(jié)果證實(shí)，采用Cellufine Sulfate親和樹(shù)脂柱純化,聚乙二醇沉淀,加入DNase消化后可徹底去除殘留質(zhì)粒DNA。[0023]3)該裝甲R(shí)NA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)內(nèi)部的M基因由MS2噬菌體的衣殼蛋白包裹，可耐受RNase降解，相比于體外轉(zhuǎn)錄的裸露RNA更加穩(wěn)定，易于保存。
[0024]4)該裝甲R(shí)NA模擬了天然病毒的結(jié)構(gòu)，可與臨床樣本一樣參與核酸提取和擴(kuò)增等環(huán)節(jié)，實(shí)現(xiàn)對(duì)檢測(cè)過(guò)程的全程質(zhì)控，確保檢測(cè)結(jié)果的真實(shí)可靠；
[0025]5)該裝甲R(shí)NA無(wú)生物傳染性，易于制備和運(yùn)輸，相比于增殖的病毒粒子，更適合臨床推廣使用；
[0026]6)該裝甲R(shí)NA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)其內(nèi)部所含的目的核酸通過(guò)熒光定量RT-PCR方法進(jìn)行了定值，可用于檢測(cè)樣品的定量分析及檢測(cè)方法和試劑檢測(cè)極限的評(píng)價(jià)。
[0027]下面結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，凡依照本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容所做的任何本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0028]圖1為A型流感病毒M基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0029]M:DNA Mark DL2000 ； Lane I 和 2:陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物；Lane3:陰性對(duì)照。
[0030]圖2內(nèi)含A型流感病毒M基因裝甲R(shí)NA PCR和RT-PCR鑒定結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0031]Lanel和5:陰性對(duì)照，Lane2、3和4:分別為I μ L、2 μ L、4 μ L裝甲R(shí)NA樣品的RT-PCR 結(jié)果，M:DL5000DNA Marker，Lane6、7 和 8:分別為 I μ L、2y L、4y L 裝甲 RNA 樣品未反轉(zhuǎn)錄的PCR結(jié)果。
[0032]圖3內(nèi)含A型流感病毒M基因裝甲R(shí)NA實(shí)時(shí)熒光RT-PCR鑒定結(jié)果。
[0033]圖4熒光RT-PCR對(duì)A型流感病毒裝甲R(shí)NA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性檢測(cè)結(jié)果。
[0034]圖5國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T27539-2011《A型流感病毒通用熒光RT-PCR檢測(cè)方法》檢測(cè)10倍系列稀釋裝甲R(shí)NA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0035]下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的
[0036]試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)生化試劑供應(yīng)商購(gòu)買(mǎi)得到。
[0037]實(shí)施例1、內(nèi)含A型流感病毒M基因裝甲R(shí)NA的獲得及鑒定
[0038]1、材料
[0039]流感病毒A/Swine/2003 (HlNl)由本實(shí)驗(yàn)室保存。根據(jù)GenBank公布的MS2噬菌體基因組序列(登錄號(hào)分別為EF112445)，人工合成MS2噬菌體基因組5’非編碼區(qū)序列、成熟酶蛋白基因、衣殼蛋白基因、包裝位點(diǎn)和復(fù)制酶基因部分起始位點(diǎn)序列約178Ibp,序列中還引入了 BamH I /Kpn I酶切位點(diǎn)，如序列表中SEQ ID N0:2所示。
[0040]2、方法
[0041]I)引物設(shè)計(jì)
[0042]根據(jù)GenBank公布的SIV基因組序列(登錄號(hào)為⑶047344)，利用oligo6軟件設(shè)計(jì)引物。引物對(duì)SIVCF/SIVCR用于擴(kuò)增SIV最為保守的M基因，片段大小758bp，擴(kuò)增引物中引入了 BamH I /Not I酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增片段覆蓋了目前多數(shù)SIV通用核酸檢測(cè)方法和試劑盒檢測(cè)的區(qū)域。引物對(duì)SIVPF/SIVPR用于鑒定檢測(cè)SIV M基因，該引物對(duì)位于M基因內(nèi)部，擴(kuò)增片段大小約496bp。同時(shí)參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T27539-2011《動(dòng)物流感檢測(cè)A型流感病毒通用熒光RT-PCR檢測(cè)方法》合成SIV M基因?qū)崟r(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)用引物和探針。所有引物及探針序列和PCR擴(kuò)增片段大小見(jiàn)表1。
[0043]表1基因克隆和鑒定用引物和探針
[0044]
【權(quán)利要求】
1.一種內(nèi)含A型流感病毒M基因裝甲R(shí)NA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其特征在于:它是通過(guò)如下方法制備: 1)獲得用于A型流感病毒核酸檢測(cè)的M基因序列，如序列表中SEQ ID NO:1所示； 2)將包含MS2噬菌體成熟酶蛋白基因和衣殼蛋白基因的序列及通過(guò)步驟I)獲得M基因序列克隆于原核表達(dá)載體； 3)將原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株中，誘導(dǎo)表達(dá)，然后采用超聲波裂解，離心，收集上清液，獲得表達(dá)產(chǎn)物 ； 4)經(jīng)^Cellufine Sulfate樹(shù)脂柱純化、聚乙二醇沉淀和DNase消化,去除殘留質(zhì)粒DNA,得到內(nèi)含A型流感病毒M基因裝甲R(shí)NA病毒樣顆粒。 5)將內(nèi)含流感病毒M基因的裝甲R(shí)NA病毒樣顆粒通過(guò)熒光定量RT-PCR方法定值，稀釋分裝，即得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的內(nèi)含A型流感病毒M基因裝甲R(shí)NA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其特征在于:步驟4)中，具體過(guò)程為:取平衡緩沖液平衡Cellufine sulfate樹(shù)脂柱，將表達(dá)產(chǎn)物上柱結(jié)合，用洗滌緩沖液I洗脫，再用洗脫緩沖液II洗脫，收集含裝甲R(shí)NA病毒顆粒的溶液；然后用固體聚乙二醇進(jìn)行沉淀，再利用DNase I消化殘留的質(zhì)粒DNA，得到內(nèi)含流感病毒M基因裝甲R(shí)NA病毒樣顆粒，其中，平衡緩沖液為含有0.1M氯化鈉的濃度為IOmM的磷酸鈉緩沖液，PH7.5，洗滌緩沖液I為含0.3M氯化鈉的濃度為IOmM磷酸鈉緩沖液，pH7.5，洗脫緩沖液II為含2M氯化鈉的濃度為IOmM磷酸鈉緩沖液，pH7.5。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的內(nèi)含A型流感病毒M基因裝甲R(shí)NA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其特征在于:內(nèi)含A型流感病毒M基因裝甲R(shí)NA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中沒(méi)有質(zhì)粒DNA的殘留。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的內(nèi)含A型流感病毒M基因裝甲R(shí)NA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其特征在于，內(nèi)含A型流感病毒M基因裝甲R(shí)NA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度為IO6Copies/ μ L。
5.權(quán)利要求1-4中任一所述的內(nèi)含A型流感病毒M基因裝甲R(shí)NA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在A型流感病毒核酸檢測(cè)中作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12R1/92GK103571865SQ201310541105
【公開(kāi)日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2013年11月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月5日
【發(fā)明者】喬彩霞, 倪建強(qiáng), 蒲靜, 高志強(qiáng), 張鶴曉, 尹羿, 汪琳, 谷強(qiáng), 張利峰, 張偉 申請(qǐng)人:中華人民共和國(guó)北京出入境檢驗(yàn)檢疫局