A型流感病毒M基因有干擾作用的siRNA序列的設(shè)計和干擾作用的鑒定的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了三條對流感病毒M基因復(fù)制有抑制作用的siRNA；然后通過雞胚實驗測HA滴度的方法確定了siRNA載體質(zhì)粒對流感病毒干擾的有效性。
【專利說明】A型流感病毒M基因有干擾作用的s i RNA序列的設(shè)計和干擾作用的鑒定
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本專利涉及對A型流感病毒M基因有干擾作用的siRNA序列的設(shè)計和干擾作用的鑒定，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]流行性感冒(Influenza)，簡稱流感，被稱為最古老和最致命的人類瘟疫之一。據(jù)歷史記載，早在1510年英國就發(fā)生了由全球第一起由流感引起的流行病。如今，美國每年有2萬人死于流感，俄羅斯每年也有I萬人死于流感，英國每年有5萬人由流感發(fā)展成肺炎，其中約20%死亡。據(jù)估計，全球每年流感患者死亡人數(shù)高達(dá)60萬人，多于艾滋病患者死亡的人數(shù)。美國已將流感列為繼心臟病、癌癥、中風(fēng)、肺氣腫之后的威脅生命的第五大“殺手”。
[0003]目前對預(yù)防流感對人的侵害，目前有死病毒、減毒毒株或重組表面糖蛋白組成等預(yù)防流感的各類疫苗，但是這些疫苗能夠有效地保護(hù)約70~80%的健康成年人免于患病，但是疫苗只能針對一小部分毒株，對于新的潛在爆發(fā)的毒株可能沒有作用。而且，對于高風(fēng)險人群如嬰孩、老人、孕婦和其它各種免疫力低下的人群，疫苗的保護(hù)作用是非常有限的，保護(hù)率低于40%。由于大部分的死亡都是發(fā)生在高風(fēng)險人群中，疫苗對于這些最需要它們的人卻不能起到很好的保護(hù)作用。正在應(yīng)用的幾種抗流感藥物也能夠降低流感感染的發(fā)生和減輕流感感染時的癥狀。但是，藥物的副作用、病人的承受能力、可能出現(xiàn)的抗藥性變異限制了這些藥物的大規(guī)模使用。所以，對于預(yù)防和治療流感病毒感染的方法仍然有很急切的需要，特別是在高風(fēng)險人群中和爆發(fā)流感時。因此，流感的防治至少在今后50年內(nèi)仍然是嚴(yán)重的問題，尋找更有效的預(yù)防和治療途徑是醫(yī)學(xué)研究的重大課題。
[0004]早在1990年,Napoli和Jorgensen等人在做轉(zhuǎn)基因植物的實驗中發(fā)現(xiàn),給矮牽牛花注入外源性的色素基因，發(fā)現(xiàn)這不但沒有使花色加深，反而使花色出現(xiàn)斑駁甚至完全無色。這意味著不但外源基因被滅活，連內(nèi)源的同源基因也受到了抑制。他們把這一現(xiàn)象稱為共抑制(co-suppress)。
[0005]1994年，Macino和Cogoni發(fā)現(xiàn)，將合成類胡蘿卜素所需的基因?qū)氪植诩t色鏈孢霉中，會導(dǎo)致30%的轉(zhuǎn)化細(xì)胞中霉菌本身的基因失活，并將其稱為基因的靜息作用(quelling)[8]。
[0006]1995年,康奈爾大學(xué)的Guo和Kemphues在利用反義RNA技術(shù)阻斷秀麗新小桿線蟲(C.elegans)中的par_l基因的表達(dá)時意外地發(fā)現(xiàn),對照實驗中給線蟲注射正義RNA不但不增加該基因的表達(dá)，反而像反義RNA —樣，也能阻斷該基因的表達(dá)M。這與反義RNA技術(shù)的傳統(tǒng)解釋機(jī)制完全相違背，該小組一直無法解釋這個現(xiàn)象。
[0007]直到1998年2月，華盛頓卡耐基研究院的Andrew Z.Fire和和馬薩諸賽大學(xué)癌癥中心的Craig C.Mello第一次嘗試用雙鏈RNA注射線蟲[1°]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)dsRNA能夠高效特異地阻斷相應(yīng)基因的表達(dá)，抑制效率至少比單鏈RNA高10倍。他們更進(jìn)一步指出Guo等發(fā)現(xiàn)的正義RNA對基因表達(dá)的抑制，以及過去利用反義RNA技術(shù)對基因表達(dá)的阻斷，都是由體外轉(zhuǎn)錄制備的RNA中污染的微量dsRNA引起的。后來Fire等首次提出一個新的概念——RNA干擾(RNA interference, RNAi),即由dsRNA介導(dǎo)的序列特異性的基因沉默(genesilencing)。
[0008]這種dsRNA導(dǎo)致的RNA干擾現(xiàn)象隨后在果蠅、昆蟲、真菌、植物擬南芥等生物和哺乳動物以及人類的多種細(xì)胞中也分別被發(fā)現(xiàn)。
[0009]起初普遍認(rèn)為co-suppress、quelling和RNAi是不同機(jī)制的基因沉默現(xiàn)象,但隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)它們有共同的分子基礎(chǔ)，都是轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptionalgene silencing, PTGS)機(jī)制的不同表現(xiàn)形式,是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制轉(zhuǎn)座子活動、調(diào)控基因表達(dá)的監(jiān)控機(jī)制。
[0010]RNAi 一經(jīng)發(fā)現(xiàn)，迅速成為生物學(xué)研究領(lǐng)域中最為活躍的熱點之一，Science雜志在2001年將其列為十大科學(xué)成就之一，2002年又將其列為十大科技之首；Nature雜志也將小RNA評為2002年度最重要的科技發(fā)現(xiàn)之一 ；Andrew Z.Fire和Craig C.Mello因RNA干擾的發(fā)現(xiàn)而獲得了 2006年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎。隨著廣泛深入的實驗研究的進(jìn)行，人們對RNAi的機(jī)制有了初步的了解。
[0011]在一系列著名的實驗中，Zamore和同事發(fā)現(xiàn)注入果蠅細(xì)胞的dsRNA被切割為21~23堿基長短的RNA片段，他們同時發(fā)現(xiàn):與dsRNA同源的內(nèi)源基因的mRNA，只在和dsRNA對應(yīng)的部位被切割成為21-23核苷酸長的片斷[11]。這掀開了揭露RNAi的機(jī)制的序幕。
[0012]根據(jù)生物體的不同，RNAi的誘導(dǎo)物可以是各種分子，包括長鏈dsRNA，質(zhì)粒產(chǎn)生的shRNA或者內(nèi)源性發(fā)夾樣小RNA (hairpin microRNA，miRNA)。目前認(rèn)為RNAi的主要過程[12]為:①siRNA形成階段。RNAi的誘導(dǎo)物在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)被RNaseIII Dicer切割成為21_23nt的小分子干擾RNA (small interfering RNA, siRNA), siRNA的結(jié)構(gòu)特征是5’端單磷酸,3’端輕基，而且3’端有2~3-nt的堿基突出RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA_induced SilencingComplex, RISC)的形成階段。siRNA與RNAi特異性酶(如A go-2)結(jié)合，形成RISC，具有特異性的核酸內(nèi)切酶活性能特異性地降解與siRNA同源的mRNA ;③效應(yīng)階段。RISC中siRNA變性，雙鏈解開，卸下正義RNA，反義RNA仍結(jié)合在復(fù)合物上，并引導(dǎo)RISC與同源的靶目標(biāo)mRNA結(jié)合，在核酸內(nèi)切酶的作用下，將靶目標(biāo)mRNA切斷(切割位置在siRNA的中央，距離5’端10-nt)，從而阻斷了其翻譯成蛋白質(zhì)，表現(xiàn)為基因沉默。miRNA導(dǎo)致基因沉默的機(jī)制與此稍有不同，它們與革G mRNA3’非編碼區(qū)(untranslated region, UTR)通過不完全互補(bǔ)結(jié)合，抑制翻譯過程和蛋白質(zhì)的合成。但也有研究表明，miRNA可以與siRNA —樣通過介導(dǎo)mRNA的切斷來抑制基因表達(dá)[13]。
[0013]在RNAi通路上，Dicer和RISC是兩個最重要的蛋白復(fù)合體。了解這兩個復(fù)合體的結(jié)構(gòu)和功能對于理解RNAi的機(jī)制有著至關(guān)重要的作用。
[0014] Dicer酶是核糖核酸酶III (RNase III)家族的成員之一，約200kD，最早是在果蠅中發(fā)現(xiàn)的，能特異性地將dsRNA剪切為21~23nt5 ^磷酸化，3 ^端有2~3個核苷酸懸端的siRNA。Dicer酶含有4個結(jié)構(gòu)區(qū)域，從N端到C端依次為:DEAD/H解螺旋區(qū)、PAZ區(qū)域、2個串聯(lián)的 RNase III 區(qū)域(RNase IIIa 和 RNase IIIb)和雙鏈 RNA 結(jié)合區(qū)(double-strandedRNA-binding domain, dsRBD)。大多數(shù)Dicer蛋白PAZ區(qū)域附近有一個100個左右氨基酸組成的未知功能的保守區(qū)域DUF283[15]。研究表明，PAZ結(jié)構(gòu)域的功能是結(jié)合單鏈或雙鏈siRNA或DNA，這種結(jié)合與核苷酸序列無關(guān)且親和力較低。
[0015]RNAi是一種在進(jìn)化上保守的機(jī)制，可以看作為基因組的“免疫系統(tǒng)”，它的作用主要體現(xiàn)在以下幾個方面:①RNAi是一種抗病毒機(jī)制。許多病毒以RNA作為遺傳物質(zhì)，而且在生命周期的某一個環(huán)節(jié)會形成dsRNA,這種dsRNA就會被生物體的Dicer識別，切割成21-23nt的片斷，啟動RNAi過程進(jìn)而阻斷病毒蛋白質(zhì)的表達(dá)。②RNAi通過抑制轉(zhuǎn)座子和重復(fù)序列的移動來維護(hù)基因組的穩(wěn)定性。③調(diào)節(jié)和維護(hù)正常的基因表達(dá)水平，如MicroRNAs能夠調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)和決定發(fā)育時機(jī)的選擇。
[0016]作為一種快速、有效、特異的抑制基因表達(dá)的工具，廣泛的應(yīng)用于治療和預(yù)防各類病毒性疾病。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0017]本發(fā)明提供三條對A型流感病毒復(fù)制有抑制作用的siRNA及其編碼序列。如序列表400〈1>，400〈2>，400〈3> 所示。
[0018]本發(fā)明所述的三條siRNA的載體表達(dá)物在動物水平的實驗結(jié)果表明，RNAi能效抑制HlNl，H2N3, H9N2的病毒復(fù)制。
【具體實施方式】
[0019]實施例1:雞胚實驗驗證siRNA干擾H9N2流感病毒增殖作用驗證
[0020]H9N2病毒毒力ED5tlIO8_°/0.Iml,將H9N2病毒稀釋含有100個ED5tl病毒液，體積0.1ml，注射到9日齡SPF雞胚尿囊腔中，同時注射SiRNA載體質(zhì)粒6微克，33°C培養(yǎng)72小時，取尿囊液，測血凝效價。
[0021]實施例2:雞胚實驗驗證重組質(zhì)粒干擾HlNl流感病毒增殖作用驗證
[0022]HlNl病毒毒力ED50108.。6/0.1ml，將HlNl病毒稀釋含有100個ED5tl病毒液，體積0.1ml，注射到9日齡SPF雞胚尿囊腔中，同時注射SiRNA載體質(zhì)粒6微克，33°C培養(yǎng)72小時，取尿囊液，測血凝效價。
[0023]實施例3:雞胚實驗驗證siRNA干擾H3N2流感病毒增殖作用驗證
[0024]H3N2病毒毒力ED50108。°/0.1ml，將H3N2病毒稀釋含有100個ED5tl病毒液，體積
0.1ml，注射到9日齡SPF雞胚尿囊腔中，同時注射SiRNA載體質(zhì)粒6微克，33°C培養(yǎng)72小時，取尿囊液，測血凝效價。
[0025]實施例4:尿囊液病毒滴度檢測
[0026](I)微量血凝板的每孔中滴加PH7.2PBS100uL, (2)吸取被檢尿囊液樣品100μ L，倍比稀釋12孔，第12孔棄掉100 μ L。每孔中加入0.1 %紅細(xì)胞懸液100 μ L。
[0027](2)設(shè)陰性對照和流感病毒陽性對照。
[0028](4)置微型振蕩器上振蕩Imin混勻。
[0029](5)放室溫下(18~20°C )30min，觀察結(jié)果。
[0030]經(jīng)三次重復(fù)實驗，序列表所述的三條序列〈400>1，〈400>2，<400>3對流感病毒復(fù)
制的抑制率如下:
[0031]
【權(quán)利要求】
1.一種對流感病毒M基因復(fù)制有干擾作用的SiRNA，其核苷酸序列如序列表400〈1>，.400<2>,400<3> 所示。
2.權(quán)利要求1、對所述的siRNA作為抑制流感病毒M基因沉默的靶向基因的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K48/00GK103966213SQ201310048356
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年2月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月6日
【發(fā)明者】任政華, 霍晉 申請人:霍晉