專利名稱：一種光合細菌菌株及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及ー種微生物領域，尤其涉及一種光合細菌菌株及其應用。
背景技術：
光合細菌是ー類具有固碳、固氮、脫氫、氧化硫化物等功能的微生物，此外，光合細菌本身是活蛋白，內含有豐富的氨基酸、維生素、促生長因子、抗病毒活性因子、輔酶Q及多種生理活性物質，具有抗脂質過氧化、改善水質，培養餌料生物，防治疾病，提高成活率，固氮，產氫氣等功能，因而在水產養殖、禽畜飼養、飼料添加、環境保護、新能源的生產及保健品等方面越來越多的被應用，成為現代生物技術不可缺少的一部分。但是現有的光合細菌通常對酸、堿、鹽、抗生素的耐受能力不強，在實際使用中受到限制，對蔬菜生長的促進效果不大。

發明內容
本發明的目的是克服現有光合細菌耐受性低、不能有效促進蔬菜生長的缺陷，提供ー種具有耐酸、耐堿、耐鹽、耐抗生素能力且能顯著提高蔬菜產量及品質的光合細菌菌株。本發明的另一目的在于提供上述光合細菌菌株的應用。為了達到上述目的，本發明通過采用選擇性培養基在厭氧和好氧培養條件下，對生長于廣東省水田土壌中的光合細菌進行分離、純化得到一種光合細菌菌株，所述細菌為膠狀紅長命菌iRubrivivax gelatinosus) sbgll,于2012年5月7日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC No. 6085。該膠狀紅長命菌sbgll具有耐酸、耐堿、耐鹽和抗生素的能力，可作為接種劑促進生菜、番茄、辣椒等蔬菜的生長。經過序列測定，上述光合細菌菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO: I所示。本發明還提供ー種接種劑，其含有上述光合細菌菌菌株，即膠狀紅長命菌sbgll。本發明的光合細菌菌株優選作為液體菌肥以促進生菜、番茄、辣椒等蔬菜作物生長。所述液體菌肥由上述光合細菌菌株按2 5% (特別優選3%)的接種量采用LB液體培養基培養而得。同時本發明還提供一種促進蔬菜生長的方法，具體是將上述液體菌肥施用于種植蔬菜的PH為4. 0-10. 0的土壌中。該方法特別適合于促進生菜、番茄或辣椒等蔬菜的生長。與現有技術相比，本發明具有以下有益效果
發明人經過大量的實驗研究，篩選出ー種具有耐酸、耐堿、耐鹽和抗生素能力的光合細菌菌株，即膠狀紅長命菌{Rubrivivaxsbgll,所述的光合細菌菌株能夠顯著
地提高蔬菜的產量及品質，可廣泛地應用于各種蔬菜。在經本發明的細菌處理后，生菜、番茄、辣椒等蔬菜的產量及品質都有了顯著提高。本發明還為生菜、番茄、辣椒等蔬菜提供了一種優良的液體菌肥，它來源于農田土壌中，明顯促進生菜、辣椒、茄子等蔬菜對酸、堿性土壤的耐受性，可防止使用化肥進ー步使土壌酸化而不利于植物生長。
具體實施例方式實施例I
膠狀紅長命菌{Rubrivivax gelatinosus) sbgll的分離、純化和鑒定富集稱取土樣10 g于含50 mL無菌水的三角瓶中，充分振蕩打散，制成懸濁液，與富集營養液按I: 5比例裝人三角瓶中，并覆蓋一層無菌液體石蠟(高約2 cm)形成厭氧環境，封ロ，靜置于光照培養箱，30 ± 2°C，培養15 20d，瓶壁上先長出黃、綠、紅、紫紅等多種不同顔色的菌株，后又被優勢菌株覆蓋并貼滿瓶壁。取此第一代培養瓶中的菌懸液100 ML于250 mL富集營養液進行第二代培養，培養方法與第一代相同。培養約10天后從第二代培養瓶中吸取10 ML于250 mL富集營養液進行第三代培養，培養條件不變，富集優勢菌株，淘汰劣勢菌株。
分離純化吸取第三代液體培養液I mL于盛有9 mL無菌水的試管制成10—1倍稀釋菌液，再取此濃度菌懸液如法稀釋至10_2、10_3倍，直至稀釋到10_6倍。分別吸取10_4、10_5、IO-6三個梯度的菌懸液100 ML，分別依次采用平板涂布培養法和傾注厭氧培養法，30±2°C下光照培養，觀察不同培養方法下菌體的生長情況，挑取長勢較好并且具有不同特征的菌落用平板劃線法進行反復傳代培養，直至菌落的形狀、顔色、質地、透明度一致。最后通過簡單染色和鏡檢，進ー步觀察其形態，以長度均一、寬度一致、染色情況統ー為菌株純化標準。保存將分離純化后的菌株在光合細菌分離培養基平板光照培養2飛d，收集平板上的菌體，保存于15 %滅菌甘油(_20°C )和牛血清中(_80°C )。并且于2012年5月7日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 6085。上述方法中，富集培養液(IL) =KH2PO4 0.5 g，K2HPO4 0.6 g, (NH4)2SO4 1.0 g,MgSO4* 7H20 0. 2 g (分開滅菌)，NaCl 0. 2 g, CaCl2 *2H20 0. 075 g (分開滅菌)，こ酸鈉 I. 5g，酵母膏 I g，微量元素液 1.0 mL (H3BO3 0. 28 g, NaMoO4 0.075 g, CuSO4 0.004 g, MnSO40. 21 g, ZnSO4 0. 024 g, I L 水)，pH 為 7. 0±0. 2。分離培養基(IL):酵母膏 3 g，蛋白胨 3 g，CaCl2.6H20 0.3 g,MgSO4*7H20 0.5 g,瓊脂粉 15 g，pH 7.0 ±0.2。由上述方法分離純化的膠狀紅長命菌sbgll具有如下形態和生理、生化特性
a、菌體形態特性
膠狀紅長命菌為革蘭氏陰性菌，細胞呈短桿狀，菌體大小為0. 4^0. 7X1. 2 2. 7 Mm。b、菌落形態特性
光照厭氧液體培養物為深粉紅色，瓶底、瓶壁及液面上形成一層深紅色隔氧膜，不隨震蕩散開；瓊脂平板上也生長較快，呈淺紅至深紅色點狀菌落，菌落表面微光滑、突起、濕潤、有光澤、透明，菌落邊緣整齊。C、生理生化特性
兼性厭氧，菌體富含細菌葉綠素a和類胡蘿卜素；能在以吐溫40，吐溫80，D-葡萄糖，D-甘露糖，L-果糖，D-果糖，a -酮戊ニ酸，琥珀酸鈉，水楊酸鈉為碳源的培養基上生長；pH生長范圍較廣，可耐pH4-pH10 ;對NaCl不敏感，耐NaCl濃度達4. 0% ;對300吒 mじ1的氨芐青霉素仍有耐受性，耐慶大霉素、新霉素可達50呢 !!!じ1，而對卡拉霉素、鏈霉素、氯霉素、四環素、紅霉素的耐受性差，低濃度的這幾種抗生素就能抑制其生長。菌株sbgll能產生吲哚、分泌生長素、液化明膠和還原N03_，不能生成H2S。吲哚反應呈陽性，且能分泌生長素IAA，能液化明膠。碳源利用情況和是否需氧的實驗表明本發明的菌株膠狀紅長命菌sbgll與膠狀紅長命菌模式菌株ATCC17011存在較大的差異，應為膠狀紅長命菌中的一個新菌株。經過序列測定，上述菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO: I所示。本發明膠狀紅長命菌的分子分類地位的確定
采用細菌 16S rDNA 基因通用引物 25f〔5’-AAC T(G/T)A AGA GTT TGA TCC TGGCTC-3，〕(SEQ ID NO:2 或 SEQ ID N0:3)和 1492r〔5，-TAC GG(C/T) TAC CTT GTT ACGACT T-3’〕(SEQ ID N0:4或SEQ ID NO: 5)進行擴增，將PCR產物直接進行序列測定，將獲得的DNA序列輸入GenBank進行比對，初步確定本發明的光合細菌屬于紅螺菌目、紅螺菌 科、長命菌屬，與膠狀紅長命菌(Rubrivivax gelatinosus)模式菌株ATCC17011 (美國典型培養物保藏中心菌株)有99%的相似性。結合上述的生理生化特性、16S rDNA序列分析、SDS-PAGE全細胞蛋白電泳圖譜和DNA/DNA雜交結果，本發明中保藏號為CGMCC No. 6085的菌株應屬于膠狀紅長命菌(Rubrivivax gelatinosus)。其判斷參考如下文獻Imhoff J F，Triiper Hし，Piennig N. Rearrangement 01 the species and genera of the phototrophic
purple nonsulfur bacteria [J]. International Journal of SystematicBacteriology, 1984，34 (3):340-343 ;Willems A，Gillis M，De Ley J. Transferof Rhodocyclus gelatinosus to Rubrivivax gelatinosus gen. nov.， comb,nov.， and Phylogenetic Relationships with Leptothrix, Sphaerotilus natans，Pseudomonas saccharophila and Alcaligenes latus[J]. International Journal ofSystematic Bacteriology, 1991，41 (I) :65-73 ；Triiper H G，Imhoff J F. The generaRhodocyclus and Rubrivivax [M] //Balows A，Triiper H G，Dworkin M，et al. Theprokaryotes. Berlin: Springer, 1992. 2556-2561 ；Garrity G M，Johnson K L，BellJ，et al. Bergey^ s manual of systematic bacteriology, 2nd Edition[M]. 3.0.New York: Springer, 2002. 64-65 ；Ramana C V，Sasikala C，Arunasri K，et al.Rubrivivax benzoatilyticus sp. nov.，an aromatic, hydrocarbon-degrading purplebetaproteobacterium[J]. International Journal of Systematic and EvolutionaryMicrobiology, 2006，56 (PT 9):2157-2164。實施例2
光合細菌應用于生菜
將實施例I活化得到的、即保藏號為CGMCC No. 6085的膠狀紅長命菌gelatinosus) sbgll單菌落于25mL的新鮮LB液體培養基中，37で，180rpm振蕩培養24h，再將培養好的液體種子培養液按3%接種量轉接到發酵培養基中，37で，180印111振蕩培養28h，備用。盆栽試驗做4個處理，5個重復。II:化肥做底肥，菌肥做追肥；12:化肥做底肥，不接種的等量空白營養液做追肥；13 :只有等量化肥做底肥，不追肥；CK :只澆清水不施肥。以上四個處理其他日常管理一致。結果表明生菜干重的平均數值以Il處理最高，比12提高了 12. 21 %，表明菌劑的施加在一定程度上促進了生菜干物質的積累。而處理11、12、13與CK對照相比，無論在生菜鮮重還是干重上均達到5 %顯著性水平差異。施用菌肥Il組硝酸還原酶活性為72. 4 + 0. 52 l^g(N02 — ). [g(Fff) .h]-1，比對照12、13、CK組分別提高34. 91%、62. 71 %、309. 50 %。施加菌肥的葉片組織葉綠素含量高于其他處理，比CK清水對照組高出36. 49 %。Il菌肥組生菜葉片Vc含量0. 234±0. 007 mg.g—1，相比12、13、CK組分別提高了 61. 38 %、84. 25 %、127. 18 %。Il組與12、13、CK組相比生菜葉片全氮的含量分別提高了 20. 020%、18. 455%,61. 971% ;全磷分別提高了 29. 503%,36. 275%,80. 519% ;全鉀分別提高了 13. 200%、19. 409%,38. 725%。上述使用的LB (液體/固體)培養基胰蛋白胨10g，酵母浸出粉5g，氯化鈉5g加雙蒸水定容至1L，固體培養基加I. 5%瓊脂粉，121°C滅菌20min。實施例3
光合細菌應用于辣椒 將實施例I活化得到的、即保藏號為CGMCC No. 6085的膠狀紅長命菌gelatinosus) sbgll單菌落于25 mL的新鮮LB液體培養基(同實施例2)中，37°C, 180rpm振蕩培養24h，再將培養好的液體種子培養液按3%接種量轉接到發酵培養基中，37°C，180rpm振蕩培養28h，備用。田間試驗做4個處理，3個重復共12個小區。處理I :光合菌肥5mL*nT2 ;處理2 :光合菌肥lOmLm2 ;處理3 :滅菌的光合菌肥10mL*nT2。菌肥用清水稀釋20倍后葉面噴施于蔬菜上。對照區噴同量的水，以上四個小區其他日常管理一致。實驗結果表明處理I比對照開花早，結椒提前，葉色椒色均比對照綠，辣椒硝酸鹽含量平均降低16. 2% ；Vc含量增加17. 9% ;產量增加15. 1%。處理2中開花早、結椒提前、葉色椒色均比對照綠的現象更明顯，辣椒硝酸鹽平均降低21. 3% ；Vc含量增加19. 8%，產量增加22. 9%。表明此光合細菌能夠明顯提高辣椒的產量及品質。實施例4
光合細菌應用于番爺
將實施例I活化得到的、即保藏號為CGMCC No. 6085的膠狀紅長命菌{Rubrivivaxgelatinosus) sbgll單菌落于25 mL的新鮮LB液體培養基(同實施例2)中，37°C, 180 rpm振蕩培養24h，再將培養好的液體種子培養液按3%接種量轉接到發酵培養基中，39°C混合培養24h，備用。田間試驗做4個處理，3個重復共12個小區。處理I :菌液+化肥；處理2 :滅菌菌液+化肥；處理3 :化肥；處理4 :清水，其他日常管理一致。結果表明前三個處理比清水處理的株高分別增加57. 5%，37. 1%，25. 9% ;葉綠素分別提高60. 7%，9. 2%，3. 6% ;番茄紅素分別提高72. 7%，36. 1%，53. 0% ；Vc分別提高74. 8%，32. 1%，3. 7%。表明此光合細菌能夠明顯提聞番爺的品質。
權利要求
1.一種光合細菌菌株，所述細菌為膠狀紅長命菌{Rubrivivaxsbgll,于2012年5月7日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo. 6085。
2.如權利要求I所述的光合細菌菌株，其特征在于其16SrDNA序列如SEQ ID NO: I所/Jn o
3.ー種接種劑，其特征在于含有權利要求I或2所述的光合細菌菌株。
4.ー種液體菌肥，其特征在于由權利要求I或2所述的光合細菌菌株按2 5%的接種量采用LB液體培養基培養而得。
5.一種促進蔬菜生長的方法，其特征在于將權利要求4所述的液體菌肥施用于種植蔬菜的PH為4. 0-10. 0的土壤中。
6.如權利要求5所述的促進蔬菜生長的方法，其特征在于所述蔬菜為生菜、番茄或辣椒。
全文摘要
本發明涉及一種光合細菌菌株及其應用。所述細菌為膠狀紅長命菌(Rubrivivaxgelatinosus)sbg11，于2012年5月7日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.6085，其16SrDNA序列如SEQ ID NO:1所示。所述的光合細菌菌株能夠顯著地提高蔬菜的產量及品質，可廣泛地應用于各種蔬菜。在經本發明的細菌處理后，生菜、番茄、辣椒等蔬菜的產量及品質都有了顯著提高。
文檔編號C12R1/01GK102796687SQ201210302180
公開日2012年11月28日 申請日期2012年8月23日 優先權日2012年8月23日
發明者黃秋生, 彭桂香, 楊芳, 劉光華, 譚志遠, 田俊嶺 申請人:廣東凱利生物科技有限公司, 華南農業大學