辣椒雜交種純度檢測(cè)est-ssr分子標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子標(biāo)記領(lǐng)域，具體涉及辣椒雜交種純度檢測(cè)EST-SSR分子標(biāo)記及其應(yīng)用。本發(fā)明開發(fā)了辣椒雜交種純度檢測(cè)EST-SSR分子標(biāo)記HE4，應(yīng)用于‘熱辣1號(hào)’雜交種純度檢測(cè)。
【專利說明】辣椒雜交種純度檢測(cè)EST-SSR分子標(biāo)記及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明涉及分子標(biāo)記領(lǐng)域，具體涉及辣椒雜交種純度檢測(cè)EST-SSR分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]辣椒屬于茄科辣椒屬一年或多年生草本植物。辣椒以其果實(shí)特有的辣味、色澤和營(yíng)養(yǎng)成分成為一種重要的世界性蔬菜作物。大量研究表明辣椒果實(shí)中含有的抗氧化類物質(zhì)可以保護(hù)生物有機(jī)體免受氧化傷害和提高機(jī)體免疫力。另外，辣椒中辣椒素類物質(zhì)能夠加速能量和脂類的新陳代謝及降低癌癥細(xì)胞的發(fā)生率。隨著大眾對(duì)辣椒營(yíng)養(yǎng)成分和藥用成分的充分認(rèn)識(shí)，栽培面積逐年增加。
[0003]種子是主要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料，種子純度是種子質(zhì)量的核心指標(biāo)，直接影響農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量和優(yōu)良品種的增產(chǎn)潛力，開展作物種子純度檢測(cè)對(duì)保證種子質(zhì)量具有重要意義。作物品種純度鑒定的常用方法主要包括種子形態(tài)鑒定、田間種植形態(tài)鑒定和同工酶電泳技術(shù)鑒定等。種子形態(tài)易受環(huán)境條件影響，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性較差；田間種植形態(tài)鑒定存在周期較長(zhǎng)，成本較高，工作量較大，并且表型易受栽培措施和環(huán)境條件的影響，嚴(yán)重影響品種純度鑒定的效率及準(zhǔn)確性，越來越不能滿足育種工作和生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)的需要；利用同工酶技術(shù)鑒定作物品種純度雖然準(zhǔn)確、可靠，但同工酶標(biāo)記具有組織和器官特異性，信息量非常有限，多態(tài)性不夠豐富。
[0004]隨著辣椒新品種數(shù)量的不斷增加，傳統(tǒng)的鑒定方法難以有效區(qū)分遺傳關(guān)系較近的雜交種。分子標(biāo)記技術(shù)能夠從DNA水平上揭示子代與親本間的遺傳差異，不受環(huán)境條件和栽培措施的影響，無組織、器官及發(fā)育特異性，能夠檢測(cè)微小的變異，不受植株生長(zhǎng)季節(jié)的限制，多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性高，可以大大縮短鑒定時(shí)間。DNA分子標(biāo)記技術(shù)的迅速發(fā)展，使得從基因組水平上檢測(cè)辣椒雜交種純度成為可能。
[0005]‘熱辣I號(hào)’是中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所經(jīng)多年研究選育出的微辣豐產(chǎn)青皮尖椒。該雜交組合播種至開花約59天,至大量收獲約105天。始收時(shí)株高55~60cm，生長(zhǎng)勢(shì)極強(qiáng)，分枝能力強(qiáng)，枝葉茂盛。每畝鮮椒產(chǎn)量4000~5000kg，單果重62.0g左右，果長(zhǎng)21.0~26.0cm，果寬3.3~3.7cm,果肉厚0.3~0.4cm,辣度指數(shù)4352SHU，紅熟果維生素C含量1.62mg g'抗黃瓜花葉病毒病，田間表現(xiàn)耐熱、較耐澇，較抗青枯病和枯萎病，耐疫病、炭疽病。本品種適宜的栽培區(qū)域?yàn)槿珖鱾€(gè)辣椒主產(chǎn)區(qū),最適宜為兩廣、海南等不嗜辣地區(qū)。
[0006]EST-SSR (expressed sequence tag-simple sequence repeat)標(biāo)記，是根據(jù) EST序列中的簡(jiǎn)單串聯(lián)重復(fù)序列開發(fā)的一種標(biāo)記類型，是一類由幾個(gè)核苷酸為重復(fù)單位組成的串聯(lián)重復(fù)序列，根據(jù)串聯(lián)重復(fù)單位數(shù)目的差異檢測(cè)多態(tài)性。辣椒EST-SSR標(biāo)記具有多態(tài)性豐富、共顯性遺傳、穩(wěn)定性和重復(fù)性較好、對(duì)DNA質(zhì)量要求不高、操作簡(jiǎn)單易行、不受環(huán)境因素影響等優(yōu)點(diǎn)，與基因組SSR標(biāo)記相比，EST-SSR標(biāo)記不僅降低了開發(fā)成本、提高了開發(fā)效率，而且節(jié)省了開發(fā)時(shí)間，顯著提高了其利用價(jià)值。近年來，隨著辣椒基因組工程的發(fā)展，辣椒豐富的EST序列資源為EST-SSR標(biāo)記的開發(fā)提供了便利條件。目前辣椒雜交種純度的EST-SSR鑒定方法尚未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]針對(duì)傳統(tǒng)作物雜交種純度檢驗(yàn)方法易受環(huán)境條件和栽培措施的影響，鑒定周期較長(zhǎng)，成本較高，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性較差，費(fèi)時(shí)費(fèi)力等缺點(diǎn)。
[0008]本發(fā)明的一個(gè)目的，是提供一種辣椒雜交種純度檢測(cè)的EST-SSR分子標(biāo)記，其對(duì)
應(yīng)的核苷酸序列如下:
[0009]
引物名稱j正向引物j反向引物
HE45， -AATGGGAAGAGAAATTGTGMAGCA-3，5， -TTCAATGCCAACAATGGCATCCTA-3，
[0010]所述的EST-SSR分子標(biāo)記可應(yīng)用于辣椒雜交種純度的檢測(cè)。
[0011]利用該分子標(biāo)記檢測(cè)‘熱辣I號(hào)’雜交種純度的方法，包括如下步驟:
[0012](I)米用改良的 CTAB 法(AllenGC, Flores-VergaraMA, Krasynanski S，KumarS，Thompson WF.Amo dified protocol for rapid DNA isolation from plant tissuesusing cety I trimethyl ammonium bromide.Nat Protoc, 2006，1:2320 - 2325)提取辣椒葉片基因組DNA，以母本材料04Cal25(母本04Cal25是廣西玉林羊角椒在連續(xù)病圃條件下，經(jīng)6代單花自交選育而成的自交系)和父本材料03Ca21 (父本03Ca21是1998年從熱帶蔬菜種質(zhì)圃內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一株天然雜交株后經(jīng)6代單花自交選育而成的粗牛角椒自交系)基因組DNA為模板，利用開發(fā)的辣椒EST-SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選在親本間表現(xiàn)多態(tài)性的EST-SSR標(biāo)記，其中I對(duì)EST-SSR引物(HE4)在‘熱辣I號(hào)’雜交種和親本間能擴(kuò)增出明顯的多態(tài)性，帶型為雙親互補(bǔ)帶型，可用于‘熱辣I號(hào)’種子純度鑒定。
[0013](2)用于鑒定‘熱辣I號(hào)’(以04Cal25為母本，03Ca21為父本雜交產(chǎn)生的Fl代)辣椒雜交種純度的EST-SSR引物序列包括正向引物序列 HE4F:5’ -AATGGGAAGAGAAATTGTGAAAGCA-3’，反向引物序列 HE4R:5’ -TTCAATGCCAACAATGGCATCCTA-3’。
[0014](3)以‘熱辣I號(hào)’單株DNA為模板加入EST-SSR引物HE4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)特異譜帶的擴(kuò)增結(jié)果鑒定‘熱辣I號(hào)’辣椒雜交種的純度。
[0015]檢測(cè)‘熱辣I號(hào)’辣椒雜交種純度的方法，包括如下步驟:
[0016](I)將‘熱辣I號(hào)’播種于營(yíng)養(yǎng)缽中，待植株長(zhǎng)至5~6片真葉時(shí)利用改良的 CTAB 法(Allen GC, Flores-Vergara MA, Krasynanski S，Kumar S，ThompsonWF.A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissues usingcety I trimethyl ammonium bromide.Nat Protoc, 2006, 1:2320 - 2325)提取‘熱辣 I 號(hào)，單株葉片的基因組DNA。
[0017](2)PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系及程序?yàn)?PCR反應(yīng)體系為IOii L，其中包括10XPCRBufferl u L,0.2mM dNTPs,引物(HE4) 50ng,0.5U Taq DNA 聚合酶，熱辣 I 號(hào)基因組DNA20ng，無菌超純水補(bǔ)齊至IOy L。擴(kuò)增程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min ;94°C變性45s，55°C退火45s，72°C延伸lmin，35個(gè)循環(huán)；72°C終延伸lOmin。PCR產(chǎn)物保存于10°C。
[0018](3)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè):5 i! L擴(kuò)增產(chǎn)物與2 i! L上樣緩沖液混合經(jīng)12%非變性聚丙烯酰胺凝膠(丙烯酰胺:甲叉雙丙烯酰胺=29: I)電泳，220v恒定電壓電泳4h，銀染顯色進(jìn)行帶型統(tǒng)計(jì)。
[0019](4)根據(jù)特異譜帶的擴(kuò)增結(jié)果鑒定‘熱辣I號(hào)’辣椒雜交種的純度。‘熱辣I號(hào)’品種純度(％) = (1-n/N) X 100%，其中N為待測(cè)‘熱辣I號(hào)’種子數(shù)目，n為單獨(dú)具有父本譜帶特征或單獨(dú)具有母本譜帶特征或既不同于‘熱辣I號(hào)’譜帶特征也不同于父母本譜帶特征的植株數(shù)目。
[0020]傳統(tǒng)田間種植形態(tài)鑒定所需時(shí)間較長(zhǎng)，易受環(huán)境條件影響，不能完全滿足雜交種經(jīng)營(yíng)的需要。DNA分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，為辣椒品種純度鑒定提供了更為準(zhǔn)確、快速的方法。本發(fā)明利用在‘熱辣I號(hào)’親本材料間表現(xiàn)多態(tài)性的EST-SSR標(biāo)記HE4，以‘熱辣I號(hào)’單株DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)特異譜帶的擴(kuò)增結(jié)果檢測(cè)雜交種的純度。共顯性的EST-SSR標(biāo)記HE4擴(kuò)增出的特異譜帶能夠?qū)㈦s交種與母本自交種、父本自交種區(qū)分開來；具有雙親特異譜帶的植株屬于真實(shí)的雜交種，缺少父本特異譜帶，與母本擴(kuò)增圖譜一致的為母本自交株。
[0021]相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為:(1)不受栽培措施和環(huán)境條件的影響。
(2)無器官、組織及發(fā)育特異性:該方法在植株生長(zhǎng)的任何時(shí)期均可進(jìn)行鑒定。(3)多態(tài)性豐富、共顯性遺傳:能夠?qū)㈦s交種與母本自交種、父本自交種區(qū)分開來。(4)對(duì)DNA質(zhì)量要求不高且需要量少。(5)成本較低、操作簡(jiǎn)單:該方法在苗期即可進(jìn)行鑒定，節(jié)省大量人力、物力和土地資源。(6)重 復(fù)性和穩(wěn)定性較好。(7)快速高效:6h之內(nèi)即可完成種子純度鑒定工作。(8)準(zhǔn)確性高:該方法從基因組水平上揭示子代與親本間的遺傳差異，克服了田間表型鑒定帶來的誤差。(9)應(yīng)用推廣前景廣闊:可以快速、準(zhǔn)確檢測(cè)‘熱辣I號(hào)’雜交種純度，為開展辣椒制種和良種的及時(shí)銷售提供科學(xué)依據(jù)，有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1:EST_SSR標(biāo)記HE4在親本材料及部分‘熱辣I號(hào)’單株中的擴(kuò)增結(jié)果。其中M代表DL1000DNA Marker, I為‘熱辣I號(hào)’母本材料04Cal25，2為‘熱辣I號(hào)’父本材料03Ca21，3-24為:‘熱辣I號(hào)’單株。檢測(cè)結(jié)果表明，22號(hào)為母本自交株。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明:
[0024]以下如無特殊說明，本發(fā)明所述設(shè)備及材料均為市售設(shè)備及材料。
[0025]本發(fā)明所需主要儀器設(shè)備為:高速冷凍離心機(jī)，水浴鍋，PCR儀，電泳儀，垂直電泳槽。
[0026]本發(fā)明所需主要試劑為:苯酚、氯仿、異戊醇、無水乙醇、CTAB, PCR Buffer、dNTP、Taq DNA聚合酶、超純水、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、TEMED、過硫酸銨、甲酰胺、溴酚藍(lán)、二甲苯腈、EDTA、Tris、硼酸、硝酸銀、甲醛、氫氧化鈉、無水碳酸鈉。
[0027]實(shí)施例1:
[0028](I)將186粒‘熱辣I號(hào)’種子播種于營(yíng)養(yǎng)缽中，待植株長(zhǎng)至5~6片真葉時(shí)利用改良的 CTAB 法(Allen GC, Flores-Vergara MA, Krasynanski S，Kumar S，ThompsonWF.A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissues usingcety I trimethyl ammonium bromide.Nat Protoc, 2006, 1:2320 - 2325)提取單株葉片的基因組DNA。
[0029](2)PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系及程序?yàn)?PCR反應(yīng)體系為IOii L，其中包括10XPCRBufferl u L,0.2mM dNTPs，引物(HE4) 50ng，0.5U Taq DNA 聚合酶，‘熱辣 I 號(hào)’基因組DNA20ng，無菌超純水補(bǔ)齊至IOy L。擴(kuò)增程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min ;94°C變性45s，55°C退火45s，72°C延伸lmin，35個(gè)循環(huán)；72°C終延伸lOmin。PCR產(chǎn)物保存于10°C。
[0030](3)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè):5 ii L擴(kuò)增產(chǎn)物與2 ii L上樣緩沖液混合經(jīng)12%非變性聚丙烯酰胺凝膠(丙烯酰胺:甲叉雙丙烯酰胺=29: I)電泳，220v恒定電壓電泳4h，銀染顯色進(jìn)行帶型統(tǒng)計(jì)。
[0031](4)根據(jù)特異譜帶的擴(kuò)增結(jié)果鑒定‘熱辣I號(hào)’辣椒雜交種的純度。其中，185個(gè)‘熱辣I號(hào)’單株既具有母本特異譜帶也具有父本特異譜帶，屬于真實(shí)的雜交種，22號(hào)單株缺少父本特異帶，與母本帶型一致(附圖1)，說明22號(hào)單株為母本自交株，‘熱辣I號(hào)’辣椒雜交種的純度為99.46%。
[0032](5)鑒定效果檢驗(yàn)
[0033]將取材后的‘熱辣I號(hào)’幼苗按照順序移栽到地勢(shì)平坦、土質(zhì)肥沃的田塊，采用常規(guī)栽培措施進(jìn)行管理，在成株期依據(jù)品種的特征特性逐株進(jìn)行鑒定，其中，22號(hào)植株與母本性狀一樣，果形為細(xì)羊角椒，果色淺綠色，其余植株均具有‘熱辣I號(hào)’辣椒品種的典型特征，生長(zhǎng)一致，葉片較母本材料大些，果形為粗牛角椒，果色深綠色。田間種植形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果與EST-SSR標(biāo)記HE4檢測(cè)結(jié)果一致，該結(jié)果說明EST-SSR標(biāo)記HE4可以快速、準(zhǔn)確地鑒定‘熱辣I號(hào)’辣椒雜交種純度。
[0034]其中，(1)中采用改良的CTAB法提取辣椒葉片的基因組DNA具體步驟如下:
[0035]配制CTAB 提取液(0.1mol [1Tris pH7.5,0.05mol L-1EDTA pH8.0,0.7molL-1NaCl，2%CTAB)，高溫滅菌后，添加2%巰基乙醇，65°C預(yù)熱；
[0036]利用液氮將辣椒葉片研磨成粉末裝入2.0mL離心管中，樣品達(dá)到1/3處為宜，每管加入預(yù)熱的CTAB提取液700 y L置于65°C恒溫水浴箱中45min (每隔8min輕輕搖動(dòng)一次)；
[0037]加入苯酚/氯仿/異戊醇(苯酚:氯仿:異戊醇=25:24:l)700ii L充分混勻16min，動(dòng)作緩慢，4°C 12000rpm離心6min ；
[0038]吸取上清液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇(氯仿:異戊醇=24:1)充分混勻16min，動(dòng)作緩慢，4°C 12000rpm離心6min ；
[0039]吸取上清液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，輕輕混勻，置_20°C冰箱沉淀15min ；
[0040]將絮狀DNA沉淀置于1.5mL離心管中，采用70%乙醇漂洗兩遍，晾干；
[0041]加入120 u L滅菌超純水，4°C冰箱溶解，溶解后母液貯于-20°C冰箱備用。
[0042]以上所述，僅為本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何不經(jīng)過創(chuàng)造性勞動(dòng)想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所限定的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。
[0043]
【權(quán)利要求】
1.辣椒雜交種純度檢測(cè)EST-SSR分子標(biāo)記，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如下:HE4:正向引物:5 ’ -AATGGGAAGAGAAATTGTGAAAGCA-3 ’，反向引物:5 ’ -TTCAATGCCAACAATGGCATCCTA-3，。
2.權(quán)利要求1所述分子標(biāo)記在‘熱辣I號(hào)’雜交種純度檢測(cè)中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103642906SQ201310593868
【公開日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2013年11月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月22日
【發(fā)明者】劉子記, 曹振木, 楊衍, 劉昭華, 劉維俠 申請(qǐng)人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所