來源于水稻的蛋白質(zhì)OsMKK4及其相關(guān)生物材料在調(diào)控植物穂型中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了來源于水稻的蛋白質(zhì)OsMKK4及其相關(guān)生物材料在調(diào)控植物穂型中的應(yīng)用。其中的一種應(yīng)用是培育直立穗型轉(zhuǎn)基因水稻的方法。該方法包括向受體水稻中導(dǎo)入OsMKK4的反義基因得到直立穗型轉(zhuǎn)基因水稻的步驟；所述受體水稻為彎曲穂型水稻；所述OsMKK4是如下a）或b）的蛋白質(zhì)：a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b）在序列表中序列2所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基得到的與植物穂型相關(guān)的由a）衍生的蛋白質(zhì)OsMKK4或與OsMKK4相關(guān)的生物材料可用于調(diào)控植物穂型，特別是水稻穂型。
【專利說明】來源于水稻的蛋白質(zhì)0sMKK4及其相關(guān)生物材料在調(diào)控植物穂型中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及來源于水稻的蛋白質(zhì)0sMKK4及其相關(guān)生物材料在調(diào)控植物穂型中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻是世界上重要的糧食作物之一。隨著耕地面積的減少和人口的快速增長，提高水稻產(chǎn)量對保證我國糧食安全具有十分重要的意義。通過改良植物株型可以有效的提高作物的糧食產(chǎn)量。歷史上株型的改良在水稻品種改良中發(fā)揮了巨大作用。如第一次綠色革命，即水稻的矮化育種，大幅度提高了水稻抗倒伏能力，使水稻單產(chǎn)水平有了第一次飛躍。除株高以外，葉型以及穗型等屬于水稻株型的指標(biāo)，且水稻產(chǎn)量直接由穗型決定。直立穗相對于彎曲穗有許多優(yōu)點(diǎn)，可以減少穗部對中下部的遮光，有利于光合作用，同時(shí)可以提高抗倒伏性，增加群體中co2的擴(kuò)散效率，進(jìn)而提高水稻群體的光合速率，增加產(chǎn)量。
[0003]0sMKK4屬于MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的一個(gè)重要組成部分。MAPK級(jí)聯(lián)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)在酵母、動(dòng)植物等生物中高度保守，參與細(xì)胞分裂、發(fā)育以及對外界環(huán)境的響應(yīng)活動(dòng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供來源于水稻的蛋白質(zhì)0sMKK4及其相關(guān)生物材料的新用途。
[0005]本發(fā)明所提供的一種新用途是0sMKK4或與0sMKK4相關(guān)的生物材料在調(diào)控植物穂型中的應(yīng)用；
[0006]所述0sMKK4是如下a)或b)的蛋白質(zhì):
[0007]a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0008]b)在序列表中序列2所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基得到的與植物穂型相關(guān)的由a)衍生的蛋白質(zhì)；
[0009]所述與0sMKK4相關(guān)的生物材料，為下述B1)至B10)中的任一種:
[0010]B1)降低所述0sMKK4表達(dá)的核酸分子；
[0011]B2)含有B1)所述核酸分子的表達(dá)盒；
[0012]B3)含有B1)所述核酸分子的重組載體、或含有B2)所述表達(dá)盒的重組載體；
[0013]B4)含有B1)所述核酸分子的重組微生物、或含有B2)所述表達(dá)盒的重組微生物、或含有B3)所述重組載體的重組微生物；
[0014]B5)含有B1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、或含有B2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、或含有B3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；
[0015]B6)編碼所述0sMKK4的核酸分子；
[0016]B7)含有B6)所述核酸分子的表達(dá)盒；
[0017]B8)含有B6)所述核酸分子的重組載體、或含有B7)所述表達(dá)盒的重組載體；[0018]B9)含有B6)所述核酸分子的重組微生物、或含有B7)所述表達(dá)盒的重組微生物、或含有B8)所述重組載體的重組微生物；
[0019]B10)含有B6)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、或含有B7)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、或含有B8)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系。
[0020]其中，序列表中序列2由369個(gè)氨基酸殘基組成。
[0021]上文中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA ;所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0022]上文中，降低所述0sMKK4表達(dá)的核酸分子可為所述0sMKK4的反義基因，編碼所述0sMKK4的核酸分子可為所述0sMKK4的編碼基因，所述0sMKK4的編碼基因是如下1)、2)或3): [0023]1)其編碼序列是序列表中序列1的第1-1110位核苷酸的cDNA分子；
[0024]2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的cDNA分子雜交且編碼所述0sMKK4的cDNA分子或基因組DNA ；
[0025]3)與1)或2)限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且編碼所述0sMKK4的cDNA分子或基因組DNA。
[0026]其中，序列表中序列1由1110個(gè)核苷酸組成。
[0027]在核苷酸序列上，所述0sMKK4的反義基因與所述0sMKK4的編碼基因反向互補(bǔ)。
[0028]上述應(yīng)用中，所述植物可為水稻。
[0029]含有所述核酸分子的表達(dá)盒均可含有所述核酸分子和啟動(dòng)所述核酸分子轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。含有所述核酸分子的表達(dá)盒不但可包括啟動(dòng)所述核酸分子轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，還可包括終止所述核酸分子轉(zhuǎn)錄的終止子。進(jìn)一步，所述表達(dá)盒還可包括增強(qiáng)子序列。可用于本發(fā)明的啟動(dòng)子包括但不限于:組成型啟動(dòng)子，組織、器官和發(fā)育特異的啟動(dòng)子，和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。啟動(dòng)子的例子包括但不限于:花椰菜花葉病毒的組成型啟動(dòng)子35S;來自西紅柿的創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，亮氨酸氨基肽酶(〃LAP〃，Chao等人(1999)Plant Physioll20:979-992)；來自煙草的化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，發(fā)病機(jī)理相關(guān)1 (PR1)(由水楊酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羥酸S-甲酯)誘導(dǎo))；西紅柿蛋白酶抑制劑II啟動(dòng)子(PIN2)或LAP啟動(dòng)子(均可用茉莉酮酸曱酯誘導(dǎo))；熱休克啟動(dòng)子(美國專利5，187，267);四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(美國專利5，057，422);種子特異性啟動(dòng)子，如谷子種子特異性啟動(dòng)子pF128 (CN101063139B(中國專利200710099169.7)),種子忙存蛋白質(zhì)特異的啟動(dòng)子(例如，菜豆球蛋白、napin, oleosin和大豆 beta conglycin 的啟動(dòng)子(Beachy 等人(1985)EMBO J.4:3047-3053))。它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用。此處引用的所有參考文獻(xiàn)均全文引用。合適的轉(zhuǎn)錄終止子包括但不限于:農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶終止子(N0S終止子)、花椰菜花葉病毒CaMV35S終止子、tml終止子、豌豆rbcS E9終止子和胭脂氨酸和章魚氨酸合酶終止子(參見，例如:Odell 等人(1985)Nature313:810 ；Rosenberg 等人(1987)Gene, 56:125 ；Guerineau 等人(1991)Mo 1.Gen.Genet, 262:141; Proudfoot (1991) Cell, 64:671; Sanfacon等人 Genes Dev.，5:141;Mogen 等人(1990)Plant Cell, 2:1261 ;Munroe 等人(1990)Gene, 91:151 ;Ballad 等人(1989) Nucleic Acids Res.17:7891 ； Joshi 等人(1987) NucleicAcid Res., 15:9627)。
[0030]可用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有所述表達(dá)盒的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。如PGWB412、pBin438、PCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa 或pCAMBIA1391-Xb (CAMBIA公司)等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3’端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、抗生素的標(biāo)記基因(如賦予對卡那霉素和相關(guān)抗生素抗性的nptll基因，賦予對除草劑膦絲菌素抗性的bar基因，賦予對抗生素潮霉素抗性的hph基因，和賦予對methatrexate抗性的dhfr基因，賦予對草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等(如抗除莠劑基因)、提供代謝甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因。在本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，B3)所述的重組載體為0sMKK4的反義基因表達(dá)載體pIPKb003-AS0sMKK4o
[0031]上文中，所述重組微生物具體可為細(xì)菌，酵母，藻和真菌。其中，細(xì)菌可來自埃希氏菌屬(Escherichia)，歐文氏菌(Erwinia),根癌農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)、黃桿菌屬(Flavobacterium),產(chǎn)喊菌屬(Alcaligenes)，假單胞菌屬(Pseudomonas)，芽胞桿菌屬(Bacillus)等。所述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系為非植物繁殖材料。
[0032]本發(fā)明所提供的另一個(gè)用途是培育直立穗型轉(zhuǎn)基因水稻的方法。
[0033]本發(fā)明所提供的培育直立穗型轉(zhuǎn)基因水稻的方法，包括向受體水稻中導(dǎo)入0sMKK4的反義基因得到直立穗型轉(zhuǎn)基因水稻的步驟；所述受體水稻為彎曲穂型水稻；所述0sMKK4是如下a)或b)的蛋白質(zhì):
[0034]a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0035]b)在序列表中序列2所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基得到的與植物穂型相關(guān)的由a)衍生的蛋白質(zhì)。
[0036]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述受體水稻的品種為蘭勝。
[0037]上述方法中，在核苷酸序列上，所述0sMKK4的反義基因與所述0sMKK4的編碼基因反向互補(bǔ)。
[0038]所述0sMKK4的編碼基因可是如下1)、2)或3):
[0039]1)其編碼序列是序列表中序列1的第1-1110位核苷酸的cDNA分子；
[0040]2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的cDNA分子雜交且編碼所述0sMKK4的cDNA分子或基因組DNA ；
[0041]3)與1)或2)限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且編碼所述0sMKK4的cDNA分子或基因組DNA。
[0042]上述嚴(yán)格條件可為如下:50°C，在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaP04和ImMEDTA的混合溶液中雜交，在50°C，2XSSC，0.1%SDS中漂洗；還可為:50°C，在7% SDS、0.5MNaP04和ImM EDTA的混合溶液中雜交，在50°C，1 X SSC，0.1%SDS中漂洗；還可為:50°C，在7% SDS、0.5M NaP04 和 ImM EDTA 的混合溶液中雜交，在 50°C，0.5XSSC，0.1%SDS 中漂洗；還可為:50°C，在7% SDS、0.5M NaP04和ImM EDTA的混合溶液中雜交，在50°C，0.1 XSSC，
0.1%SDS中漂洗；還可為:50°C，在7% SDS、0.5M NaP04和ImM EDTA的混合溶液中雜交，在65°C，0.1XSSC，0.1%SDS中漂洗；也可為:在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用 2 X SSC, 0.1%SDS 和 1 X SSC, 0.1%SDS 各洗膜一次。
[0043]上述“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性。“同一性”可以用肉眼或計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用計(jì)算機(jī)軟件，兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來評(píng)價(jià)相關(guān)序列之間的同一性。
[0044]上述方法中，其中0sMKK4的反義基因可先進(jìn)行如下修飾，再導(dǎo)入受體植物中，以達(dá)到更好的表達(dá)效果:
[0045]1)根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行修飾和優(yōu)化，以使基因高效表達(dá)；例如，可根據(jù)受體植物所偏愛的密碼子，在保持本發(fā)明0sMKK4的反義基因的氨基酸序列的同時(shí)改變其密碼子以符合植物偏愛性；優(yōu)化過程中，最好能使優(yōu)化后的編碼序列中保持一定的GC含量，以最好地實(shí)現(xiàn)植物中導(dǎo)入基因的高水平表達(dá)，其中GC含量可為35%、多于45%、多于50%或多于約60% ；
[0046]2)修飾鄰近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻譯有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列進(jìn)行修飾；
[0047]3)與各種植物表達(dá)的啟動(dòng)子連接，以利于其在植`物中的表達(dá)；所述啟動(dòng)子可包括組成型、誘導(dǎo)型、時(shí)序調(diào)節(jié)、發(fā)育調(diào)節(jié)、化學(xué)調(diào)節(jié)、組織優(yōu)選和組織特異性啟動(dòng)子；啟動(dòng)子的選擇將隨著表達(dá)時(shí)間和空間需要而變化，而且也取決于靶物種；例如組織或器官的特異性表達(dá)啟動(dòng)子，根據(jù)需要受體在發(fā)育的什么時(shí)期而定；盡管證明了來源于雙子葉植物的許多啟動(dòng)子在單子葉植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，選擇雙子葉植物啟動(dòng)子用于雙子葉植物中的表達(dá)，單子葉植物的啟動(dòng)子用于單子葉植物中的表達(dá)；
[0048]4)與適合的轉(zhuǎn)錄終止子連接，也可以提高本發(fā)明基因的表達(dá)效率；例如來源于CaMV的tml，來源于rbcS的E9 ;任何已知在植物中起作用的可得到的終止子都可以與本發(fā)明基因進(jìn)行連接；
[0049]5)引入增強(qiáng)子序列，如內(nèi)含子序列(例如來源于Adhl和bronzel)和病毒前導(dǎo)序列(例如來源于TMV, MCMV和AMV)。
[0050]上述方法中，0sMKK4的反義基因通過含有0sMKK4的反義基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述受體植物中。
[0051]所述0sMKK4的反義基因表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒，植物病毒栽體，直接DNA轉(zhuǎn)化，微注射，電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞(Weissbach, 1998, Method forPlant Molecular Biology VIII, Academy Press, New York, pp.411-463;Geiserson andCorey,1998，Plant Molecular Biology (2nd Edition)。
[0052]上文中，所述轉(zhuǎn)基因植物理解為不僅包含將所述基因轉(zhuǎn)化目的植物得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物及其無性系，也包括其子代及其無性系。對于轉(zhuǎn)基因植物，可以在該物種中繁殖該基因，也可用常規(guī)育種技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。所述轉(zhuǎn)基因植物包括種子、愈傷組織、完整植株和細(xì)胞。
[0053]本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，向彎曲穂型的水稻中導(dǎo)入所述0sMKK4的反義基因得到的轉(zhuǎn)基因水稻為直立穗型水稻，說明0sMKK4或與0sMKK4相關(guān)的生物材料可用于調(diào)控植物穂型，特別是水稻穂型。
[0054]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0055]圖1為T0代轉(zhuǎn)0sMKK4的反義基因植株的PCR鑒定圖譜。
[0056]圖2為T0代轉(zhuǎn)0sMKK4的反義基因植株和作為轉(zhuǎn)基因受體的水稻品種蘭勝的照片。
【具體實(shí)施方式】
[0057]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0058]下述實(shí)施例中的pIPKb003 (Himmelbach A., Zierold U., Hensel G., RiechenJ.,Douchkov D., Schweizer P., Kumlehn J.(2007).A set of modular binary vectorsfor transformation of cereals.Plant Physiol.145:1192 - 1200),公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。
[0059]下述實(shí)施例中的水稻品種蘭勝(胡江，曾大力，張光恒，郭龍彪，董國軍，高振宇，胡興明，朱麗，劉堅(jiān)，錢前。水稻矮化突變體的遺傳分析和分子定位。中國水稻科學(xué)，2009，23(3):252-256)由中國水稻研究所提供，公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。
[0060]根癌農(nóng)桿菌GV3101 (Li, Y., Zheng, L., Corke, F., Smith, C., and Bevan, M.ff.(2008).Control of final seed and organ size by the DAlgene family inArabidopsis thaliana.Genes Dev22, 1331-1336)公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。
[0061]實(shí)施例1、培育直立穂型的轉(zhuǎn)基因水稻
[0062]1、0sMKK4編碼基因的獲得
[0063]1.1、提取尺熟
[0064]液氮研碎水稻日本晴的幼穗，用天根的植物總RNA提取試劑盒(TIANGEN)，提取總RNA。將得到的總RNA用分光光度計(jì)(Eppendorf公司，德國)檢測樣品中總RNA的濃度。
[0065]1.2、0sMKK4的反義基因的獲得
[0066]根據(jù)RAP-DB (http://rapdb.dna.affrc.g0.jp/)上的 0sMKK4 基因序列設(shè)ii 對引物如下:
[0067]0sMKK4-S:5，-ATGCGACCGGGCGGGCCG ；
[0068]0sMKK4-A:5’ -TCATGACGGAGGCGGTGCGAG。
[0069]取5μ g總RNA,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，用引物對0SMKK4-S和0SMKK4-A進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到分子量約為lllObp的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(TIANGEN)回收該片段。將該回收片段與pCR8/GW-T0P0 (Invitrogen)連接，參照Cohen等的方法(Proc Natl Acad Sci，69:2110)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，根據(jù)PCR8/GW-T0P0載體上的壯觀霉素抗性標(biāo)記篩選陽性克隆，得到含有回收片段的重組質(zhì)粒。以該重組質(zhì)粒載體上的M13F(-20)和M13R為引物對其進(jìn)行核苷酸序列測定，將測序結(jié)果表明含有0sMKK4的反義基因的重組質(zhì)粒命名為T0P0-AS0sMKK4。
[0070]T0P0-AS0sMKK4含有的0sMKK4的反義基因的核苷酸序列與序列表中序列1的第1-1110位核苷酸反向互補(bǔ)。在核苷酸序列上，0SMKK4的反義基因與0SMKK4的編碼基因反向互補(bǔ)，序列表中序列1的第1-1110位核苷酸編碼序列表中序列2的蛋白質(zhì)0sMKK4。
[0071]2、0sMKK4的反義基因表達(dá)載體的構(gòu)建
[0072]Nhel酶切質(zhì)粒T0P0_AS0sMKK4，回收3661bp的含0sMKK4的反義基因的大片段，將其與質(zhì)粒pIPKb003進(jìn)行LR重組反應(yīng)(Invitrogen),參照Cohen等的方法(Proc NatlAcad Sci，69:2110)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，根據(jù)pIPKb003載體上的壯觀霉素抗性標(biāo)記篩選陽性克隆，得到含有0sMKK4的反義基因的重組質(zhì)粒，命名為pIPKb003-AS0sMKK4o
[0073]將pIPKb003-AS0sMKK4 導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌 GV3101，得到含有 pIPKb003_AS0sMKK4 的重組根癌農(nóng)桿菌菌株，將該菌株命名為GV310l-AS0sMKK4。
[0074]3、轉(zhuǎn)基因植株的獲得
[0075]用GV3101_AS0sMKK4轉(zhuǎn)化水稻品種蘭勝，以獲得轉(zhuǎn)0sMKK4的反義基因植株。具體操作如下:
[0076]3.1.水稻成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng):去殼的水稻成熟種子先用70%乙醇浸泡l-2min,然后用0.1%升萊浸泡lOmin,進(jìn)行表面滅菌，無菌水沖洗3_4次，再將種子放在無菌濾紙上吸干水分后，放在成熟胚愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，26°C暗培養(yǎng)。約10-15天后，剝下成熟胚盾片長出的愈傷組織，轉(zhuǎn)入成熟胚繼代培養(yǎng)基上，在相同條件下繼代培養(yǎng)。以后每兩周繼代培養(yǎng)一次。挑選繼代培養(yǎng)5-7天、色澤淡黃的愈傷組織共培養(yǎng)。
[0077]3.2.農(nóng)桿菌的培養(yǎng)
[0078]將GV3101-AS0sMKK4在含有50mg/L壯觀霉素的LB平板上劃線，28°C黑暗培養(yǎng)3天，用一金屬匙收集農(nóng)桿菌菌體，將其懸浮于共培養(yǎng)CM液體培養(yǎng)基中，調(diào)整菌體濃度至0D600為0.3-0.5，加入乙酰丁香酮，使乙酰丁香酮終濃度為100mM，即為共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化水稻用的農(nóng)桿菌懸浮液。
[0079]3.3.水稻愈傷組織與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)
[0080]挑選狀態(tài)較好(繼代培養(yǎng)5-7天、色澤淡黃)的愈傷組織放入100ml無菌三角瓶中，加入適量農(nóng)桿菌懸浮液(保證有足夠的菌液與材料接觸即可)，室溫放置20min，并不時(shí)晃動(dòng)。倒掉菌液，將愈傷組織放在無菌濾紙上吸去多余菌液，隨即轉(zhuǎn)移到鋪有一層無菌濾紙的固體共培養(yǎng)基上，26 °C黑暗培養(yǎng)2-3天。
[0081]3.4.抗性愈傷組織的篩選
[0082]將共培養(yǎng)后的愈傷組織放在含有50mg/l潮霉素的篩選培養(yǎng)基上，26°C暗培養(yǎng)14天，轉(zhuǎn)到新鮮配制的篩選培養(yǎng)基上繼續(xù)篩選14天。大部分愈傷組織在篩選后10天左右褐化，然后在褐化組織的邊緣重新生長出乳白色的抗性愈傷組織。
[0083]3.5.抗性愈傷組織的分化
[0084]從經(jīng)兩輪篩選后長出的抗性愈傷組織中，挑選乳黃色致密的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)至含有50mg/L潮霉素的分化培養(yǎng)基上，先暗培養(yǎng)3天，然后轉(zhuǎn)至15h/d光照條件下培養(yǎng)，一般經(jīng)過15-25天左右，有綠點(diǎn)出現(xiàn)。30-40天后進(jìn)一步分化出小苗。
[0085]3.6.生根、壯苗和移栽
[0086]當(dāng)抗性愈傷組織分化的芽長至約2cm時(shí)，將小苗移到生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)兩周左右。選擇高約10cm、根系發(fā)達(dá)的小苗，洗去培養(yǎng)基，移栽至田間，得到10株T0代轉(zhuǎn)0sMKK4的反義基因植株，編號(hào)為 AS-1、AS-2、AS-3、AS-4、AS-5、AS-6、AS-7、AS-8、AS-9、AS-10。
[0087]其中，所用的培養(yǎng)基配方如下:
[0088]誘導(dǎo)培養(yǎng)基:N6大量元素+MS_Fe鹽+B5微量元素+B5有機(jī)+2，4_D2.5mg/L+proline500mg/l+glutamine500mg/l+CH300mg/l+麥芽糖 / 鹿糖 30g/l+Gelrite2.6mg/l,ρΗ5.8ο
[0089]繼代培養(yǎng)基:同誘導(dǎo)培養(yǎng)基，但是2，4-D改為2.0mg/L。
[0090]共培養(yǎng)(固體)培養(yǎng)基:N6大量元素+MS-Fe鹽+B5微量元素+B5有機(jī)+2，4_D2.0mg/L+CH500mg/l+肌醇 2000mg/L+AS100yM+麥芽糖 /蔗糖 30g/l+Gelrite2.6mg/l,pH5.5。(液體選擇培養(yǎng)基無Gelrite)。
[0091 ] 篩選培養(yǎng)基:N6大量元素+MS-Fe鹽+B5微量元素+B5有機(jī)+2，4_D2.0mg/L+proline500mg/l+glutamine500mg/l+CH300mg/l+ 麥芽糖 / 鹿糖 30g/l+Gelrite2.6mg/l+cef250mg/l+Hyg50mg/l, pH5.8。
`[0092]分化培養(yǎng)基:N6大量元素+MS-Fe鹽+B5微量元素+B5有機(jī)+NAA0.lmg/L+KT4mg/L+proline500mg/l+glutamine500mg/l+CH300mg/l+ 麥芽糖 / 鹿糖 30g/l+Gelrite2.6mg/1+cef.250mg/l+Hyg50mg/1, pH5.8。
[0093]生根培養(yǎng)基:1/2N6大量元素+MS_Fe鹽+B5微量元素+蔗糖30g/l+Agar0.8%，pH5.8。
[0094]3.7、轉(zhuǎn)0sMKK4的反義基因植株的鑒定
[0095]將3.6得到的10株TO代轉(zhuǎn)0sMKK4的反義基因植株(編號(hào)為AS_1、AS_2、AS-3、AS-4、AS-5、AS-6、AS-7、AS-8、AS-9、AS-10 )通過PCR來進(jìn)一步鑒定。以新鮮的轉(zhuǎn)基因植株葉片的基因組DNA為模板，用引物對K4AS-F/K4AS-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物如下:
[0096]K4AS-F:aagaggggaaaagggcacta,
[0097]K4AS-R:agtccgcaaaaatcaccagt。
[0098]檢測結(jié)果如圖1所示。10株T0代轉(zhuǎn)0sMKK4的反義基因植株均可以擴(kuò)增出大小為1945bp的條帶，作為轉(zhuǎn)基因受體的水稻品種蘭勝因?yàn)闆]有載體pIPKb003的序列，不能擴(kuò)增出條帶。圖1中，泳道1-10為1'0代轉(zhuǎn)(^1?4的反義基因植株45-1、45-2、45-3、45-4、AS-5、AS-6、AS-7、AS_8、AS_9、AS-10，泳道11為作為轉(zhuǎn)基因受體的水稻品種蘭勝，泳道12為 pIPKb003-AS0sMKK4。
[0099]4、表型鑒定
[0100]將3.6得到的10株T0代轉(zhuǎn)0sMKK4的反義基因植株(編號(hào)為AS_1、AS_2、AS-3、AS-4、AS-5、AS-6、AS-7、AS-8、AS-9、AS-10)和10株作為轉(zhuǎn)基因受體的水稻品種蘭勝在田間自然條件下生長，成熟時(shí)觀察穗部表型并拍照記錄，結(jié)果表明10株T0代轉(zhuǎn)0SMKK4的反義基因植株(編號(hào)為 AS-1、AS-2、AS-3、AS-4、AS-5、AS-6、AS-7、AS-8、AS-9、AS-10)在田間均為直立穗型(直立密穗)，而10株作為轉(zhuǎn)基因受體的水稻品種蘭勝在田間均為彎曲穗型(圖2)。
[0101]圖2中A是作為轉(zhuǎn)基因受體的水稻品種蘭勝(野生型)，B為T0代轉(zhuǎn)0sMKK4的反義基因植株，C中左邊是作為轉(zhuǎn)基因受體的水稻品種蘭勝(野生型)的穗部，右邊為T0代轉(zhuǎn)0sMKK4的反義 基因植株的穗部。A, B中標(biāo)尺為10cm，C中標(biāo)尺為5cm。
【權(quán)利要求】
1.培育直立穗型轉(zhuǎn)基因水稻的方法，包括向受體水稻中導(dǎo)入0SMKK4的反義基因得到直立穗型轉(zhuǎn)基因水稻的步驟；所述受體水稻為彎曲穂型水稻；所述0sMKK4是如下a)或b)的蛋白質(zhì):a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)在序列表中序列2所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基得到的與植物穂型相關(guān)的由a)衍生的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:在核苷酸序列上，所述0sMKK4的反義基因與所述0sMKK4的編碼基因反向互補(bǔ)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于:所述0sMKK4的編碼基因是如下1)、2)或 3):1)其編碼序列是序列表中序列1的第1-1110位核苷酸的cDNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的cDNA分子雜交且編碼所述0sMKK4的cDNA分子或基因組DNA ；3)與1)或2)限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且編碼所述0sMKK4的cDNA分子或基因組DNA。
4.0sMKK4或與0sMKK4相關(guān)的生物材料在調(diào)控植物穂型中的應(yīng)用；所述0sMKK4是如下a)或b)的蛋白質(zhì):a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)在序列表中序列2所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基得到的與植物穂型相關(guān)的由a)衍生的蛋白質(zhì)；所述與0sMKK4相關(guān)的生物材料，為下述B1)至B10)中的任一種:B1)降低所述0sMKK4表達(dá)的核酸分子；B2)含有B1)所述核酸分子的表達(dá)盒；B3)含有B1)所述核酸分子的重組載體、或含有B2)所述表達(dá)盒的重組載體；B4)含有B1)所述核酸分子的重組微生物、或含有B2)所述表達(dá)盒的重組微生物、或含有B3)所述重組載體的重組微生物；B5)含有B1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、或含有B2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、或含有B3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；B6)編碼所述0sMKK4的核酸分子；B7)含有B6)所述核酸分子的表達(dá)盒；B8)含有B6)所述核酸分子的重組載體、或含有B7)所述表達(dá)盒的重組載體；B9)含有B6)所述核酸分子的重組微生物、或含有B7)所述表達(dá)盒的重組微生物、或含有B8)所述重組載體的重組微生物；B10)含有B6)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、或含有B7)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、或含有B8)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:降低所述0sMKK4表達(dá)的核酸分子為所述0sMKK4的反義基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于:在核苷酸序列上，所述0sMKK4的反義基因與所述0sM KK4的編碼基因反向互補(bǔ)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于:所述0sMKK4的編碼基因是如下1)、2)或3):1)其編碼序列是序列表中序列1的第1-1110位核苷酸的cDNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的cDNA分子雜交且編碼所述0sMKK4的cDNA分子或基因組DNA ；3)與1)或2)限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且編碼所述0sMKK4的cDNA分子或基因組DNA。
8.根據(jù)權(quán)利要求4- 5中任一所述的應(yīng)用，其特征在于:所述植物為水稻。
【文檔編號(hào)】C12N15/82GK103667339SQ201310631714
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月29日
【發(fā)明者】李云海, 段朋根 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所