一種大黃魚肝臟細胞系及其建立方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種大黃魚肝臟細胞系及其構(gòu)建方法，該細胞系于2013年10月31日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏登記入冊編號為：CCTCCNO:C2013157。本發(fā)明的大黃魚肝臟細胞系可連續(xù)傳代，能夠提供大量的大黃魚肝臟細胞系，用于病原特性研究、疫苗研制、功能基因研究及育種研究等；其性狀優(yōu)良，為類纖維細胞，多有偽足伸出，成不規(guī)則狀等。分裂旺盛，傳代時間短，易消化，貼壁率好，耐饑餓。本發(fā)明的構(gòu)建方法重復(fù)性強、構(gòu)建的細胞系穩(wěn)定性好。
【專利說明】一種大黃魚肝臟細胞系及其建立方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于魚類細胞培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種大黃魚肝臟細胞系及其建立方法。
【背景技術(shù)】
[0002]大黃魚(Larimichthys crocea),硬骨魚綱,S盧形目，石首魚科，黃魚屬。肉質(zhì)鮮嫩，經(jīng)濟價值較高，市場需求量較大。上世紀70年代以前野生大黃魚資源較充沛，年平均捕撈量一度達到12萬噸的水平。70年代初由于對野生大黃魚尤其是對其越冬群體的濫捕亂撈，致使野生大黃魚產(chǎn)量迅速枯竭。80年代以后，隨著近海經(jīng)濟開發(fā)、環(huán)境污染等原因，導(dǎo)致近海的原各大產(chǎn)卵場不再適宜大黃魚產(chǎn)卵，現(xiàn)野生大黃魚捕獲量極低。1986年大黃魚人工育苗得以突破，隨后得到重視迅猛發(fā)展，現(xiàn)階段市場大黃魚都是由海水養(yǎng)殖大黃魚來提供_。然而，現(xiàn)階段伴隨工業(yè)化發(fā)展，近海養(yǎng)殖環(huán)境進一步惡化；大黃魚病害頻發(fā)；大黃魚親魚資源枯竭，種質(zhì)退化等因素極大 的限制了大黃魚養(yǎng)殖的進一步發(fā)展，現(xiàn)階段大黃魚養(yǎng)殖產(chǎn)量約8.6萬噸，不及70年代以前的捕撈量。因此對大黃魚病害防治、良種選育、遺傳背景的研究極為迫切。
[0003]建立魚類細胞系能為魚類病毒分離、抗病毒機制、疫苗研發(fā)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)、嵌合體組織工程等研究提供極大的便捷，且設(shè)施人力等資源要求相對活體實驗低，重復(fù)性好，研究周期短。目前關(guān)于大黃魚細胞系的建立僅有孫愛在2010年報道建立了大黃魚成魚的魚鰭、吻端、脾臟三種細胞系，而未見其他組織細胞系的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種大黃魚肝臟細胞系。
[0005]本發(fā)明的另一目的在于提供上述大黃魚肝臟細胞系的建立方法。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0007]—種大黃魚肝臟細胞系(即生物材料樣品保藏證明中的大黃魚肝細胞系LYCL)，該細胞系于2013年10月31日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(地址:中國.武漢.武漢大學(xué))，保藏登記入冊編號為CCTCC N0:C2013157o
[0008]本發(fā)明的另一技術(shù)方案如下:
[0009]一種上述大黃魚肝臟細胞系的建立方法，包括如下步驟:
[0010](I)大黃魚肝臟組織的獲取:將7個月大，長9-llcm的大黃魚魚苗在含青霉素及鏈霉素雙抗的滅菌海水(青霉素及鏈霉素雙抗購自康寧公司，該雙抗的100X濃縮液含10000U/mL青霉素以及10000 μ g/mL鏈霉素，配制海水時每IOOmL海水加入ImL青霉素及鏈霉素雙抗的100X濃縮液)中暫養(yǎng)1-1.5h，然后滴入占滅菌海水體積0.005-0.015%的丁香酚，直至魚體翻轉(zhuǎn)，腹部朝上，對刺激物應(yīng)激行為為止；以滅菌紗布塊擦除魚體表面粘液，以浸有酒精的棉球擦拭魚體表面后，取出大黃魚肝臟組織并置于含青霉素及鏈霉素雙抗的D-hanks液(IOOmL D-hanks液加入ImL青霉素及鏈霉素雙抗的100X濃縮液)中；[0011](2)原代培養(yǎng):將上述大黃魚肝臟組織切碎至0.7-2.0mm3的小組織塊，以D-hanks液漂洗，最后以完全培養(yǎng)液漂洗；漂洗后將上述小組織塊接種于細胞培養(yǎng)瓶中，吸除多余培養(yǎng)液，翻轉(zhuǎn)瓶身27°C恒溫干貼24h，再加入完全培養(yǎng)液，翻正瓶身以使小組織塊浸入培養(yǎng)液中，于27°C恒溫培養(yǎng)啟動原代培養(yǎng),每周更換完全培養(yǎng)液一次；
[0012](3)傳代培養(yǎng):原代培養(yǎng)至貼壁細胞增殖至至少50-60%覆蓋率時，移除舊培養(yǎng)液，并清洗去除殘留的血清和二價金屬離子；然后以0.25%胰酶消化法傳代懸起細胞，以1:2-10進行傳代；以后每隔2-8天傳代一次，所述大黃魚肝臟細胞系建立成功。
[0013]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述完全培養(yǎng)液中包括:DMEM/F12培養(yǎng)液、胎牛血清FBS、β-巰基乙醇、N-乙酰葡糖糖胺、羧甲基纖維素鈉、人FGF-basic、人EGF、人HGF、青霉素及鏈霉素。
[0014]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述完全培養(yǎng)液為:以DMEM/F12培養(yǎng)液為基礎(chǔ)，包括終濃度分別為16.7%胎牛血清FBS、0.5%ο β -巰基乙醇、50 μ g/mL N-乙酰葡糖糖胺、50μg/mL羧甲基纖維素鈉、10μg/L人FGF-basic、5μg/L人EGF、lμg/L人HGF、100IU/mL青霉素以及100 μ g/mL鏈霉素。
[0015]本發(fā)明的有益效果是:
[0016]1、本發(fā)明的大黃魚肝臟細胞系可連續(xù)傳代，迄今已傳代40代，能夠提供大量的大黃魚肝臟細胞系，用于病原特性研究、疫苗研制、功能基因研究及育種研究等。
[0017]2、本發(fā)明的大黃魚肝臟細胞系的構(gòu)建方法重復(fù)性強、構(gòu)建的細胞系穩(wěn)定性好；
[0018]3、本發(fā)明的大黃魚肝臟細胞系的細胞性狀優(yōu)良。為類纖維細胞，多有偽足伸出，成不規(guī)則狀等。分裂旺盛，傳代時間短，易消化，貼壁率好，耐饑餓；
[0019]4、本發(fā)明的構(gòu)建方法所使用的完全培養(yǎng)液中包括DMEM/F12培養(yǎng)液、胎牛血清FBS、β-巰基乙醇、N-乙酰葡糖糖胺、羧甲基纖維素鈉、人FGF- basic、人EGF、人HGF、青霉素及鏈霉素，DMEM/F12培養(yǎng)液和胎牛血清FBS為細胞生長提供了充足的營養(yǎng)；β -巰基乙醇、N-乙酰葡糖糖胺、羧甲基纖維素鈉、人FGF-basic、人EGF和人HGF的加入可以刺激細胞活性、加速細胞分裂增殖，同時為細胞體外培養(yǎng)提供了良好的緩沖環(huán)境，能夠使細胞在長期培養(yǎng)時維持穩(wěn)定的PH ;青霉素和鏈霉素加大了抗菌譜，特別在原代培養(yǎng)時，能有效地抑制細菌生長，防止細胞污染。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為本發(fā)明的大黃魚肝臟細胞系原代培養(yǎng)第7天的顯微鏡照片(50X);
[0021]圖2為本發(fā)明的大黃魚肝臟細胞系原代培養(yǎng)第15天的顯微鏡照片(50X);
[0022]圖3為本發(fā)明的大黃魚肝臟細胞系原代培養(yǎng)第61天的顯微鏡照片(50X )；
[0023]圖4為本發(fā)明的大黃魚肝臟細胞系傳代培養(yǎng)第2代的顯微鏡照片(50X )；
[0024]圖5為本發(fā)明的大黃魚肝臟細胞系傳代培養(yǎng)第9代的顯微鏡照片(50X )；
[0025]圖6為本發(fā)明的大黃魚肝臟細胞系傳代培養(yǎng)第21代的顯微鏡照片(50X )；
[0026]圖7為本發(fā)明的大黃魚肝臟細胞系傳代培養(yǎng)第35代的顯微鏡照片(50X )；
[0027]圖8為本發(fā)明的大黃魚肝臟細胞系在不同傳代比例下的增殖曲線；
[0028]圖9為本發(fā)明的大黃魚肝臟細胞系凍存后復(fù)蘇24h后的顯微鏡照片(50 X )；
[0029]圖10為本發(fā)明的大黃魚肝臟細胞系凍存后復(fù)蘇72h后的顯微鏡照片(50X );[0030]圖11為本發(fā)明的大黃魚肝臟細胞系凍存復(fù)蘇后再傳代的顯微鏡照片(50X)
[0031]圖12為本發(fā)明的大黃魚肝臟細胞系的染色體圖(100X);
[0032]圖13為本發(fā)明的大黃魚肝臟細胞系的染色體數(shù)目分布圖；
[0033]圖14為本發(fā)明的大黃魚肝臟細胞系饑餓處理30天后的顯微鏡照片(50X);
[0034]圖15為本發(fā)明的大黃魚肝臟細胞系饑餓處理后更換完全培養(yǎng)液36h的顯微鏡照片(50X);
[0035]圖16為本發(fā)明的大黃魚肝臟細胞系轉(zhuǎn)染pEGFP-Nl質(zhì)粒36h的顯微照片(100 X )
[0036]圖17為本發(fā)明的大黃魚肝臟細胞系轉(zhuǎn)染0ct4-pEGFP_Nl重組載體36h的顯微鏡照片(100X )。
【具體實施方式】
[0037]以下通過【具體實施方式】結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案進行進一步的說明和描述。
[0038]溶液配制
[0039]D-Hanks 溶液:取 0.4g KCl, 0.06g KH2PO4,8.0g NaCl，0.35g NaHCO3,0.132gNaH2PO4.12H20 定容至 1L，于 121。。20min 高壓滅菌，4°C保存。另取 D-Glucose 配成 200g/L貯存液，121°C 20min高壓滅菌，冷卻后-20°C長期貯存。使用時每L D-Hanks溶液加入5mL D-Glucose貯存液以及IOmL 100X雙抗溶液(購自康寧公司，該雙抗的100X濃縮液含10000U/mL青霉素以及10000 μ g/mL鏈霉素)。
[0040]含雙抗的滅菌海水:取新鮮海水，于121°C 20min高壓滅菌，使用時每IL滅菌海水加入IOmLlOOX雙抗溶液(購自康寧公司，該雙抗的100X濃縮液含10000U/mL青霉素以及10000 μ g/mL 鏈霉素)。
[0041]完全培養(yǎng)液:取商品化500mL DMEM/F12培養(yǎng)液，然后加入終濃度分別為16.7%胎牛血清FBS、0.5%ο β -巰基乙醇、50 μ g/mL N-乙酰葡糖糖胺、50 μ g/mL羧甲基纖維素鈉、10μ g/L 人 FGF-basic、5y g/L 人 EGF、ly g/L 人 HGF、100IU/mL 青霉素以及 100 μ g/mL 鏈霉素。4°C保存，使用時間不超過I個月。
[0042]10%甘油凍存液:甘油于121 °C 20min高壓滅菌。取IOmL甘油與90mL的胎牛血清
混勻，4 °C保存。
[0043]秋水仙堿忙存液:取上述配置D-hanks溶液，加入250mg秋水仙堿,定容至125mL,充分溶解，于超凈臺內(nèi)以0.22 μ m針頭過濾器過濾除菌。貯存液濃度為2mg/mL( 100 X )，除菌后密封，4 °C保存。
[0044]低滲溶液:稱取0.3g KCl溶于IOOmL超純水中。室溫長期有效。
[0045]MTT貯存液:取上述配置D-hanks溶液，加入250mg MTT粉末，充分溶解，定容至50mL,于超凈臺內(nèi)以0.22 μ m針頭過濾器過濾除菌。貯存液濃度為5mg/mL，除菌后以錫箔紙包裹避光，_20°C保存。
[0046]卡諾氏固定液:將醋酸與甲醇按照1:3的比例混合，而后置于-20°C短期保存，配好后有效期不超過I天。 [0047]Giemsa染液母液:稱取0.5g Giemsa干粉，加入5mL甘油，充分碾磨；繼續(xù)加入28mL甘油，以錫箔紙包裹，于60°C加熱2h;添加33mL甲醇，混勻。母液存放于棕色玻璃瓶中，放置3周以后使用，室溫長期保存。[0048]實施例1
[0049]本發(fā)明大黃魚肝臟細胞系的建立:
[0050]( I)由于大黃魚屬石首魚科魚類，對次氯酸鹽極度敏感，故在體表消毒步驟采用含雙抗的滅菌海水代替次氯酸消毒液。將7個月大,長9-llcm的大黃魚魚苗在含雙抗的滅菌海水中暫養(yǎng)I~2h。結(jié)束時滴入3-4滴丁香酚，直至魚體翻轉(zhuǎn)，腹部向上，對刺激無應(yīng)激行為為止。以滅菌紗布塊擦除魚體表黏液。以浸有75%酒精的棉球擦拭魚體表2次。將魚體移入超凈臺，用解剖器具取出肝臟組織，并放入事先加好D-hanks中培養(yǎng)皿中漂洗3-4次。
[0051](2)將肝臟組織塊以兩把11號手術(shù)刀交叉切碎至Imm3大小左右的小組織塊。將切好的小組織塊以含雙抗的D-hanks溶液漂洗2次，最后以含血清生長因子的培養(yǎng)液漂洗一次。將組織塊接種于25cm2細胞培養(yǎng)瓶中，吸除多余培養(yǎng)液。輕輕翻轉(zhuǎn)瓶身，使之倒置。于27°C恒溫干貼24h。小心加入5mL完全培養(yǎng)液(含雙抗、生長因子)，輕輕翻正培養(yǎng)瓶以使組織塊浸入培養(yǎng)液中。于27°C恒溫培養(yǎng)啟動原代培養(yǎng),每周換完全培養(yǎng)液一次。
[0052]如圖1至圖3所示，大黃魚肝臟組織啟動原代培養(yǎng)后第7天即有貼壁細胞遷徙出組織塊(圖1)，至第15天已有小片細胞簇出現(xiàn)(圖2)，至第61天一些組織塊周圍出現(xiàn)密集細胞堆疊現(xiàn)象(圖3)。
[0053](3)當(dāng)大黃魚肝臟細胞系原代培養(yǎng)貼壁細胞覆蓋率達到50-60%或是更高時，原代細胞可能會出現(xiàn)較明顯的接觸抑制，此時以胰酶消化法啟動傳代培養(yǎng)。采用經(jīng)典細胞消化步驟:移除原先培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)液；加入5mLD-Hanks溶液，清洗I次以去除原培養(yǎng)液中的血清、二價金屬離子(此類物質(zhì)會極大地影響胰蛋白酶的消化作用)；倒出上述D-Hanks溶液，加入2.5mL0.25%的 商品化的含EDTA的胰酶消化液，晃動瓶體，使胰酶溶液與底層細胞充分接觸，倒出胰酶消化液(此步應(yīng)較快進行，否則易造成消化過度；移除胰酶消化液時應(yīng)留有足夠使平底保持濕潤的溶液，否則瓶底易出現(xiàn)部分區(qū)域變干而影響消化)；移出培養(yǎng)瓶，倒置顯微鏡下觀察，至大多數(shù)細胞變圓解除貼壁后，立即移入超凈臺加入5mL含血清培養(yǎng)液終止消化；吹打，鏡檢吹打效果，如若殘余細胞過多則可重復(fù)消化一次；以1:2-10的比例將細胞懸液接種至新培養(yǎng)瓶，補齊培養(yǎng)液至5mL后將培養(yǎng)瓶置于27°C恒溫培養(yǎng)，以后每隔2-8天傳代一次。如圖4至7所示，大黃魚肝臟細胞系從2代至第35代較穩(wěn)定地呈現(xiàn)類纖維狀多邊形。
[0054]實施例2
[0055]實施例1的大黃魚肝臟細胞系的凍存與復(fù)蘇。
[0056](I)凍存:取一瓶75cm2的生長旺盛鋪滿培養(yǎng)瓶瓶底的大黃魚肝臟細胞系細胞，采用胰酶消化法，離心后收集細胞沉淀，緩慢加入3mL配置好的細胞凍存液，并輕輕吹打細胞，使其均勻分散在細胞凍存液中，使用移液槍將液體移入凍存管中。凍存管在4°C放置lh，再置于冰盒中，將冰盒置于-80°C放置I天，最后取出凍存管并浸入液氮中，可長期凍存。
[0057](2)將凍存管從液氮中取出，迅速放置在已經(jīng)調(diào)節(jié)好溫度(40°C)的水浴鍋中，融化細胞的過程中應(yīng)不斷地搖晃凍存管，使其快速均勻解凍，直至完全融化。將融化的細胞懸液轉(zhuǎn)移到25cm2培養(yǎng)瓶離心管中，向培養(yǎng)瓶中補齊5mL的完全培養(yǎng)液，于27°C，5%C02培養(yǎng)。24h后更換新的完全培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)。
[0058]如圖9所示，對于大黃魚肝臟細胞系凍存后復(fù)蘇24h貼壁率達到60%_80%，與凍存前的細胞形態(tài)無明顯差異；如圖10所示凍存后復(fù)蘇72h后細胞可長滿培養(yǎng)瓶瓶底；如圖11，復(fù)蘇后的大黃魚肝臟細胞可以進行正常傳代，且與凍存前細胞以及凍存復(fù)蘇后的細胞形態(tài)無差異。
[0059]實施例3
[0060]實施例1的大黃魚肝臟細胞系不同傳代比例增殖曲線的影響及群體倍增時間分析:
[0061]從實施例1所建立的大黃魚肝臟細胞系中選取形態(tài)良好、增殖旺盛的細胞，消化傳代，分別以1: 2、1: 3、1:5和1:10進行傳代至25cm2細胞培養(yǎng)瓶(即向4個培養(yǎng)瓶分別加入2.5mL, 1.6mL, lmL，0.5mL細胞懸液，而后以培養(yǎng)液將各瓶溶液總量補齊至5mL)。從傳代24h起每隔24h拍照一次，采用經(jīng)典五點交叉取樣法對培養(yǎng)細胞進行倒置顯微拍攝統(tǒng)計視野觀測細胞數(shù)，每組取5點觀測細胞數(shù)總和作圖分析。
[0062]如圖8所示，對于大黃魚肝臟細胞系，不同的傳代比例對細胞影響很大，除了 1:2傳代組外，其余組增殖均十分緩慢。第一天末的總貼壁數(shù)目與接種密度成正比，之后除1:2組以外，其余組均以較慢的 速度增殖。
[0063]實施例4
[0064]實施例1的大黃魚肝臟細胞系的染色體分析:
[0065]取分裂旺盛取分裂旺盛的大黃魚肝臟細胞，接種至75cm2細胞培養(yǎng)瓶，待細胞增長處于對數(shù)期，加入終濃度為20 μ g/mL的秋水仙堿，繼續(xù)培養(yǎng)6-8h后收集細胞得到細胞懸液。將細胞懸液移至15mL離心管，1000g離心10 min，輕輕吸出上清液，加入4mL3%。KCl低滲30min ;加入0.5mL新鮮配置預(yù)冷的卡諾氏固定液預(yù)固定IOmin, 2000g離心10min ;取細胞沉淀加入0.5mL卡諾氏固定液，以移液槍重懸沉淀；再加入ImL固定液；30cm高度向玻璃載玻片(于-20°C預(yù)處理)滴片，水平放置以使其徹底延展，65°C干燥；而后浸入含Giemsa染液工作液的染缸中染色lOmin，雙蒸水沖洗以去除玻片表面渣滓，干燥，中性樹脂封片，1000X油鏡觀察計數(shù)。
[0066]如圖12和圖13所示，對大黃魚細胞系的染色體分析顯示大黃魚細胞系的核型均呈現(xiàn)近似正態(tài)分布:56%觀測到的分裂相細胞染色體數(shù)目為48條；染色體數(shù)目均分布在單倍體與四倍體之間(24-96條)。
[0067]實施例5
[0068]實施例1的大黃魚肝臟細胞系的饑餓處理
[0069]取細胞覆蓋率80%_100%的大黃魚細胞，用完全培養(yǎng)液換液，于27°C，5%C02培養(yǎng)，30d后發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液顏色由橙色變成淺黃色，說明培養(yǎng)液中的營養(yǎng)物質(zhì)被大量消耗。顯微鏡下觀察大黃魚肝臟細胞形態(tài)，如圖14所示，可見由大量細胞解除貼壁而形成空洞狀；部分細胞由于營養(yǎng)消耗細胞發(fā)生皺縮，在顯微鏡下觀察折光性增強；細胞仍有較多細胞存活且形態(tài)未發(fā)生變化。如圖15所示，當(dāng)再次補給新鮮的完全培養(yǎng)液后，存活下來的細胞可以再次增值，分裂仍然旺盛，形態(tài)也未發(fā)生變化。
[0070]實施例6
[0071]實施例1的大黃魚肝臟細胞系轉(zhuǎn)染pEGFP-Nl質(zhì)粒以及功能基因oct4
[0072]設(shè)計大黃魚oct4基因的正反向引物，擴增不含終止密碼子的大黃魚oct4基因的 orf。正向引物 oct4F:TACGAGCTCGCCACCATGACGGAGAGACC 和反向引物 oct4R:ACGGAATTCTTCCAGTCAGGTGACTAACC,其中 GAGCTC 為 SacI 酶切位點，GCCACC 為增強表達的Kozak序列，GAATTC為EcoRI酶切位點，T為避免三聯(lián)子移碼突變的占位堿基。用SacI和EcoRI內(nèi)切酶對pEGFP-Nl質(zhì)粒進行雙酶切，并將擴增出的大黃魚oct4基因的orf片段鏈接到真核表達質(zhì)粒PEGFP-Nl上，成功構(gòu)建出oct4-pEGFP-Nl重組質(zhì)粒。
[0073]感受態(tài)細菌細胞制備:采用大腸桿菌DH5a菌種，采用經(jīng)典氯化鈣法制備感受態(tài)細胞，_80°C長期保存。
[0074]質(zhì)粒轉(zhuǎn)化:取Ing DNA溶液置于EP管中，冰浴放置。從_80°C冰箱取出100μ L感受態(tài)細菌懸液，迅速溶解，加入DNA溶液中，冰浴lOmin。42°C，水浴2min。將EP管于37°C 220轉(zhuǎn)培養(yǎng)Ih。而后將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于含抗生素的LB固體培養(yǎng)平板上。
[0075]質(zhì)粒制備:按照HiPure Plasmid MaxiPrep Kit質(zhì)粒大提試劑盒(TransGene公司)說明書提取pEGFP-Nl質(zhì)粒和oct4-pEGFP-Nl重組質(zhì)粒，_20°C保存。
[0076]轉(zhuǎn)染細胞:取旺盛生長的大黃魚肝臟細胞系細胞，以1:2接種于12孔板，27°C，5%C02培養(yǎng)。待細胞覆蓋率至70% — 80%后，按照sofast轉(zhuǎn)染試劑(購自太陽馬公司)說明書進行操作。27°C，5%C02培養(yǎng)，24h以后檢測熒光表達。
[0077]利用梭華一Sofast介導(dǎo)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染大黃魚肝臟細胞系24h后，于熒光顯微鏡下鏡檢能夠檢測到綠色熒光，即如圖16和圖17所示，pEGFP-Nl質(zhì)粒以及-大黃魚功能基因oct4在該細胞系中有表 達。轉(zhuǎn)染36h后，仍能觀察到綠色熒光。說明建立的大黃魚肝臟細胞系可以適應(yīng)外源基因的轉(zhuǎn)染實驗。
[0078]以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，故不能依此限定本發(fā)明實施的范圍，SP依本發(fā)明專利范圍及說明書內(nèi)容所作的等效變化與修飾，皆應(yīng)仍屬本發(fā)明涵蓋的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種大黃魚肝臟細胞系，其特征在于:該細胞系于2013年10月31日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏登記入冊編號為=CCTCC N0:C2013157o
2.—種權(quán)利要求1所述的大黃魚肝臟細胞系的建立方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)大黃魚肝臟組織的獲取:將7個月大，長9-1Icm的大黃魚魚苗在含青霉素及鏈霉素雙抗的滅菌海水中暫養(yǎng)1-1.5h，然后滴入占滅菌海水體積0.005-0.015%的丁香酚，直至魚體翻轉(zhuǎn)，腹部朝上，對刺激物應(yīng)激行為為止；以滅菌紗布塊擦除魚體表面粘液，以浸有酒精的棉球擦拭魚體表面后，取出大黃魚肝臟組織并置于含青霉素及鏈霉素雙抗的D-hanks液中； (2)原代培養(yǎng):將上述大黃魚肝臟組織切碎至0.7-2.0mm3的小組織塊，以D-hanks液漂洗，最后以完全培養(yǎng)液洗；漂洗后將上述小組織塊接種于細胞培養(yǎng)瓶中，吸除多余培養(yǎng)液，翻轉(zhuǎn)瓶身27°C恒溫干貼24h，再加入完全培養(yǎng)液翻正瓶身以使小組織塊浸入培養(yǎng)液中，于27 °C恒溫培養(yǎng)啟動原代培養(yǎng),每周更換完全培養(yǎng)液一次； (3)傳代培養(yǎng):原代培養(yǎng)至貼壁細胞增殖至至少50-60%覆蓋率時，移除舊培養(yǎng)液，并清洗去除殘留的血清和二價金屬離子；然后以0.25%胰酶消化法傳代懸起細胞，以1:2-10進行傳代；以后每隔2-8天傳代一次，所述大黃魚肝臟細胞系建立成功。
3.如權(quán)利要求2所述的一種大黃魚肝臟細胞系的建立方法，其特征在于:所述完全培養(yǎng)液中包括:DMEM/F12培養(yǎng)液、胎牛血清FBS、β -巰基乙醇、N-乙酰葡糖糖胺、羧甲基纖維素鈉、人FGF-basic、人EGF、人HGF、青霉素及鏈霉素。
4.如權(quán)利要求3所述的一種大黃魚肝臟細胞系的建立方法，其特征在于:所述完全培養(yǎng)液為:以DMEM/F12培養(yǎng)液為基礎(chǔ)，包括終濃度分別為16.7%胎牛血清FBS、0.5%。β -巰基乙醇、50 μ g/mL N-乙酰葡糖糖胺、50 μ g/mL羧甲基纖維素鈉、10 μ g/L人FGF_basic、5 μ g/LAEGF、lyg/LAHGF、100IU/mL 青霉素以及 100 μ g/mL 鏈霉素。
【文檔編號】C12N5/071GK103992981SQ201310703543
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2013年12月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月19日
【發(fā)明者】王藝磊, 莊道華, 張子平, 李敏 申請人:集美大學(xué)