專利名稱：含有可誘導型癌基因的細胞系及其建立方法、應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及抗腫瘤藥物研發技術領域，尤其涉及一種可誘導Kiastn2v癌基因表達的細胞系及以此作為篩選模型建立特異性抗腫瘤藥物高通量篩選平臺。
背景技術：
腫瘤的發生與癌基因的突變關系密切。在大約30%左右的人類惡性腫瘤中，都可以發現RAS家族的基因突變。在某些腫瘤，如胰腺癌、結腸癌等，RAS家族基因突變的百分率更高達40%-90%。這些突變最常發生于K-ras基因。第12位氨基酸(G — V)突變(K-rasG12V)是K-ras常見的激活性基因突變，特別在是胰腺癌中尤其常見。現代K_ras基因突變的腫瘤病人對化療和放療有明顯的耐受性，一旦發生K-ras突變，可供選擇的治療方案十分有限，病人的預后通常較差。多年來，研究人員致力于尋找一種對K-ras突變腫瘤 有較強細胞毒性的藥物。雖然以K-Ras為靶標的抗腫瘤藥物的研究取得了一定的進展，但目前臨床上仍缺乏一種有效的針對K-ras突變腫瘤的選擇性抗腫瘤藥物。在技術領域，缺乏高效篩選和鑒定特異性針對K-ras癌基因的藥物的方法是目前的主要技術缺陷之一。

發明內容
本發明的目的在于克服現有技術不足，建立一種特異性針對K-ras癌基因的選擇性抗腫瘤藥物高通量篩選平臺，該平臺可以篩選出對激活突變的K-ras基因有選擇性殺傷作用的新型抗腫瘤藥物。不斷發展的高通量化合物篩選技術為尋找以K-ras為靶標的新型抗腫瘤藥物提供了新的可行途徑。本發明基于高通量篩選技術，以分子和細胞水平的實驗方法為基礎，以微板形式作為實驗工具載體，以自動化操作系統執行試驗過程，以靈敏快速的檢測儀器采集實驗結果數據，以計算機對實驗數據進行分析處理，同一時間對大量樣品檢測。這種技術具有微量、精確、快速的特點，通過短時間內對大量化合物庫的篩選，快速發現先導化合物并對其進行進一步的研究，為臨床抗腫瘤藥物的研發提供了一條高效、快捷的途徑。以細胞為基礎的高通量藥物篩選平臺的建立需要合適的細胞模型。四環素(Tet)操縱子調控系統是一種可誘導的基因表達系統。在沒有四環素(或強力霉素)存在時，Tet阻遏因子(Tet R)與Tet操縱因子序列(Tet 0)結合而阻斷四環素抗性基因的表達；在四環素(或強力霉素)存在時，Tet R對Tet 0的阻遏解除，下游基因轉錄啟動。通過這個系統，不僅可以對靶基因的表達進行調控，同時也提供了良好的等基因細胞(isogenic)對照。因此，四環素操縱子調控的可誘導靶基因表達系統為高通量藥物篩選提供了理想的細胞模型。本發明提供一種可被強力霉素(doxycycline)誘導的、含有Kiasei2v基因突變的基因表達系統，即TRex-K-rasG12V-293細胞系，其保藏號為CCTCC NO :C201192。四環素誘導表達的TRex-K-rasG12V-293細胞系，其保藏號為CCTCC NO :C201192，于2011年9月28日提交位于中國武漢的武漢大學的中國典型培養物保藏中心保藏，并經鑒定存活。在該系統中強力霉素發揮控制基因表達的“開關”作用，細胞內沒有強力霉素存在時Kiasw2v不表達，細胞內有強力霉素存在時K-ras高表達，且表達的程度與強力霉素作用的時間正相關。在激活性K-ras癌基因信號的作用下，細胞迅速出現代謝改變，其特征表現在線粒體呼吸功能的下調，糖酵解活躍，乳酸產生率增高等，與溫博格效應(Warburger effect)相符合。在長期Tet/on誘導Kiasei2v表達的情況下，細胞呈現惡性轉化，能在軟瓊脂中生長并形成克隆，在裸鼠體內形成腫瘤。因此，Kiasw2v癌基因可誘導性表達細胞系在Tet/on合Tet/off兩種情況下呈現兩種不同的生物學表型(癌型、非癌型)，可用于篩選和鑒定能特異性針對攜帶K-ras癌基因的腫瘤細胞的化合物。所述的細胞系中穩定轉入了 pcDNA6/TR質粒和含有K_rasG12V癌基因的pcDNA4/T0-K-rasG12V 質粒。所述的pcDNA4/T0-K_rasG12V質粒上12位密碼子含有K_rasG12V突變的基因序列。本發明還提供一種TReX-K-rasG12V-293細胞作為高通量藥物篩選平臺細胞模型的用途。把在Tet/on和Tet/off兩種狀態下的TRex-K-rasG12V-293細胞以相同細胞數各置于一塊96孔板中，這一對96孔板的每一對對應孔接受同一的藥物處理(96對孔接受96個不同藥物的處理)。以Tet/off狀態下細胞的結果做為對照，可以篩選出對K-rasG12V高表達的Tet/on狀態的細胞具有選擇性細胞毒性的藥物。本發明進一步提供一種以TReX-K-rasG12V-293為細胞模型的高通量藥物篩選平臺硬件系統的組成方案和數據分析方法。該高通量篩選平臺的主要組成部分包括(I)Kiastn2v癌基因可誘導性表達細胞系；(2)化合物藥庫；(3) 96孔板自動移液系；(4) 96孔板自動酶標儀；(5)數據分析系統；詳見下述技術方案。本發明提供TRex-K-ras^v細胞系的建立方法，具體步驟如下(I)突變的K_rasG12V cDNA全編碼序列經PCR擴增后插入pcDNA4/T0載體的限制性酶切位點(如

圖1-A)，產生pcDNA4/T0-K-rasG12V ；(2)經DNA測序，證實pcDNA4/T0-K-rasG12V質粒確含編譯G12V的密碼子突變；(3)將 pcDNA4/T0-K-rasG12V 質粒轉入已穩定轉入 pcDNA6/TR 質粒的 TRex-293 細胞；(4)加入 10ug/ml 稻痕菌素(blasticidin)和 200ug/ml 博來霉素(zeocin)以篩選出穩定轉入pcDNA6/TR和pcDNA4/T0-K-rasG12V兩種質粒的細胞克??；(5)存活下來的細胞不斷增殖發展為TRex-K-rasG12V_293細胞系，培養于含有10%胎牛血清，10ug/ml稻瘟菌素和200ug/ml博來霉素的DMEM培養基中。該細胞系的K_rasG12V表達可被Tet或強力霉素所控制。TRex-K-rasG12V_293細胞建立后即可應用于高通量抗腫瘤藥物篩選平臺。Tet/on和Tet/off兩種狀態下的TRex-K-raSG12V-293細胞以相同的數目各置于一塊九十六孔板中，這一對九十六孔板的相應孔接受相同的藥物處理，以Tet/off狀態下細胞的毒性結果為對照，可以篩選出對K-ra#12高表達(Tet/on)狀態的細胞具有選擇性毒性的藥物。據此可設計以TRex-K-raSG12V-293細胞模型為基礎的高通量藥物篩選平臺。如圖2所示，以TRex-K-rasG12V-293為細胞模型的高通量藥物篩選平臺主要組成部分包括(I)Ktbsg12v癌基因可誘導性表達細胞系；在長期Tet/on誘導Kiastn2v表達的情況下，細胞呈現惡性轉化并具有癌型代謝特征(線粒體呼吸功能的下調，糖酵解活躍，乳酸產生率增高等)，而Tet/offcells不表達K-ra#12'做為非癌細胞對照。因為兩組細胞具同等基因型，兩者并用能提供一套用于篩選和鑒定針對攜帶K-ras癌基因的腫瘤細胞的特異性化合物的篩選系統。(2)化合物藥庫；該藥庫可以是小分子化合物、大分子生物制劑，或中草藥有效成分等。
(3)96孔板自動移液系；該工作站可以在篩選過程中實現液體的快速精確分配，以輔助藥物稀釋、細胞鋪板、細胞加藥等環節。(4)96孔板自動酶標儀；該酶標儀可以快速讀出96孔板各孔的吸光值，提供細胞毒性的原始數據。(5)數據分析系統；該系統的數據處理下列計算模式
權利要求
1.一種含有可誘導型癌基因的細胞系，其特征在于，所述的細胞系的保藏號為CCTCCNO :C201192，所述的細胞系中K-raSG12V蛋白的表達可被強力霉素所調控，所述的細胞系為TRex-K-rasG12V-293 細胞系。
2.根據權利要求I所述的細胞系，其特征在于，所述的細胞系中穩定轉入了PCDNA6/TR質粒和含有K-rasG12V癌基因的pcDNA4/T0-K-rasG12V質粒。
3.根據權利要求I所述的細胞系，其特征在于，所述的pcDNA4/T0-K-rasG12V質粒上12位密碼子含有Kiasw2v突變的基因序列。
4.一種細胞系的建立方法，其特征在于，所述的細胞系為TRex-K-ras細胞系，所述的建立方法包括 (1)突變的K-rasG12VcDNA全編碼序列經PCR擴增后插入pcDNA4/T0載體，產生pcDNA4/TO-K-rasG12V ； (2)經DNA測序證實pcDNA4/T0-K-ras質粒在12位密碼子發生了點突變； (3)將pcDNA4/T0-K-rasG12V 質粒轉入含 pcDNA6/TR 質粒的 TRex-293 細胞； (4)用稻瘟菌素和博來霉素篩選出轉入TRex-K-ras^v質粒的穩定細胞克隆，并增殖擴展為 TRex-K-rasG12V-293 細胞系，其保藏號為 CCTCC NO :C201192。
5.一種如權利要求I所述的含有可誘導型癌基因的細胞系作為高通量藥物篩選平臺模型的用途。
6.一種以細胞為基礎的高通量藥物篩選平臺，其特征在于，所述的細胞為TRex-K-rasG12V-293 細胞。
7.一種以如權利要求I所述的TReX-K-raSG12V-293細胞系為細胞模型的高通量藥物篩選平臺硬件系統的組成方案，其特征在于，所述的組成方案至少包含一臺96通道高通量自動移液工作站和一臺全自動酶標儀。
8.一對作為高通量藥物篩選平臺板間對照的對照板，其特征在于，所述的對照板分別使用 Tet/on 的 TRex-K-rasG12V-293 細胞和 Tet/off TRex-K_rasG12V-293 的細胞。
9.根據權利要求8所要求的對照板，其特征在于，所述的一對對照板分別同時接受八種常用標準抗癌藥物的處理，所述的一對對照板內各自包含空白對照、標準對照和溶劑對照等三種對照。
10.一種以細胞為基礎的高通量藥物篩選數據的分析方法，其特征在于，所述的細胞為TRex-K-rasG12V-293細胞，所述的分析方法包括如下步驟 (1)酶標儀測得各孔吸光值后，應用相應的軟件首先自動扣除背景值； (2)將所得各吸光值與DMSO對照組進行比較，得到某個化合物對on/off狀態下TRex-K-rasG12V-293細胞的活性分數； (3)將某種化合物作用于Tet/off細胞所得活性分數與其作用于Tet/on細胞所得活性分數相除，即得到該種化合物的選擇性指數；選擇性指數越高，說明該種化合物對Kiasw2v突變的細胞的選擇性殺傷作用越強。
全文摘要
本發明提供了一種含有可誘導型癌基因的細胞系，所述的細胞系的保藏號為CCTCC NOC201192，所述的細胞系中K-rasG12V蛋白的表達可被強力霉素所調控，所述的細胞系為TRex-K-rasG12V-293細胞系。本發明還提供以此作為篩選模型建立特異性抗腫瘤藥物高通量篩選平臺。
文檔編號C12R1/91GK102766601SQ20111036507
公開日2012年11月7日 申請日期2011年11月17日 優先權日2011年11月17日
發明者宋鳴, 徐瑞華, 胡寓文, 黃蓬 申請人:中山大學腫瘤防治中心