三倍體泥鰍鰭細胞系trmf及其建立方法
【專利摘要】本發明提供一種三倍體泥鰍鰭細胞系TRMF及其建立方法。所述三倍體泥鰍鰭細胞系TRMF于2013年8月19日保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為C2013110。所述三倍體泥鰍鰭細胞系具有對鯉春病毒血癥病毒的易感性。所述三倍體泥鰍鰭細胞系的生物學特性包括:細胞為成纖維細胞樣、胞漿豐富貼壁生長、具有接觸抑制生長特性，細胞倍增時間為36.01小時，特征染色體數目為75條。
【專利說明】三倍體泥鰍鰭細胞系TRMF及其建立方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種三倍體泥鰍鰭細胞系T RM F及其建立方法。
【背景技術】
[0002]泥嫩(Mis gurn us angui 11 iCaudatus)在分類學中屬于鯉形目(CypriniformeS)、鰍科(Cobitidae)、花鰍亞科(Cobitinae)、泥鰍屬(Misgurnus),是亞洲特有的野生小型淡水魚類，廣泛分布于我國遼河以南大部分地區以及越南、朝鮮和日本。我國各淡水水域，如湖泊、池塘、河溪、水溝、稻田等均有分布。泥鰍肉質細嫩、味美，營養豐富，有“水中人參”之稱，除了較高的食用價值，它還具有一定的滋補藥用功效，是市場上暢銷的特種水產品之一。除了具有重要經濟價值外，泥鰍還是一種很好的細胞學、遺傳學等方面的研究材料。與二倍體泥鰍相比，三倍體泥鰍具有生長快、抗性強的特點，但目前對這些生物學特性的機理尚沒有明確的分析。
[0003]魚類細胞系的建立可用于病毒的分離、環境污染物檢測以及其他一些生物學特性的研究。三倍體泥鰍鰭細胞系與其他魚類細胞系一樣可以滿足生物學研究、病毒的分離與擴增、功能基因研究以及毒理學等應用研究，除此之外，還可用于三倍體魚類的生長、抗性等的機制分析。然而，迄今為止還沒有三倍體泥鰍鰭細胞系的相關報道。

【發明內容】

[0004]基于上述問題，本發明的目的在于提供一種三倍體泥鰍的鰭細胞系TRMF及其建立方法。
[0005]所述三倍體泥鰍鰭細胞系TRMF于2013年8月19日保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為C2013110。
[0006]所述三倍體泥鰍鰭細胞系TRMF支持鯉春病毒血癥病毒的生長和復制。
[0007]木發明還提供一種建立三倍體泥鰍鰭細胞系TRMF的方法，包括以下步驟:
[0008]1、制備細胞培養液
[0009]所用培養基為市售的DMEM/F12培養基，加入胎牛血清、人堿性成纖維細胞生長因子、I型胰島素樣生長因子和硫酸軟骨素，配制成所述培養液，胎牛血清占培養液總體積的20%，人堿性成纖維細胞生長因子的終濃度為10ng/ml，I型胰島素樣生長因子的終濃度為20ng/ml，硫酸軟骨素的終濃度為10 μ g/ml，所述培養液存放在4°C ;
[0010]I1、原代培養
[0011]在無菌環境下剪取三倍體泥鰍的鰭組織，先用IOwt%的碘伏浸泡剪下的所述鰭組織15分鐘，再用含有終濃度為500IU/mL的青霉素和終濃度為500 μ g/mL的鏈霉素的混合液浸泡30分鐘，然后用無菌PBS漂洗，將漂洗后的鰭組織剪成Imm3左右的小塊，均勻接種在沒有加入培養液的細胞培養瓶中，在25°C的CO2培養箱中正置干貼24小時，然后往所述培養瓶中補加所述培養液，在25°C的CO2培養箱中繼續培養；
[0012]II 1、傳代培養[0013]待步驟II的細胞長成單層后，移走培養瓶中的培養液，然后往所述培養瓶中加入
0.25%的胰蛋白酶溶液對所述細胞進行消化處理，30秒后吸去胰蛋白酶溶液，利用在瓶底形成一層胰蛋白酶膜繼續消化I分鐘，加入培養液吹打消化后的細胞，制成細胞懸液，將細胞懸液按預定比例轉入新的培養瓶中，并補加培養液，在25°C的CO2培養箱中培養；
[0014]IV、按照步驟III的過程傳代，30代后所用培養液為含有20Vol%胎牛血清的DMEM/F12培養基 。
[0015]本發明所提供的三倍體泥鰍的鰭細胞系可用于進行病毒學、病理學、毒理學、免疫學、遺傳育種和種質保存等理論研究。此外，該細胞系還可用于病毒疫苗研制等應用研究。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1是示出在顯微鏡下本發明三倍體泥鰍鰭細胞系形態的圖。
[0017]圖2是圖1所示三倍體泥鰍鰭細胞系的染色體分析圖。
[0018]圖3是對圖1所示三倍體泥鰍鰭細胞系進行SSR分析的結果圖。
[0019]圖4是示出圖1所示三倍體泥鰍鰭細胞系生長曲線的圖。
[0020]圖5是示出接種鯉春病毒血癥病毒四天后，三倍體泥鰍鰭細胞系的形態圖。
【具體實施方式】
[0021]以下通過【具體實施方式】對本發明的三倍體泥鰍的鰭細胞系及其建立方法進行說明。
[0022]1、細胞系的建立
[0023]所用的三倍體泥鰍是由二倍體泥鰍和四倍體泥鰍雜交獲得的。
[0024]該三倍體泥鰍的鰭細胞系TRMF的建立過程包括下述三個階段。
[0025](I)制備細胞培養液
[0026]所用培養基為市售的DMEM/F12培養基，加入胎牛血清(FBS)、人堿性成纖維細胞生長因子、I型胰島素樣生長因子和硫酸軟骨素，配制成細胞培養液。其中，胎牛血清占培養液總體積的20%，人堿性成纖維細胞生長因子的終濃度為10ng/mL，I型胰島素樣生長因子的終濃度為20ng/mL，硫酸軟骨素的終濃度為10 μ g/mL。配制好的細胞培養液存放在4°C。
[0027](2)原代培養
[0028]在無菌環境下剪取三倍體泥鰍的鰭組織。接下來，先用IOwt %的碘伏浸泡剪下的鰭組織15分鐘，再用青霉素和鏈霉素的混合液(青霉素終濃度為500IU/mL,鏈霉素終濃度為500 μ g/mL)浸泡30分鐘。浸泡結束之后，再用無菌PBS (配方:8gNaCl、0.2gKCl、
3.639Na2HP04.12Η20和0.24gKH2P04，溶于蒸餾水并定容至1L)漂洗兩遍。然后，將漂洗后的鰭組織剪成Imm3左右的小塊，均勻接種在沒有加入培養液的25cm2細胞培養瓶中，在25°C的CO2培養箱中正置干貼24小時。然后往細胞培養瓶中補加細胞培養液至5mL/瓶，在25°C的CO2培養箱中繼續培養。
[0029](3)傳代培養
[0030]待原代培養的細胞長成單層后，將細胞培養瓶中的培養液轉移到干凈容器中備用。接著往細胞培養瓶中加入ImL0.25%的胰蛋白酶溶液，用于對細胞進行消化處理，30秒后吸去胰蛋白酶溶液，使得瓶底形成一層胰蛋白酶膜，繼續消化I分鐘，輕柔地磕碰細胞培養瓶。然后將前述轉移到干凈容器中備用的培養液重新轉移入細胞培養瓶中，用吸管吹打細胞，制成細胞懸液。按體積比1:1將細胞懸液轉移到兩個新的培養瓶中，并分別補加培養液至5mL。在25°C的0)2培養箱中培養。待細胞再次長成單層后，按照上述方法進行傳代。30代后所用培養液為含20vol% FBS的DMEM/F12培養基。
[0031]2、細胞系的保存
[0032]所用的細胞凍存液配方如下:20%FBS，60%DMEM/F12和20%二甲基亞砜。保存于4°C冰箱中備用。
[0033]取生長旺盛的細胞，用0.25%的胰蛋白酶溶液消化。消化結束后，加入細胞培養液重懸細胞，1500rpm離心5min，棄上清，然后用ImL細胞凍存液重懸沉淀。調整細胞濃度至1.0X IO6個/mL，然后將細胞轉入凍存管中。
[0034]對細胞懸液逐漸降溫，具體降溫程序如下:首先在4°C冰箱中放置30min，然后轉入-20°C冰箱中放置2h，接著轉入-80°C冰箱中放置24h，最后放入液氮中(_196°C )長期保存。
[0035]取在液氮中保存的細胞，在4(TC水中解凍，待細胞懸液融化后轉入2 5 °C水浴中3min。然后將細胞懸液轉入離心管，加入等量的DMEM/F12培養基，1500rpm離心5min，棄上清，用含20vol% FBS的DMEM/F12培養基重懸細胞，轉入到25cm2細胞培養瓶中，補加細胞培養液至5mL，在25°C的CO2培養箱中培養24h。然后更換新鮮的細胞培養液，繼續培養。
[0036]同時，取少量解凍過程中重懸的細胞液，加入臺盼藍(Trypan Blue)染色，用血球計數板計數，計算細胞的存活率，存活率=(活細胞數/細胞總數)X100 %。
[0037]凍存的三倍體泥鰍鰭細胞系TRMF存活率為(84.48± 1.13) %。
[0038]3、染色體分析
[0039]向培養有三倍體泥鰍鰭細胞的培養瓶中加入終濃度為I μ g/mL的秋水仙素，將培養瓶置于25°C的C02培養箱中繼續培養3~5h。然后用0.25%的胰蛋白酶溶液消化，將消化后的細胞轉入離心管中，1500rpm離心5min，收集細胞。用0.075mol/L的KCl溶液低滲40min,然后Carnoy固定液固定15min,固定三次后滴片,干燥后用Giemsa染液染色。
[0040]顯微鏡下觀察拍照。計數染色體數目，并進行核型分析，根據染色體的長度、著絲點位置、臂長等特征，對染色體進行分組、配對。
[0041]本發明所建立的三倍體泥鰍鰭細胞系的染色體核型如圖2所示。
[0042]4、SSR 分析
[0043]通過SSR(Simple Sequence Repeats)技術來鑒定所建立的三倍體泥鰍鰭細胞系TRMF是否與泥鰍具有相同的遺傳特征。
[0044]采用常規的苯酚-氯仿抽提法提取泥鰍肌肉組織(用作陽性對照)和斑馬魚肌肉組織(用作陰性對照)的基因組DNA。
[0045]按如下步驟提取三倍體泥鰍鰭細胞系TRMF的基因組DNA:①取出冷凍在_20°C的傳代細胞，在4°C解凍后放入1.5mL離心管中，離心后去除上清液；②加入250yL的DNA裂解液(含有 I Ommo I/L Tris_Cl、50mmol/LKCl 和 0.5% Tween-20, pH8.0)，再加入 5μ L 蛋白酶Κ(濃度為0.5mg/mL)，于55°C水浴恒溫裂解3h;③參照苯酚-氯仿抽提法，用等體積的氯仿:異戊醇(24:1)抽提一次。
[0046]接下來，進行PCR(Polymerase Chain Reaction)擴增。[0047]根據已報道的泥鰍微衛星標記位點，合成Mac9、Mac50兩對引物(具體序列見表I)。
[0048]表1
【權利要求】
1.一種三倍體泥鰍鰭細胞系TRMF，于2013年8月19日保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為C2013110。
2.根據權利要求1所述的三倍體泥鰍的鰭細胞系TRMF，其特征在于，所述三倍體泥鰍鰭細胞系支持鯉春病毒血癥病毒的生長和復制。
3.一種建立三倍體泥鰍鰭細胞系TRMF的方法，包括以下步驟: I、制備細胞培養液 所用培養基為市售的DMEM/F12培養基，加入胎牛血清、人堿性成纖維細胞生長因子、I型胰島素樣生長因子和硫酸軟骨素，配制成所述培養液，胎牛血清占培養液總體積的20%，人堿性成纖維細胞生長因子的終濃度為10ng/ml，I型胰島素樣生長因子的終濃度為20ng/ml，硫酸軟骨素的終濃度為10μ g/mi，所述培養液存放在4°C ； II、原代培養 在無菌環境下剪取三倍體泥鰍的鰭組織，先用IOwt %的碘伏浸泡剪下的鰭組織15分鐘，再用含有終濃度為500IU/mL的青霉素和終濃度為500 μ g/mL的鏈霉素的混合液浸泡30分鐘，然后用無菌PBS漂洗，將漂洗后的鰭組織剪成imm3左右的小塊，均勻接種在沒有加入培養液的細胞培養瓶中，在25°C的CO2培養箱中正置干貼24小時，然后往培養瓶中加入所述培養液，在25 °C的CO2培養箱中繼續培養； II I、傳代培養 待步驟II的細胞長成單層后，移走培養瓶中的培養液，然后往培養瓶中加入0.25%的胰蛋白酶溶液對細胞進行消化處理，30秒后吸去胰蛋白酶溶液，利用在瓶底形成一層胰蛋白酶膜繼續消化I分鐘，加入培養液吹打消化后的細胞，制成細胞懸液，將細胞懸液按預定比例轉入新的培養瓶中，并補加培養液，在25°C的CO2培養箱中培養； IV、按照步驟III的過程傳代，30代后所用培養液為含20VOl%胎牛血清的DMEM/F12培養基。
【文檔編號】C12R1/91GK103525749SQ201310538151
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年11月4日 優先權日:2013年11月4日
【發明者】李霞, 馬辰, 秦艷杰, 李雅娟, 楊艷津 申請人:大連海洋大學