促進術后傷口愈合的海參肽的制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種促進術后傷口愈合的海參肽的制備方法，其特點是：包括預處理、加熱變性、冷卻破碎、加熱殺酶、粗過濾并醇沉、真空濃縮、靜置沉淀、過濾、冷凍干燥工藝步驟；制取的海參活性肽不僅對機體具有良好的免疫調節作用，而且具有非常顯著的傷口愈合促進作用，可促進傷口提前4-5天愈合，并且愈合后的傷口平整，不易留下疤痕。
【專利說明】促進術后傷口愈合的海參肽的制備方法
[0001]【技術領域】:
本發明涉及傷口愈合【技術領域】，具體地講是一種促進術后傷口愈合的海參肽的制備方法。
[0002]背 景技術:
在實際生活中，有些病人，比如糖尿病患者等接手外科手術后，傷口愈合非常慢，這不僅給病人帶來很多痛苦，而且由于愈合慢，感染的幾率大大增加，因此，如何采取措施，促進術后傷口盡快愈合，是外科醫學中的一個重要課題。
[0003]術后傷口愈合是指機體手術后傷口部位的皮膚等組織出現離斷或缺損后的愈復過程，為包括各種組織的再生和肉芽組織增生、瘢痕組織形成的復雜組合，表現出各種過程的協同作用。損傷的程度及組織的再生能力決定修復的方式、愈合的時間及瘢痕的大不。因此，治療原則應是縮小創面(如對合傷口)、防止再損傷和促進組織再生。雖然組織的再生能力是在進化過程中獲得的，但仍受全身及局部條件的影響。因此，應當避免一些不利因素，創造有利條件促進組織再生修復。
[0004]目前，醫學界廣泛應用的傷口愈合促進措施，主要是外敷措施，即在傷口外，敷藥物防止感染、同時促進傷口愈合，通過內服來促進傷口愈合的產品，幾乎沒有，這方面的研究也非常少見。
[0005]眾所周知，海參活體受傷后，自身具有極強的修復和再生能力。調查研究發現，生長自北大西洋海域水下30英尺左右海中的冰島野生海參，其生活的地理位置靠近北極圈，海水溫度常年保持在4°C以下，冬季表面結冰，終年人跡罕至。加之冰川雪山覆蓋土地，周圍無任何工業及人類活動的污染。生活在冰冷水域中的冰島野生海參，生長緩慢，成品參都是具有10年以上參齡的野生海參，是名副其實的老海參。它含有豐富的蛋白質，礦物質及多種海參活性成份，膽固醇含量幾乎為零。冰島野生海參冰島野生海參含有豐富優質的高蛋白質，海參蛋白質成份量占20.3%，膽固醇含量非常低，每百克海參膽固醇僅含量0.02毫克，低脂肪含量也非常低，脂肪成分量占0.06%,酸性粘多糖適中，營養保健價值比較好，是海參中的極品。
[0006]
【發明內容】
:
本發明的目的是克服上述已有技術的不足，而提供一種促進術后傷口愈合的海參肽的制備方法；主要解決現有的促進術后傷口愈合只能外敷而無內服產品的問題。
[0007]本發明的技術方案是:促進術后傷口愈合的海參肽的制備方法，其特殊之處在于，包括如下步驟:
a預處理，選用新鮮海參為原料，剖開、除去內臟后，得到鮮參體；b加熱變性，鮮參體加入純凈水，加熱煮沸，并保持沸騰5-10分鐘，使蛋白適度變性；c冷卻破碎、加熱殺酶，冷卻至室溫后，將參體破碎成小塊，并重新加熱至40_50°C，至溫后，加入中性蛋白酶，溫度40-70°C，酶解時間8-12h，然后加熱煮沸殺酶；
d粗過濾并醇沉，殺酶后，冷卻至室溫，用30-50目的絲絹進行粗過濾，加95% (V/V)酒精，使體系中酒精含量達到50-70%(V/V)，靜置5-10小時，用100目的濾布過濾，分離沉淀，收集濾液；所得沉淀用于后續提取海參多糖；
e真空濃縮，真空濃縮所得濾液，濃縮條件為:溫度30-50°C，絕對壓力1000-5000Pa，當體積達到綠葉體積的1/10左右，即可；
f靜置沉淀，濃縮液中加入濃度為18-20%的單寧溶液，加入量為濃縮液體積的2-5%，靜置沉淀3-5小時，100目濾布過濾，除去沉淀，收集濾液；
g過濾，濾液中加入粉末狀活性炭，加入量為濾液體積的1-3% (w/V)，將體系加熱到50-80°C，維持1-2小時；用100目濾布過濾，并收集濾液，將濾液真空濃縮至原體積的1/3-1/5 ；
h冷凍干燥，濃縮液真空冷凍干燥，得淡黃色粉末，即為分子量不超過2500的海參肽產
品O
[0008]進一步的，c步驟所述的中性蛋白酶的加入量為1000_5000U/kg鮮參體。
[0009]進一步的，h步驟所述的真空冷凍干燥條件為:絕對壓力50_100Pa，溫度20-30°C，時間8-12h。
[0010]本發明所述的促進術后傷口愈合的海參肽的制備方法與已有技術相比具有突出的實質性特點和顯著進步，以新鮮海參為原料，生物酶解制取的分子量低于2500的海參活性肽，不僅對機體具有良好的免疫調節作用，而且具有非常顯著的傷口愈合促進作用，研究發現，這種活性肽能夠 促進術后小鼠傷口周圍毛細血管的形成，與對照組小數相比，可促進傷口提前4-5天愈合(對照組小鼠一般需要13天左右，而實驗組織需要8-9天即可)，并且愈合后的傷口平整，不易留下疤痕。
[0011]【具體實施方式】:
為了更好地理解與實施，下面結合實施例詳細說明本發明；所舉實施例僅用于解釋本發明，并非用于限制本發明的范圍。
[0012]實施例1，選用新鮮冰島野生海參IOOkg為原料，剖開、除去腸子等內臟后，得到鮮參體51.2kg ;然后加入IOOkg純凈水，加熱煮沸，并保持沸騰8分鐘，使蛋白適度變性；冷卻至室溫后，將參體破碎成小塊，并重新加熱至45°C，以利于酶解，至溫后，加入中性蛋白酶，加入酶量按3000U/kg鮮參體，酶解條件為:溫度55°C，酶解時間8-12h，至時，加熱煮沸殺酶；殺酶后，冷卻至室溫，并用40目的絲絹進行粗過濾，除去大顆粒的雜質后，加95% (V/V)酒精，是體系中酒精含量達到60%(V/V)，靜置8小時，用100目的濾布過濾，分離沉淀，收集濾液；所得沉淀用于后續提取海參多糖；真空濃縮濾液所得濾液，濃縮條件為:溫度40°C，絕對壓力3000Pa，當體積達到綠葉體積的1/10左右，即可；濃縮液中加入濃度為19%的單寧溶液，加量為濃縮液體積的3.5%，靜置沉淀4小時，100目濾布過濾，除去沉淀，收集濾液；濾液中加入3%的粉末狀活性炭，加入量為濾液體積的2% (w/V);將體系加熱到65°C左右，維持1.5小時；用100目濾布過濾，并收集濾液。將濾液真空濃縮至原體積的1/4，即可；濃縮液真空冷凍干燥，條件為:絕對壓力75Pa，溫度25°C，時間IOh ;所得淡黃色粉末，即為分子量不超過2500的海參肽產品，該產品分子量不超過2500的海參肽含量不低于80%。
[0013]將上述實施例1的海參肽進行如下實驗:
1、實驗動物:
昆明種小白鼠，體重18-22g，由中國預防醫學院購得。
[0014]2、試劑:乙醚AR天津市津東天正精細化學試劑廠
無水乙醇AR萊陽市康德化工有限公司
甲醛AR江蘇雙源化工廠
NaH2PO4.2H20 AR天津市津北精細化工有限公司
Na2HPO4.12H20 AR天津市津北精細化工有限公司
二甲苯AR萊陽市康德化工有限公司
1%鹽酸酒精，1:1甘油蛋白，蘇木精溶液，0.5%伊紅溶液，石蠟，生理鹽水。
[0015]3、儀器: 電子水平 AEV-210 湘儀天平儀器廠
顯微鏡E-200江南光電集團新飛達光學儀器公司
數碼相機 S-4500麗達數碼技術有限公司
恒溫干燥箱 YB-1江蘇東臺電器廠
電熱恒溫水浴鍋龍口市先科儀器公司
切片機，坩堝，燒杯，三角瓶，廣口瓶，包埋盒，酒精燈，鑷子，剪刀，手術刀片。
[0016]4、實驗方法:
4.1小白鼠的麻醉:
250ml三角瓶中放入少量脫脂棉，倒入IOml乙醚，左手帶膠皮手套用無名指與小指將小鼠尾根部夾住，中指、食指與大拇指將小鼠頸部皮膚連同兩只耳朵一起抓起，然后將小鼠頭部塞進三角瓶，伸進約3cm，頭部周圍不能貼在三角瓶壁上，秒表計時，測最佳蘇醒時間。
[0017]4.2.1小白鼠長形傷口制造:
用手術刀片在小鼠背部劃一長形傷口，深達皮下肌肉。
[0018]4.2.2圓形傷口的制造
將自制直徑為0.5cm的塑料圓圈染上顏色，印在小鼠背部進行定位，用無菌鑷子從圓圈中心將小鼠皮膚夾起，然后用無菌剪刀沿印跡剪除背部皮膚，便能得到大小、深淺基本一致的圓形傷口。
[0019]4.3分組實驗:
取20只體重為20±2克的小白鼠，隨機分為2組，制造直徑為0.5cm的圓形傷口。第一組每天用自來水灌胃0.5ml,即對照組；第二組每天用實施例1的海參肽液灌胃0.5ml,即海參實驗組。
[0020]4.4傷口愈合觀察:
4.4.1肉眼觀察:
每隔一天用三角尺測量傷口大小，并觀察傷口變化情況。
[0021]4.4.2顯微鏡下對傷口愈合觀察:
光鏡下主要觀察毛細血管生長分布情況和肉芽組織生長情況。
[0022]小白鼠在術后1、3、5、7、11、13天分6次，每次各組取I只作拉頸處死，然后用鑷子夾起圓形傷口外圍皮膚，用剪刀剪下放在涂有1:1甘油蛋白膠的載玻片上(里面朝上)，直接放顯微鏡下觀察，數碼相機攝影。
[0023]5、結果與討論:
5.1乙醚對小白鼠的麻醉效果:
【權利要求】
1.促進術后傷口愈合的海參肽的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: a預處理:選用新鮮海參為原料，剖開、除去內臟后，得到鮮參體； b加熱變性:鮮參體加入純凈水，加熱煮沸，并保持沸騰5-10分鐘，使蛋白變性；c冷卻破碎、加熱殺酶:冷卻至室溫后，將參體破碎成小塊，并重新加熱至40-50°C，至溫后，加入中性蛋白酶，溫度40-70°C，酶解時間8-12h，然后加熱煮沸殺酶； d粗過濾并醇沉:殺酶后，冷卻至室溫，用30-50目的絲絹進行粗過濾，加95% (V/V)酒精，使體系中酒精含量達到50-70%(V/V)，靜置5-10小時，用100目的濾布過濾，分離沉淀，收集濾液；所得沉淀用于后續提取海參多糖； e真空濃縮:真空濃縮所得濾液，濃縮條件為:溫度30-50°C，絕對壓力1000-5000Pa，當體積達到濾液體積的1/10，即可； f靜置沉淀:濃縮液中加入濃度為18-20%的單寧溶液，加入量為濃縮液體積的2-5%，靜置沉淀3-5小時，100目濾布過濾，除去沉淀，收集濾液； g過濾:濾液中加入粉末狀活性炭，加入量為濾液體積的1-3% (w/V)，將體系加熱到50-80°C，維持1-2小時；用100目濾布過濾，并收集濾液，將濾液真空濃縮至原體積的1/3-1/5 ； h冷凍干燥:濃縮液真空冷凍干燥，得淡黃色粉末，即為分子量不超過2500的海參肽產品O
2.根據權利要求1所述的促進術后傷口愈合的海參肽的制備方法，其特征在于，c步驟所述的中性蛋白酶的加入量為1000-5000U/kg鮮參體。
3.根據權利要求1所述的促進術后傷口愈合的海參肽的制備方法，其特征在于，h步驟所述的真空冷凍干燥條件為:絕對壓力50-100Pa，溫度20-30°C，時間8_12h。
【文檔編號】C12P21/06GK103937860SQ201410114474
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年3月26日 優先權日:2014年3月26日
【發明者】劉凱, 徐蓮, 高瑩, 孫姿姿, 魏玉良 申請人:劉凱