一種肉桂地鏈霉菌發酵生產莫能菌素的新型培養基和培養方法
【專利摘要】本發明涉及一種肉桂地鏈霉菌發酵生產莫能菌素的新型培養基和培養方法，利用本發明中提供的培養基配方和發酵控制工藝，能夠提高莫能菌素發酵單位，縮短發酵周期，降低發酵成本，并且最大限度的降低原輔料來源不受環境影響，保證其供應充足，實現莫能菌素穩定、高效的生產。
【專利說明】一種肉桂地鏈霉菌發酵生產莫能菌素的新型培養基和培養方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于發酵【技術領域】，特別是涉及一種肉桂地鏈霉菌發酵生產莫能菌素的新型培養基和培養方法。
【背景技術】
[0002]莫能菌素又名莫能霉素、莫能菌酸、瘤胃素，由美國Eli Iilly公司于1967年從一株肉桂地鏈霉菌中分離到的一種脂溶性抗生素。它是一種廣譜抗球蟲藥，對金黃色葡萄球菌，鏈球菌，枯草桿菌等革蘭氏陽性菌和豬血痢密螺旋體等都具有較高的抗菌活性。主要用于防治雞 ，兔，犢牛，羔羊的球蟲病和豬痢疾，并能促進其生長發育和提高飼料利用率。
[0003]目前，國內莫能菌素的發酵生產采用三級發酵模式，該方式存在的主要問題有以下幾點:
I莫能菌素發酵水平較低，一般控制在35000u/ml左右。
[0004]2國內發酵生產莫能菌素的培養基中加入葡萄糖，經高溫滅菌，易導致部分葡萄糖碳化，降低總糖含量，影響發酵液質量。
[0005]3莫能菌素發酵生產所需的原材料采購成本較高。莫能菌素培養基中常用的有機氮源主要是花生餅粉(或黃豆餅粉)、蛋白胨、酵母粉，其市場價格較高。
[0006]4國內莫能菌素的發酵培養周期較長，一般在300h以上，導致能耗較高。

【發明內容】

[0007]本發明的目的就在于克服上述現有技術的缺陷，提供一種發酵工藝簡單，有效提高發酵單位，同時最大限度的降低原輔料對發酵單位的影響，降低生產成本，且原輔料來源不受環境影響，保證其供應充足，實現莫能菌素穩定、高效生產的新型培養基。
[0008]本發明的另一目的是提供利用上述培養基生產莫能菌素的培養方法。
[0009]為實現上述目的所采取的技術方案為:
一種肉桂地鏈霉菌發酵生產莫能菌素的新型培養基，包括一級種子培養基、二級種子培養基和發酵培養基，其特征在于所述一級種子培養基的組成為:麩皮I~5g/L、麥芽糖5~9g/L、魚粉3~7g/L、玉米衆5~9ml/L、玉米蛋白粉I~5g/L、啤酒酵母浸膏4~8g/L,硫酸銨I~5g/L、輕質碳酸鈣I~5g/L、橄欖油或菜籽油5~9ml/L ；
所述二級種子培養基組成為:麩皮3~7g/L、麥芽糖6~10g/L、魚粉6~9g/L、玉米衆8~12ml/L、玉米蛋白粉3~7g/L、啤酒酵母浸膏5~9g/L,硫酸銨3~7g/L、輕質碳酸鈣I~5g/L、磷酸二氫鉀0.5~0.9g/L,橄欖油或菜籽油15~25ml/L ；
所述發酵培養基組成為:麩皮8~12g/L、麥芽糖10~14g/L、魚粉7~llg/L、玉米漿15~19ml/L、玉米蛋白粉5~9g/L、啤酒酵母浸膏15~19g/L,硫酸銨4~8g/L、輕質碳酸鈣3~7g/L、磷酸二氫鉀0.5~0.9g/L，橄欖油或菜籽油25~40ml/L。氯化鈉0.3~0.7g/L、硫酸鎂0.2~0.6g/L、硫酸亞鐵0.1~0.5g/L、聚氧丙烯甘油0.3~0.4g/L。[0010]一種利用上述培養基生產莫能菌素的培養方法，其特征在于其工藝步驟為:
O 一級種子培養:首先將一級種子培養基滅菌并冷卻至25~30°C，并用無菌空氣保壓，然后在火焰保護下，將已經培養好的肉桂地鏈霉菌母瓶發酵液按照0.3~0.5L/m3的接種量接入該一級種子培養基中進行一級種子培養，至菌體濃度20~25%、pH值6.5~8.5、培養時間25~35h時移種；
2)二級種子培養:先將二級種子培養基滅菌，冷卻至25~30°C，并用無菌空氣保壓，將培養好的一級種子液移入二級種子培養基中進行二級種子培養，移種比例控制在9~11%，至菌體濃度30~35%、pH值6.5~8.5、培養時間30~35h時移種；
3)發酵培養:先將發酵培養基滅菌，冷卻至20~27°C，并用無菌空氣保壓，然后將培養好的二級種子液移入發酵培養基進行發酵培養，移種比例控制在9~11%，至菌體濃度35~40%、還原糖< 1.5g/L、脂肪:< 2g/L、氨基氮:10 ~30mg/100ml、化學效價> 43000u/mL、pH:6.0~7.0、培養時間260~280h時終止發酵。
[0011]滅菌后的一級種子培養基的質量要求:氨基氮:50~60mg/100ml、溶磷:100~150ug/ml、脂肪:10 ~25g/L、pH:6.5 ~7.5 ;
滅菌后的二級種子培養基 的質量要求:氨基氮:60~70mg/100ml、溶磷:100~150ug/ml、脂肪:15 ~30g/L、pH:6.5 ~7.5 ;
滅菌后的發酵培養基的質量要求:氨基氮:70~80mg/100ml、溶磷:150~200ug/ml、脂肪:25 ~40g/L、pH:6 ~7。
[0012]所述培養好的母瓶發酵液質量要求為:pH6~8 ;菌體濃度10~30% ;鏡檢無雜菌；發酵單位15000~25000u/ml。
[0013]所述一級種子培養條件為:罐壓0.03~0.05MPa ;罐溫31~33°C;空氣流量:0~5h,采用空氣攪拌代替機械攪拌；6h~移種:50~60m3/h ;攪拌轉速60~80r/min。
[0014]所述二級種子培養條件為:罐壓0.03~0.05MPa ;罐溫31~33°C;空氣流量:0~12h, 20 ~30m3/h ； 13h ~移種:50 ~60m3/h ;攬祥轉速 80 ~100r/min。
[0015]所述發酵培養條件為:
a培養基初始pH:發酵培養基滅菌后pH控制在6~7 ;
b溫度:采用變溫控制方法，O~20h:培養溫度29~31°C;20h~發酵結束:培養溫度32 ~33。。；
c攪拌轉速:采用變頻攪拌控制方法，O~IOOh:轉速控制在100r/min ;101~200h:轉速控制在130r/min ；201h~發酵結束:轉速控制在90r/min ；d壓力控制:罐壓0.05~0.06MPa ；e pH控制:發酵過程中pH控制在6.0~7.0 ;
f 空氣流量:0 ~IOOh:150 ~200mVh ;101 ~200h:250 ~300m3/h ;201h ~發酵結束:100 ~150m3A ；h溶氧控制:
發酵前5h內，不控制溶氧；
6~100h，溶氧控制在60%以上；
101~200h，溶氧控制在20%以上；
201~發酵結束:溶氧控制在30%以上。[0016]在發酵過程中采用流加法進行補料，補料包括補油、補水、補糖和pH控制，其中 a補油工藝控制:
發酵前30h不用進行補油，
發酵時間在31~120h，當脂肪含量低于15%，補入橄欖油或菜籽油，控制脂肪含量為15~20%，每隔6~8h檢測發酵液脂肪含量，
發酵時間在121~200h，當脂肪含量低于10%，補入橄欖油或菜籽油，控制脂肪含量為10~15%，每隔6~8h檢測發酵液脂肪含量，
發酵時間在201h~240h，當脂肪含量低于5%，補入橄欖油或菜籽油，控制脂肪含量為5~8%，每隔6~8h檢測發酵液脂肪含量，
發酵時間在241h~發酵結束，當脂肪含量低于1.5%，補入橄欖油或菜籽油，控制脂肪含量為1.5~2.5%，每隔6~8h檢測發酵液脂肪含量；b補水工藝控制:
發酵前30h不用進行補水， 發酵時間在31~100h，當菌體濃度高于50%，加入滅菌水，要求控制發酵液菌體濃度在40~45%，每隔6~8h檢 測發酵液菌體濃度，
發酵時間在101~200h，當菌體濃度高于45%，加入滅菌水，要求控制發酵液菌體濃度在40~45%，每隔6~8h檢測發酵液菌體濃度，
發酵時間在201h~發酵結束，當菌體濃度高于40%，加入滅菌水，要求控制發酵液菌體濃度在35~40%，每隔6~8h檢測發酵液菌體濃度；c發酵過程pH控制工藝:
發酵前40h，pH不進行控制，
發酵時間在41~120h，若pH < 6.0，加入10~20%的氫氧化鈉，調節pH至6.0~6.5 ;若pH > 6.5，加入30%的硫酸銨溶液，調節pH至6.0~6.5，
發酵時間在121~發酵結束，若pH < 6.5，加入10~20%的氫氧化鈉，調節pH控至
6.5~7.0 ;若pH > 7.0，加入30%的硫酸銨溶液，調節pH至6.5~7.0 ; d補入麥芽糖:
發酵前60h，還原糖含量不進行控制，
發酵61h至200h:還原糖含量< 3%時，補入已滅菌的麥芽糖溶液，使還原糖的含量控制在3~4%，
發酵201h至發酵結束:還原糖含量< 0.5%時，補入已滅菌的麥芽糖溶液，使還原糖的含量控制在0.5~1%，
上述麥芽糖溶液中加入麥芽糖酶，其濃度控制在0.001~0.003%。
[0017]本發明的技術優勢體現在:
I本發明確認了種子培養基、發酵培養碳源、氮源和最佳配伍比例。
[0018]2本發明對種子培養、發酵培養的工藝進行了詳細的闡述，確認了莫能菌素最佳的發酵工藝和控制參數。達到的技術效果為發酵單位在43000u/ml以上，生產周期不超過280h，同國內技術相比，發酵單位提高了 22.8%，生產周期減少了 20h以上。
[0019]3本發明適用于規模化發酵生產莫能菌素，能夠滿足年產40000噸莫能菌素預混劑的生產需求。[0020]4培養基中使用麥芽糖，避免出現葡萄糖碳化現象，不會影響菌種培養效果。
[0021]具體實施方法
下面用實例予以說明本發明，應該理解的是，實例是用于說明本發明而不是對本發明的限制。本發明的范圍與核心內容依據權利要求書加以確定。
[0022]下述實施例的菌種選用肉桂地鏈霉菌:生產使用的菌種來源為母瓶發酵液。母瓶發酵液質量:pH6~8 ;菌體濃度10~30% ;鏡檢無雜菌；發酵單位15000~25000u/ml。
[0023]實施例1
一級種子培養基制備:種子罐體積1.5m3，有效體積為lm3。
[0024]麩皮1kg、麥芽糖5kg、魚粉3kg、玉米衆5L、玉米蛋白粉1kg、啤酒酵母浸膏4kg,硫酸銨1kg、輕質碳酸鈣1kg、橄欖油5L。
[0025]將一級種子培養基滅菌并冷卻至25°C，并用無菌空氣保壓，然后在火焰保護下，將已經培養好的肉桂地鏈霉菌母瓶發酵液接入一級種子罐進行培養，接種量控制在0.3L。滅菌后一級種子培養基的氨基氮:51mg/100ml、溶磷:104ug/ml、脂肪:12g/L、pH:7.3。
[0026]一級種子培養:罐壓0.03~0.05MPa ;罐溫31~33°C;空氣流量:0~5h，采用空氣攪拌代替機械攪拌；6h~移種:50m3/h ;攪拌轉速60r/min。
[0027]一級種子培養 結束，菌體濃度21% ；pH值8.3 ;無其它雜菌污染；培養時間25h。
[0028]二級種子培養基制備:種子罐體積15m3，有效體積為10m3。
[0029]麩皮30kg、麥芽糖60kg、魚粉60kg、玉米衆80kg、玉米蛋白粉30kg、啤酒酵母浸膏50kg,硫酸銨30kg、輕質碳酸韓10kg、磷酸二氫鉀5kg,橄欖油150L。
[0030]先將二級種子培養基滅菌，冷卻至25°C，并用無菌空氣保壓。滅菌后的二級種子培養基氨基氮61mg/100ml、溶磷105ug/ml、脂肪16g/L、pH7.4。然后將一級種子液全部移入
二級種子罐進行培養。
[0031]二級種子培養條件:罐壓0.03~0.05MPa ;罐溫31~33°C ;空氣流量:0~12h，20m3/h ； 13h ~移種:50m3/h ;攬祥轉速 80r/min。
[0032]二級種子培養結束，其菌體濃度31% ；pH值8.2 ;無其它雜菌污染；培養時間30h。
[0033]發酵培養基制備過程:發酵罐體積130m3，有效體積為100m3。
[0034]麩皮800kg、麥芽糖1000kg、魚粉700kg、玉米漿1500kg、玉米蛋白粉500kg、啤酒酵母浸膏1500kg，硫酸銨400kg、輕質碳酸鈣300kg、磷酸二氫鉀50kg，橄欖油2500L、氯化鈉30kg、硫酸鎂20kg、硫酸亞鐵10kg、聚氧丙烯甘油30kg
先將發酵培養基滅菌，冷卻至20°C，并用無菌空氣保壓。滅菌后的發酵培養基氨基氮72mg/100ml、溶磷154ug/ml、脂肪27g/L、pH6.9。然后將二級種子液移入發酵罐進行發酵培養。
[0035]發酵培養控制方法:
1)溫度:采用變溫控制方法，O~20h:培養溫度29~31°C;20h~發酵結束:培養溫度32 ~33。。；
2)攪拌轉速:采用變頻攪拌控制方法，O~IOOh:轉速控制在100r/min ；101~200h:轉速控制在130r/min ；201h~發酵結束:轉速控制在90r/min
3)壓力控制:罐壓0.05~0.06MPa ；
4)pH控制:發酵過程中pH控制在6.0~7.0 ;5)無菌檢查:發酵過程中進行菌檢，要求無其它雜菌；
6)空氣流量:0~IOOh:150m3A ；101 ~200h:250m3/h ；201h ~發酵結束:IOOm3A ；
7)溶氧控制:發酵前5h內，不控制溶氧；6~100h，溶氧控制在60%以上；101~200h，溶氧控制在20%以上；201~發酵結束:溶氧控制在30%以上。
[0036]發酵培養結束，氨基氮13mg/100ml、pH6.8、還原糖0.73g/L ;脂肪1.12g/L、菌體濃度35%、化學效價43521u/ml、發酵周期261h。 [0037]實施例2
一級種子培養基制備:種子罐體積1.5m3，有效體積為lm3。
[0038]麩皮2kg、麥芽糖6kg、魚粉4kg、玉米衆6L、玉米蛋白粉2kg、啤酒酵母浸膏5kg,硫酸銨2kg、輕質碳酸|丐2kg、菜籽油6L。
[0039]將一級種子培養基滅菌并冷卻至26°C，并用無菌空氣保壓，然后在火焰保護下，將已經培養好的肉桂地鏈霉菌母瓶發酵液接入一級種子罐進行培養，接種量控制在0.3L。滅菌后一級種子培養基的氨基氮:53mg/100ml、溶磷:112ug/ml、脂肪:14g/L、pH:7.2。
[0040]一級種子培養:罐壓0.03~0.05MPa ;罐溫31~33°C;空氣流量:0~5h，采用空氣攪拌代替機械攪拌；6h~移種:52m3/h ;攪拌轉速65r/min。
[0041]一級種子培養結束，菌體濃度22% ；pH值8.0 ;無其它雜菌污染；培養時間27h。
[0042]二級種子培養基制備:種子罐體積15m3，有效體積為10m3。
[0043]麩皮40kg、麥芽糖70kg、魚粉70kg、玉米漿90kg、玉米蛋白粉40kg、啤酒酵母浸膏60kg,硫酸銨40kg、輕質碳酸韓20kg、磷酸二氫鉀6kg,菜籽油170L。
[0044]先將二級種子培養基滅菌，冷卻至26°C，并用無菌空氣保壓。滅菌后的二級種子培養基氨基氮63mg/100ml、溶磷115ug/ml、脂肪19g/L、pH7.2。然后將一級種子液全部移入
二級種子罐進行培養。
[0045]二級種子培養條件:罐壓0.03~0.05MPa ;罐溫31~33°C ;空氣流量:0~12h，22m3/h ； 13h ~移種:52m3/h ;攬祥轉速 85r/min。
[0046]二級種子培養結束，其菌體濃度32% ；pH值7.9 ;無其它雜菌污染；培養時間32h。
[0047]發酵培養基制備過程:發酵罐體積130m3，有效體積為100m3。
[0048]麩皮900kg、麥芽糖1100kg、魚粉800kg、玉米漿1600kg、玉米蛋白粉600kg、啤酒酵母浸膏1600kg,硫酸銨500kg、輕質碳酸|丐400kg、磷酸二氫鉀60kg,菜籽油3000L、氯化鈉40kg、硫酸鎂30kg、硫酸亞鐵20kg、聚氧丙烯甘油33kg
先將發酵培養基滅菌，冷卻至22°C，并用無菌空氣保壓。滅菌后的發酵培養基氨基氮73mg/100ml、溶磷162ug/ml、脂肪30g/L、pH6.7。然后將二級種子液移入發酵罐進行發酵培養。
[0049]發酵培養控制方法:
1)溫度:采用變溫控制方法，O~20h:培養溫度29~31°C;20h~發酵結束:培養溫度32 ~33。。；
2)攪拌轉速:采用變頻攪拌控制方法，O~IOOh:轉速控制在100r/min ；101~200h:轉速控制在130r/min ；201h~發酵結束:轉速控制在90r/min
3)壓力控制:罐壓0.05~0.06MPa ；
4)pH控制:發酵過程中pH控制在6.0~7.0 ;5)無菌檢查:發酵過程中進行菌檢，要求無其它雜菌；
6)空氣流量:0~IOOh:160m3A ；101 ~200h:260m3/h ；201h ~發酵結束:120m3/h ；
7)溶氧控制:發酵前5h內，不控制溶氧；6~100h，溶氧控制在60%以上；101~200h，溶氧控制在20%以上；201~發酵結束:溶氧控制在30%以上。
[0050]發酵培養結束,氨基氮17mg/100ml、pH6.7、還原糖0.89g/L ;脂肪1.51g/L、菌體濃度36%、化學效價43975u/ml、發酵周期265h。
[0051]實施例3
一級種子培養基制備:種子罐體積1.5m3，有效體積為lm3。
[0052]麩皮3kg、麥芽糖7kg、魚粉5kg、玉米衆7L、玉米蛋白粉3kg、啤酒酵母浸膏6kg,硫酸銨3kg、輕質碳酸|丐3kg、菜籽油7L。
[0053]將一級種子培養基滅菌并冷卻至27°C，并用無菌空氣保壓，然后在火焰保護下，將已經培養好的肉 桂地鏈霉菌母瓶發酵液接入一級種子罐進行培養，接種量控制在0.3L。滅菌后一級種子培養基的氨基氮:55mg/100ml、溶磷:124ug/ml、脂肪:18g/L、pH:7.0。
[0054]一級種子培養:罐壓0.03~0.05MPa ;罐溫31~33°C;空氣流量:0~5h，采用空氣攪拌代替機械攪拌；6h~移種:55m3/h ;攪拌轉速70r/min。
[0055]一級種子培養結束，菌體濃度23% ；pH值7.5 ;無其它雜菌污染；培養時間30h。
[0056]二級種子培養基制備:種子罐體積15m3,有效體積為10m3。
[0057]麩皮50kg、麥芽糖80kg、魚粉80kg、玉米漿100kg、玉米蛋白粉50kg、啤酒酵母浸膏70kg,硫酸銨50kg、輕質碳酸韓30kg、磷酸二氫鉀7kg,菜籽油200L。
[0058]先將二級種子培養基滅菌，冷卻至27°C，并用無菌空氣保壓。滅菌后的二級種子培養基氨基氮65mg/100ml、溶磷125ug/ml、脂肪21g/L、pH7.0。然后將一級種子液全部移入
二級種子罐進行培養。
[0059]二級種子培養條件:罐壓0.03~0.05MPa ;罐溫31~33°C ;空氣流量:0~12h，25m3/h ； 13h ~移種:55m3/h ;攬祥轉速 90r/min。
[0060]二級種子培養結束，其菌體濃度33% ；pH值7.5 ;無其它雜菌污染；培養時間33h。
[0061]發酵培養基制備過程:發酵罐體積130m3，有效體積為100m3。
[0062]麩皮1000kg、麥芽糖1200kg、魚粉900kg、玉米漿1700kg、玉米蛋白粉700kg、啤酒酵母浸膏1700kg，硫酸銨600kg、輕質碳酸鈣500kg、磷酸二氫鉀70kg，菜籽油3300L、氯化鈉50kg、硫酸鎂40kg、硫酸亞鐵30kg、聚氧丙烯甘油35kg
先將發酵培養基滅菌，冷卻至24°C，并用無菌空氣保壓。滅菌后的發酵培養基氨基氮75mg/100ml、溶磷174ug/ml、脂肪33g/L、pH6.5。然后將二級種子液移入發酵罐進行發酵培養。
[0063]發酵培養控制方法:
1)溫度:采用變溫控制方法，O~20h:培養溫度29~31°C;20h~發酵結束:培養溫度32 ~33。。；
2)攪拌轉速:采用變頻攪拌控制方法，O~IOOh:轉速控制在100r/min ；101~200h:轉速控制在130r/min ；201h~發酵結束:轉速控制在90r/min
3)壓力控制:罐壓0.05~0.06MPa ；
4)pH控制:發酵過程中pH控制在6.0~7.0 ;5)無菌檢查:發酵過程中進行菌檢，要求無其它雜菌；
6)空氣流量:0~IOOh:170m3A ；101 ~200h:270m3/h ；201h ~發酵結束:130m3/h ；
7)溶氧控制:發酵前5h內，不控制溶氧；6~100h，溶氧控制在60%以上；101~200h，溶氧控制在20%以上；201~發酵結束:溶氧控制在30%以上。
[0064]發酵培養結束,氨基氮21mg/100ml、pH6.5、還原糖1.0g/L ;脂肪1.62g/L、菌體濃度37%、化學效價44613u/ml、發酵周期270h。
[0065]實施例4 一級種子培養基制備:種子罐體積1.5m3，有效體積為lm3。
[0066]麩皮4kg、麥芽糖8kg、魚粉6kg、玉米衆8L、玉米蛋白粉4kg、啤酒酵母浸膏7kg,硫酸銨4kg、輕質碳酸|丐4kg、橄欖油8L。
[0067]將一級種子培養基滅菌并冷卻至28°C，并用無菌空氣保壓，然后在火焰保護下，將已經培養好的肉桂地鏈霉菌母瓶發酵液接入一級種子罐進行培養，接種量控制在0.3L。滅菌后一級種子培養基的氨基氮:57mg/100ml、溶磷:138ug/ml、脂肪:22g/L、pH:6.8。
[0068]一級種子培養:罐壓0.03~0.05MPa ;罐溫31~33°C;空氣流量:0~5h，采用空氣攪拌代替機械攪拌；6h~移種:57m3/h ;攪拌轉速75r/min。
[0069]一級種子培養結束，菌體濃度24% ；pH值7.1 ;無其它雜菌污染；培養時間32h。
[0070]二級種子培養基制備:種子罐體積15m3，有效體積為10m3。
[0071 ] 麩皮60kg、麥芽糖90kg、魚粉90kg、玉米衆110kg、玉米蛋白粉60kg、啤酒酵母浸膏80kg,硫酸銨60kg、輕質碳酸韓40kg、磷酸二氫鉀8kg,橄欖油230L。
[0072]先將二級種子培養基滅菌，冷卻至28°C，并用無菌空氣保壓。滅菌后的二級種子培養基氨基氮68mg/100ml、溶磷141ug/ml、脂肪26g/L、pH6.7。然后將一級種子液全部移入
二級種子罐進行培養。
[0073]二級種子培養條件:罐壓0.03~0.05MPa ;罐溫31~33°C ;空氣流量:0~12h，28m3/h ； 13h ~移種:57m3/h ;攬祥轉速 95r/min。
[0074]二級種子培養結束，其菌體濃度34% ；pH值7.0 ;無其它雜菌污染；培養時間34h。
[0075]發酵培養基制備過程:發酵罐體積130m3，有效體積為100m3。
[0076]麩皮1100kg、麥芽糖1300kg、魚粉1000kg、玉米漿1800kg、玉米蛋白粉800kg、啤酒酵母浸膏1800kg，硫酸銨700kg、輕質碳酸鈣600kg、磷酸二氫鉀80kg，橄欖油3700L、氯化鈉60kg、硫酸鎂50kg、硫酸亞鐵40kg、聚氧丙烯甘油38kg。
[0077]先將發酵培養基滅菌，冷卻至26°C，并用無菌空氣保壓。滅菌后的發酵培養基氨基氮77mg/100ml、溶磷186ug/ml、脂肪34g/L、pH6.3。然后將二級種子液移入發酵罐進行發
酵培養。
[0078]發酵培養控制方法:
1)溫度:采用變溫控制方法，O~20h:培養溫度29~31°C;20h~發酵結束:培養溫度32 ~33。。；
2)攪拌轉速:采用變頻攪拌控制方法，O~IOOh:轉速控制在100r/min ；101~200h:轉速控制在130r/min ；201h~發酵結束:轉速控制在90r/min
3)壓力控制:罐壓0.05~0.06MPa ；
4)pH控制:發酵過程中pH控制在6.0~7.0 ;5)無菌檢查:發酵過程中進行菌檢，要求無其它雜菌；
6)空氣流量:0~IOOh:180m3A ；101 ~200h:280m3/h ；201h ~發酵結束:140m3/h ；
7)溶氧控制:發酵前5h內，不控制溶氧；6~100h，溶氧控制在60%以上；101~200h，溶氧控制在20%以上；201~發酵結束:溶氧控制在30%以上。
[0079]發酵培養結束,氨基氮24mg/100ml、pH6.3、還原糖1.2g/L ;脂肪1.76g/L、菌體濃度38%、化學效價44216u/ml、發酵周期275h。
[0080]實施例5
一級種子培養基制備:種子罐體積1.5m3，有效體積為lm3。
[0081]麩皮5kg、麥芽糖89kg、魚粉7kg、玉米衆9L、玉米蛋白粉5kg、啤酒酵母浸膏8kg,硫酸銨45kg、輕質碳酸|丐5kg、菜籽油9L。
[0082]將一級種子培養基滅菌并冷卻至30°C，并用無菌空氣保壓，然后在火焰保護下，將已經培養好的肉桂地鏈霉菌母瓶發酵液接入一級種子罐進行培養，接種量控制在0.3L。滅菌后一級種子培養基的氨基氮 :60mg/100ml、溶磷:149ug/ml、脂肪:25g/L、pH:6.5。
[0083]一級種子培養:罐壓0.03~0.05MPa ;罐溫31~33°C;空氣流量:0~5h，采用空氣攪拌代替機械攪拌；6h~移種:60m3/h ;攪拌轉速80r/min。
[0084]一級種子培養結束，菌體濃度25% ；pH值6.6 ;無其它雜菌污染；培養時間35h。
[0085]二級種子培養基制備:種子罐體積15m3,有效體積為10m3。
[0086]麩皮70kg、麥芽糖100kg、魚粉100kg、玉米漿120kg、玉米蛋白粉70kg、啤酒酵母浸膏90kg,硫酸銨70kg、輕質碳酸|丐50kg、磷酸二氫鉀9kg,菜籽油250L。
[0087]先將二級種子培養基滅菌，冷卻至30°C，并用無菌空氣保壓。滅菌后的二級種子培養基氨基氮70mg/100ml、148ug/ml、脂肪30g/L、pH6.5。然后將一級種子液全部移入二級種子罐進行培養。
[0088]二級種子培養條件:罐壓0.03~0.05MPa ;罐溫31~33°C ;空氣流量:0~12h，30m3/h ； 13h ~移種:60m3/h ;攬祥轉速 100r/min。
[0089]二級種子培養結束，其菌體濃度35% ；pH值6.6 ;無其它雜菌污染；培養時間35h。
[0090]發酵培養基制備過程:發酵罐體積130m3，有效體積為100m3。
[0091 ] 麩皮1200kg、麥芽糖1400kg、魚粉1100kg、玉米漿1900kg、玉米蛋白粉900kg、啤酒酵母浸膏1900kg,硫酸銨800kg、輕質碳酸|丐700kg、磷酸二氫鉀90kg,菜籽油4000L、氯化鈉70kg、硫酸鎂60kg、硫酸亞鐵50kg、聚氧丙烯甘油40kg
先將發酵培養基滅菌，冷卻至27°C，并用無菌空氣保壓。滅菌后的發酵培養基氨基氮80mg/100ml、溶磷199ug/ml、脂肪39g/L、pH6。然后將二級種子液移入發酵罐進行發酵培養。[0092] 發酵培養控制方法:
1)溫度:采用變溫控制方法，O~20h:培養溫度29~31°C;20h~發酵結束:培養溫度32 ~33。。；
2)攪拌轉速:采用變頻攪拌控制方法，O~IOOh:轉速控制在100r/min ；101~200h:轉速控制在130r/min ；201h~發酵結束:轉速控制在90r/min
3)壓力控制:罐壓0.05~0.06MPa ；
4)pH控制:發酵過程中pH控制在6.0~7.0 ;
5)無菌檢查:發酵過程中進行菌檢，要求無其它雜菌；6)空氣流量:0~IOOh:200m3A ；101 ~200h:300m3/h ；201h ~發酵結束:150m3/h ；
7)溶氧控制:發酵前5h內，不控制溶氧；6~100h，溶氧控制在60%以上；101~200h，溶氧控制在20%以上；201~發酵結束:溶氧控制在30%以上。
[0093]發酵培養結束,氨基氮29mg/100ml、pH6.1、還原糖1.4g/L ;脂肪1.95g/L、菌體濃度3840%、化學效價43395u/ml、發酵周期280h。
[0094]在上述實施例1-5中，在發酵過程中需要進行補料。補料采用流加法，補料包括補油、補水、補糖和pH控制,其中
a補油工藝控制:
發酵前30h不用進行補油，
發酵時間在31~120h，當脂肪含量低于15%，補入橄欖油或菜籽油，控制脂肪含量為15~20%，每隔6~8h檢測發酵液脂肪含量，
發酵時間在121~200h，當脂肪含量低于10%，補入橄欖油或菜籽油，控制脂肪含量為10~15%，每隔6~8h檢測發酵液脂肪含量，
發酵時間在201h~240h，當脂肪含量低于5%，補入橄欖油或菜籽油，控制脂肪含量為5~8%，每隔6~8h檢測發酵液 脂肪含量，
發酵時間在241h~發酵結束，當脂肪含量低于1.5%，補入橄欖油或菜籽油，控制脂肪含量為1.5~2.5%，每隔6~8h檢測發酵液脂肪含量。
[0095]b補水工藝控制:發酵過程中，按照工藝要求必須定時補入一定量的水，其目的是控制發酵液的粘度和菌體濃度，有利于代謝產物的生成。
[0096]發酵前30h不用進行補水，
發酵時間在31~100h，當菌體濃度高于50%，加入滅菌水，要求控制發酵液菌體濃度在40~45%，每隔6~8h檢測發酵液菌體濃度，
發酵時間在101~200h，當菌體濃度高于45%，加入滅菌水，要求控制發酵液菌體濃度在40~45%，每隔6~8h檢測發酵液菌體濃度，
發酵時間在201h~發酵結束，當菌體濃度高于40%，加入滅菌水，要求控制發酵液菌體濃度在35~40%，每隔6~8h檢測發酵液菌體濃度。
[0097]c發酵過程pH控制工藝:
發酵前40h，pH不進行控制，
發酵時間在41~120h，若pH < 6.0，加入10~20%的氫氧化鈉，調節pH至6.0~6.5 ;若pH > 6.5，加入30%的硫酸銨溶液，調節pH至6.0~6.5，
發酵時間在121~發酵結束，若pH < 6.5，加入10~20%的氫氧化鈉，調節pH控至
6.5~7.0 ;若pH > 7.0，加入30%的硫酸銨溶液，調節pH至6.5~7.0。
[0098]d補入麥牙糖:
發酵前60h，還原糖含量不進行控制，
發酵61h至200h:還原糖含量< 3%時，補入已滅菌的麥芽糖溶液，使還原糖的含量控制在3~4%，
發酵201h至發酵結束:還原糖含量< 0.5%時，補入已滅菌的麥芽糖溶液，使還原糖的含量控制在0.5~1%，
上述麥芽糖溶液中加入麥芽糖酶，其濃度控制在0.001~0.003%。
【權利要求】
1.一種肉桂地鏈霉菌發酵生產莫能菌素的新型培養基，包括一級種子培養基、二級種子培養基和發酵培養基，其特征在于所述一級種子培養基的組成為:麩皮1~5g/L、麥芽糖.5~9g/L、魚粉3~7g/L、玉米衆5~9ml/L、玉米蛋白粉1~5g/L、啤酒酵母浸膏4~8g/L,硫酸銨1~5g/L、輕質碳酸鈣1~5g/L、橄欖油或菜籽油5~9ml/L ； 所述二級種子培養基組成為:麩皮3~7g/L、麥芽糖6~10g/L、魚粉6~9g/L、玉米衆8~12ml/L、玉米蛋白粉3~7g/L、啤酒酵母浸膏5~9g/L,硫酸銨3~7g/L、輕質碳酸鈣1~5g/L、磷酸二氫鉀0.5~0.9g/L,橄欖油或菜籽油15~25ml/L ； 所述發酵培養基組成為:麩皮8~12g/L、麥芽糖10~14g/L、魚粉7~llg/L、玉米漿.15~19ml/L、玉米蛋白粉5~9g/L、啤酒酵母浸膏15~19g/L,硫酸銨4~8g/L、輕質碳酸鈣3~7g/L、磷酸二氫鉀0.5~0.9g/L，橄欖油或菜籽油25~40ml/L，氯化鈉0.3~0.7g/L、硫酸鎂0.2~0.6g/L、硫酸亞鐵0.1~0.5g/L、聚氧丙烯甘油0.3~0.4g/L。
2.一種利用權利要求1所述培養基生產莫能菌素的培養方法，其特征在于其工藝步驟為: . 1)一級種子培養:首先將一級種子培養基滅菌并冷卻至25~30°C，并用無菌空氣保壓，然后在火焰保護下，將已經培養好的肉桂地鏈霉菌母瓶發酵液按照0.3~0.5L/m3的接種量接入該一級種子培養基中進行一級種子培養，至菌體濃度20~25%、pH值6.5~8.5、培養時間25~35h時移種； . 2)二級種子培養:先將二級種子培養基滅菌，冷卻至25~30°C，并用無菌空氣保壓，將培養好的一級種子液移入二級種子培養基中進行二級種子培養，移種比例控制在9~11%，至菌體濃度30~35%、pH值6.5~8.5、培養時間30~35h時移種； . 3)發酵培養:先將發酵培養基滅菌，冷卻至20~27°C，并用無菌空氣保壓，然后將培養好的二級種子液移入發酵培養基進行發酵培養，移種比例控制在9~11%，至菌體濃度35~40%、還原糖< 1.5g/L、脂肪:< 2g/L、氨基氮:10 ~30mg/100ml、化學效價> 43000u/mL、pH:6.0~7.0、培養時間260~280h時終止發酵。
3.按照權利要求2所述的培養方法，其特征是: 滅菌后的一級種子培養基的質量要求:氨基氮:50~60mg/100ml、溶磷:100~150ug/ml、脂肪:10 ~25g/L、pH:6.5 ~7.5 ; 滅菌后的二級種子培養基的質量要求:氨基氮:60~70mg/100ml、溶磷:100~150ug/ml、脂肪:15 ~30g/L、pH:6.5 ~7.5 ; 滅菌后的發酵培養基的質量要求:氨基氮:70~80mg/100ml、溶磷:150~200ug/ml、脂肪:25 ~40g/L、pH:6 ~7。
4.按照權利要求2所述的培養方法，其特征在于所述培養好的母瓶發酵液質量要求為:pH6~8 ;菌體濃度10~30% ;鏡檢無雜菌；發酵單位15000~25000u/ml。
5.按照權利要求2所述的培養方法，其特征在于所述一級種子培養條件為:罐壓.0.03~0.05MPa ;罐溫31~33°C;空氣流量:0~5h，采用空氣攪拌代替機械攪拌；6h~移種:50~60m3/h ;攬祥轉速60~80r/m1n。
6.按照權利要求2所述的培養方法，其特征是在于所述二級種子培養條件為:罐壓.0.03 ~0.05MPa ;罐溫 31 ~33°C;空氣流量:0 ~12h，20 ~30m3/h ;13h ~移種:50 ~60m3/h ;攬拌轉速80~100r/m1n。
7.按照權利要求2所述的培養方法，其特征在于所述發酵培養條件為: a培養基初始pH:發酵培養基滅菌后pH控制在6~7 ; b溫度:采用變溫控制方法，O~20h:培養溫度29~31°C;20h~發酵結束:培養溫度32 ~33。。； c攪拌轉速:采用變頻攪拌控制方法，O~IOOh:轉速控制在100r/min ;101~200h:轉速控制在130r/min ；201h~發酵結束:轉速控制在90r/min ；d壓力控制:罐壓0.05~0.06MPa ；e pH控制:發酵過程中pH控制在6.0~7.0 ; f 空氣流量:0 ~IOOh:150 ~200mVh ;101 ~200h:250 ~300m3/h ;201h ~發酵結束:100 ~150m3A ；h溶氧控制: 發酵前5h內，不控制溶氧； .6~100h，溶氧控制在60%以上； .101~200h，溶氧控制在20%以上； .201~發酵結束:溶氧控制在30%以上。
8.按照權利要求2所述的培養方法，其特征在于在發酵過程中采用流加法進行補料，補料包括補油、補水、補糖和pH控制，其中 a補油工藝控制: 發酵前30h不用進行補油， 發酵時間在31~120h，當脂肪含量低于15%，補入橄欖油或菜籽油，控制脂肪含量為15~20%，每隔6~8h檢測發酵液脂肪含量， 發酵時間在121~200h，當脂肪含量低于10%，補入橄欖油或菜籽油，控制脂肪含量為10~15%，每隔6~8h檢測發酵液脂肪含量， 發酵時間在201h~240h，當脂肪含量低于5%，補入橄欖油或菜籽油，控制脂肪含量為5~8%，每隔6~8h檢測發酵液脂肪含量， 發酵時間在241h~發酵結束，當脂肪含量低于1.5%，補入橄欖油或菜籽油，控制脂肪含量為1.5~2.5%，每隔6~8h檢測發酵液脂肪含量；b補水工藝控制: 發酵前30h不用進行補水， 發酵時間在31~100h，當菌體濃度高于50%，加入滅菌水，要求控制發酵液菌體濃度在40~45%，每隔6~8h檢測發酵液菌體濃度， 發酵時間在101~200h，當菌體濃度高于45%，加入滅菌水，要求控制發酵液菌體濃度在40~45%，每隔6~8h檢測發酵液菌體濃度， 發酵時間在201h~發酵結束，當菌體濃度高于40%，加入滅菌水，要求控制發酵液菌體濃度在35~40%，每隔6~8h檢測發酵液菌體濃度；c發酵過程pH控制工藝: 發酵前40h，pH不進行控制， 發酵時間在41~120h，若pH < 6.0，加入10~20%的氫氧化鈉，調節pH至6.0~6.5 ;若pH > 6.5，加入30%的硫酸銨溶液，調節pH至6.0~6.5，發酵時間在121~發酵結束，若pH < 6.5，加入10~20%的氫氧化鈉，調節pH控至.6.5~7.0 ;若pH > 7.0，加入30%的硫酸銨溶液，調節pH至6.5~7.0 ; d補入麥芽糖: 發酵前60h，還原糖含量不進行控制， 發酵61h至200h:還原糖含量< 3%時，補入已滅菌的麥芽糖溶液，使還原糖的含量控制在3~4%， 發酵201h至 發酵結束:還原糖含量< 0.5%時，補入已滅菌的麥芽糖溶液，使還原糖的含量控制在0.5~1%， 上述麥芽糖溶液中加入麥芽糖酶，其濃度控制在0.001~0.003%。
【文檔編號】C12P17/16GK103937848SQ201410147478
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月14日 優先權日:2014年4月14日
【發明者】任勇, 王 義 申請人:寧夏泰瑞制藥股份有限公司