一種豬肺炎支原體選擇性分離培養(yǎng)基及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于獸醫(yī)生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種豬肺炎支原體選擇性分離培養(yǎng)基及其制備方法。本發(fā)明提供的一種豬肺炎支原體選擇性分離培養(yǎng)基，其主要成分為水解乳蛋白，酵母浸粉，MEM培養(yǎng)基，Hank’s液，0.1％酚紅溶液，健康馬血清，青霉素和去離子水，特異性生長(zhǎng)抑制血清。本發(fā)明的豬肺炎支原體選擇性培養(yǎng)基能夠用于豬肺炎支原體的快速分離鑒定，配制方法簡(jiǎn)單可行，試驗(yàn)結(jié)果可靠，分離時(shí)間縮短為103h～122h，時(shí)間縮短17%～23%，分離成功率高達(dá)75%以上，是現(xiàn)有培養(yǎng)基分離成功率的10倍以上。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種豬肺炎支原體選擇性分離培養(yǎng)基及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于獸醫(yī)生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種豬肺炎支原體選擇性分離培養(yǎng)基及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]豬肺炎支原體是引起豬的接觸性慢性呼吸道疾病的重要病原之一，在全世界廣泛存在，嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展，其主要危害是引起豬的生長(zhǎng)受阻、飼料轉(zhuǎn)化率大幅下降，繼發(fā)引起其他疾病的發(fā)生并加重發(fā)病癥狀。豬支原體肺炎滅活疫苗可以減少喘氣病的發(fā)生，但優(yōu)質(zhì)疫苗的前提需要有一種好的疫苗株及地區(qū)豬肺炎支原體流行現(xiàn)狀來(lái)支撐。培養(yǎng)基是人工合成各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供微生物生長(zhǎng)的基質(zhì)。支原體是一種微小原核生物，無(wú)細(xì)胞壁，可在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，形成小菌落，但培養(yǎng)條件要求十分苛刻，且生長(zhǎng)速度慢，豬鼻支原體、豬滑液支原體、絮狀支原體與豬肺炎支原體常同時(shí)存在于豬的體內(nèi)，且其生長(zhǎng)速度均高于豬肺炎支原體，從而開(kāi)展豬肺炎支原體分離鑒定時(shí)常發(fā)生污染，而導(dǎo)致豬肺炎支原體分離失敗，這樣對(duì)防治豬氣喘病的研究造成困難。在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，豬肺炎支原體典型癥狀仔豬，病料的豬肺炎支原體的分離率極低，甚至由于豬滑液支原體等病原微生物的污染分離率低至I~5%，亟待一種新的實(shí)驗(yàn)方案解決豬肺炎支原體的分離問(wèn)題。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種適合豬肺炎支原體生長(zhǎng)，且生長(zhǎng)快、活菌滴度相對(duì)較高且能夠抑制豬鼻支原體、豬滑液支原體、絮狀支原體生長(zhǎng)的豬肺炎支原體選擇性分離培養(yǎng)基，使用該選擇性分離培養(yǎng)基用于臨床分離培養(yǎng)豬肺炎支原體，提高分離過(guò)程中支原體生長(zhǎng)速度，提高豬肺炎支原體的分離率，特異性和敏感性顯著提高，用于豬肺炎支原體分離培養(yǎng)、生化特征、遺傳、免疫等方面的研究。
[0004]本發(fā)明提供的一種豬肺炎支原體選擇性分離培養(yǎng)基，其主要成分為水解乳蛋白，酵母浸粉，MEM培養(yǎng)基，Hank’ s液，0.1 %酚紅溶液，健康馬血清，青霉素和去離子水，特異性生長(zhǎng)抑制血清(豬鼻支原體、豬滑液支原體、絮狀支原體)。
[0005]本發(fā)明另一目的是提供用于該豬肺炎支原體培養(yǎng)基的制備方法。
[0006]本發(fā)明的目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
一種豬肺炎支原體選擇性分離培養(yǎng)基，其特征在于，按照下列配比制得:水解乳蛋白40~50g，酵母浸粉40~50g，MEM培養(yǎng)基40~50g，10XHank’s液20~60mL，0.1%酚紅溶液10~20mL，青霉素500~800萬(wàn)單位，健康馬血清1000~2000mL，特異性生長(zhǎng)抑制血清25~45mL,去離子水調(diào)整至lOOOOmL。
[0007]進(jìn)一步優(yōu)化的配比如下:水解乳蛋白45g，酵母浸粉45g，MEM培養(yǎng)基49g，10 X Hank’ s液50mL，0.1 %酚紅溶液10mL，青霉素600萬(wàn)單位，健康馬血清1500mL，特異性生長(zhǎng)抑制血清30mL，去離子水調(diào)整至lOOOOmL。
[0008]本發(fā)明用于豬肺炎支原體選擇性分離培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于，按照下列步驟制備:
(I)按配比稱(chēng)取水解乳蛋白40~50g、酵母浸粉40~50g、MEM培養(yǎng)基49g溶解于去離子水5000mL，攪拌，使之完全溶解，加入10 X Hank’ s液20~60mL、0.1 %酚紅溶液10~20mL、青霉素500~800萬(wàn)單位,用0.45 μ m濾膜過(guò)濾除菌,4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0009](2)臨用前，加入健康馬血清1000~2000mL、特異性生長(zhǎng)抑制血清25~45mL，用lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)整pH至7.6~7.8，使用去離子水適量調(diào)整至總體積lOOOOmL，即得豬肺炎支原體選擇性分離液體培養(yǎng)基。
[0010]本發(fā)明所述特異性生長(zhǎng)抑制血清是指同時(shí)抑制豬鼻支原體、豬滑液支原體、絮狀支原體的特異性生長(zhǎng)抑制血清。
[0011]本發(fā)明的要點(diǎn)在于選擇合適的組分制備常規(guī)豬肺炎支原體專(zhuān)用培養(yǎng)基，并在該基礎(chǔ)上進(jìn)一步加入豬鼻支原體、豬滑液支原體、絮狀支原體等三種特異性生長(zhǎng)抑制血清，制備成豬肺炎支原體選擇性分離培養(yǎng)基，用于豬肺炎支原體的分離培養(yǎng)。在該培養(yǎng)基上，豬肺炎支原體接種后，生長(zhǎng)良好。使用前加入制備的生長(zhǎng)抑制血清，可抑制豬鼻支原體、豬滑液支原體、絮狀支原體的生長(zhǎng)，選擇性的分離培養(yǎng)豬肺炎支原體。
[0012]本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):豬肺炎支原體選擇性培養(yǎng)基能夠用于豬肺炎支原體的快速分離鑒定，配制方法簡(jiǎn)單可行，試驗(yàn)結(jié)果可靠，分離時(shí)間縮短為103h~122h，時(shí)間縮短17%~23%，分離成功率高達(dá)75%以上，是現(xiàn)有培養(yǎng)基分離成功率的10倍以上。
【具體實(shí)施方式】
[0013]下面結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
[0014]按照下述配方所列配比及按照發(fā)明所述的制備方法制得配方一、配方二、配方三，具體如下:
配方一:水解乳蛋白40g，酵母浸粉40g，MEM培養(yǎng)基4(^，10\他1^’8液201^，0.1%酚紅溶液10mL，青霉素500萬(wàn)單位，健康馬血清1000mL,特異性生長(zhǎng)抑制血清25mL，去離子水調(diào)整至lOOOOmL。
[0015]制備方法:(1)稱(chēng)取水解乳蛋白40g,酵母浸粉40g, MEM培養(yǎng)基40g溶解于去離子水5000mL，攪拌，使之完全溶解，加入10 XHankj s液20mL，0.1%酚紅溶液10mL，青霉素500萬(wàn)單位，用0.45 μ m濾膜過(guò)濾除菌，4°C保存?zhèn)溆茫?2)加入健康馬血清lOOOmL、特異性生長(zhǎng)抑制血清25mL，用lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)整pH至7.6，使用去離子水調(diào)整至總體積lOOOOmL，即得豬肺炎支原體選擇性分離液體培養(yǎng)基一。
[0016]配方二:水解乳蛋白50g，酵母浸粉50g, MEM培養(yǎng)基50g，10XHank，s液60mL，
0.1 %酚紅溶液20mL，青霉素800萬(wàn)單位，健康馬血清2000mL，特異性生長(zhǎng)抑制血清45mL，去離子水調(diào)整至lOOOOmL。
[0017]制備方法:(1)稱(chēng)取水解乳蛋白50g,酵母浸粉50g, MEM培養(yǎng)基50g溶解于去離子水5000mL，攪拌，使之完全溶解，加入10 X Hankj s液60mL，0.1 %酚紅溶液20mL，青霉素800萬(wàn)單位，用0.45 μ m濾膜過(guò)濾除菌，4°C保存?zhèn)溆谩?2)加入健康馬血清2000mL、特異性生長(zhǎng)抑制血清45mL，用lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)整pH至7.8，使用去離子水調(diào)整至總體積lOOOOmL，即得豬肺炎支原體選擇性分離液體培養(yǎng)基二。
[0018]配方三:水解乳蛋白458、酵母浸粉458、]\^]\1培養(yǎng)基498、10\他1^’ s液50mL、0.1 %酚紅溶液10mL、青霉素600萬(wàn)單位、健康馬血清1500mL、特異性生長(zhǎng)抑制血清30mL、去離子水調(diào)整至lOOOOmL。
[0019]備方法:(1)稱(chēng)取水解乳蛋白45g，酵母浸粉45g，MEM培養(yǎng)基49g溶解于去離子水5000mL，攪拌，使之完全溶解，加入10 XHank’ s液50mL，0.1 %酚紅溶液IOOmL,青霉素600萬(wàn)單位，用0.45 μ m濾膜過(guò)濾除菌，4°C保存?zhèn)溆谩?2)加入健康馬血清1500mL、特異性生長(zhǎng)抑制血清30mL，用lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)整pH至7.6，使用去離子水調(diào)整至總體積lOOOOmL，即得豬肺炎支原體選擇性分離液體培養(yǎng)基三。
[0020]使用本發(fā)明培養(yǎng)基一、培養(yǎng)基二、培養(yǎng)基三作為本發(fā)明選用的培養(yǎng)基，使用KM2、A26兩種培養(yǎng)基作為對(duì)照培養(yǎng)基，進(jìn)行臨床癥狀典型、且使用PCR方法證實(shí)豬肺炎支原體感染陽(yáng)性的71份病料分別進(jìn)行了豬肺炎支原體病原分離鑒定，結(jié)果如對(duì)照實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表所示(表 I)。
【權(quán)利要求】
1.一種豬肺炎支原體選擇性分離培養(yǎng)基，其特征在于，由下列組份按照配比制得:水解乳蛋白40~50g，酵母浸粉40~50g，MEM培養(yǎng)基40~50g，10 X Hank’ s液20~60mL，0.1 %酚紅溶液10~20mL，青霉素500~800萬(wàn)單位，健康馬血清1000~2000mL，特異性生長(zhǎng)抑制血清25~45mL，去離子水調(diào)整至lOOOOmL。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬肺炎支原體選擇性分離培養(yǎng)基，其特征在于，所述組份的配比為水解乳蛋白45g，酵母浸粉45g，MEM培養(yǎng)基為49g，10XHank’ s液50mL，0.1%酚紅溶液10mL，青霉素600萬(wàn)單位，健康馬血清1500mL，特異性生長(zhǎng)抑制血清30mL，去離子水調(diào)整至lOOOOmL。
3.用于權(quán)利要求1的一種豬肺炎支原體選擇性分離培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于，按照下列步驟制備: (1)按配比稱(chēng)取水解乳蛋白40~50g、酵母浸粉40~50g、MEM培養(yǎng)基49g溶解于去離子水5000mL，攪拌，使之完全溶解，加入10 X Hank’ s液20~60mL、0.1 %酚紅溶液10~20mL、青霉素500~800萬(wàn)單位,用0.45 μ m濾膜過(guò)濾除菌,4°C保存?zhèn)溆茫? (2)臨用前，加入健康馬血清1000~2000mL、特異性生長(zhǎng)抑制血清25~45mL，用lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)整pH至7.6~7.8，使用去離子水適量調(diào)整至總體積lOOOOmL，即得豬肺炎支原體選擇性分離液體培養(yǎng)基。
4.用于權(quán)利要求2的一種豬肺炎支原體選擇性分離培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于，按照下列步驟制備: (1)稱(chēng)取水解乳蛋白45g，酵母浸粉45g，MEM培養(yǎng)基49g溶解于去離子水5000mL，攪拌，使之完全溶解，加入10 X Hank’ s液50mL，0.1 %酚紅溶液IOOmL,青霉素600萬(wàn)單位，用.0.45 μ m濾膜過(guò)濾除菌，4°C保存?zhèn)溆茫? (2)加入健康馬血 清1500mL、特異性生長(zhǎng)抑制血清30mL，用lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)整pH至7.6，使用去離子水調(diào)整至總體積lOOOOmL，即得豬肺炎支原體選擇性分離液體培養(yǎng)基。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK104017856SQ201410233471
【公開(kāi)日】2014年9月3日 申請(qǐng)日期:2014年5月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月29日
【發(fā)明者】李書(shū)光, 李峰, 沈志強(qiáng), 張娜 申請(qǐng)人:山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院