專利名稱：煙葉微生物選擇性培養基配制及培養煙葉微生物的方法
技術領域：
本發明專利屬于煙葉微生物的選擇性培養技術領域。
背景技術：
煙葉醇化的發酵過程中有微生物、酶及化學物質的協同作用，誘發一系列與香氣物質變化有關的生化反應。其中微生物貫穿煙葉發酵始終，很多致香物質都是通過微生物的生化代謝途徑而獲得的。因此，煙葉微生物區系的檢測對于提高煙葉品質相關的醇化技術研究起著較為重要的作用。微生物區系主要包括三大類細菌、真菌、放線菌。隨著科學技術的進步，檢測微生 物區系的技術手段也越來越豐富，但目前主要集中于分子技術鑒定法及傳統平板培養法兩種方法。傳統分子技術所需要的儀器、試劑、耗材等比較昂貴，克隆測序成本較高、操作較繁瑣，周期長，而且通過傳統分子技術手段僅能做到定性，難做定量。而采用新型的用熒光定量分子技術進行定量，其檢測成本將更加高昂。因此，分離和統計這三類微生物數量較為快速經濟、簡便易行的方法仍然是平板培養法，它主要是利用不同營養成分的固體培養基對煙葉微生物進行選擇性培養，然后根據菌落形成單位(CFU)和菌落形態來分析鑒定微生物種類，該法的核心及關鍵在于選擇性培養基的分離效果。而現有用于微生物區系的選擇性培養基大都是針對土壤微生物區系來設計的，因此對于煙葉微生物的培養適宜性以及抗生素適用性都較差，從而影響了煙葉微生物的培養及分離效，最終導致檢測結果偏離真實值。
發明內容
本發明的目的是解決現有技術的問題，提供一種煙葉微生物選擇性培養基的配制方法以及培養煙葉微生物的方法，以煙葉微生物的培養及分離為出發點，針對性的設計煙葉微生物區系檢測中所涉及的真菌、細菌、放線菌進行選擇性培養基的配方設計，提供一種能夠解決傳統選擇性培養基培養不完全以及分離效果差的方法，并且為檢測結果的準確性及檢測操作的便利性提供支持。本發明的目的通過如下技術方案實現。煙葉微生物選擇性培養基的配制方法，包括如下步驟
(O制備煙葉提取物取廢棄煙葉或煙葉碎末500g加10-15倍水提取2-4h，提取完成后將提取液過濾進行減壓濃縮，濃縮至其相對密度d2020為1. 053±0. 008、折光指數Nd20為1. 372±0. 008，放置于4°C溫度保存使用；
(2)制作煙葉選擇性培養基，包括
a、制作煙葉細菌選擇性培養基配制煙葉細菌選擇性培養基的配方為牛肉膏2. 5-3. 5g/L、蛋白胨9-10 g/L、NaC15-6g/L、煙葉提取物15_20g/L、瓊脂10_15g/L、余量為水；煙葉細菌選擇性培養基的PH7. 0-7. 2 ;將配制好的煙葉細菌選擇性培養基于115°C滅菌30分鐘，臨用前待煙葉細菌選擇性培養基稍冷至40-50°C時，加入10-15Pg/L潮霉素B稀釋液，混勻后倒板；b、制作煙葉真菌選擇性培養基配制煙葉真菌選擇性培養基的配方為葡萄糖9-12g/L、蛋白胨 4-6g/L、KH2PO4O. 8-1. 2g/L、MgSO4. 7Η200· 4-0. 6 g/L、煙葉提取物 15_20g/L、1/3000孟加拉紅90-120 ml、瓊脂10-15 g /L、余量為水；煙葉真菌選擇性培養基的pH按自然所得；將配制好的煙葉真菌選擇性培養基于115°C滅菌20分鐘，臨用前待煙葉真菌選擇性培養基稍冷至40-50°C時，加入8-12 mg/L的鏈霉素稀釋液混勻后倒板；
C、制作煙葉放線菌選擇性培養基配制煙葉放線菌選擇性培養基的配方為可溶性淀粉 15-20 g/L、KH2PO4O. 3-0. 5 g/L、MgSO4. 7Η200· 3-0. 5 g/L、KNO3O. 8-1. Og/L、FeSO4. 7H200. 008-0. 01 g/L、NaC10. 3-0. 5 g/L、煙葉提取物 15_20g/L、瓊脂 10-15 g/L、余量為水；配制時，需先將可溶性淀粉加少量冷水調制成糊狀，再加入沸水中；煙葉放線菌選擇性培養基的PH7. 2-7. 4 ;將配制好的煙葉放線菌選擇性培養基于115°C滅菌30分鐘，臨用時在已滅菌的培養基中加入45-60 mg/L的重鉻酸鉀溶液，搖勻后倒板。
利用選擇性培養基培養煙葉微生物的方法，稱取IOg新鮮或4°C保存的煙樣置于盛有90mL無菌的磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌三角瓶內，放入適量玻璃珠，于150r/min轉速下震蕩30min，靜置20min，制成1:10的一次樣品勻液；用ImL無菌吸管或微量移液器吸取一次樣品勻液lmL，沿管壁緩慢注于盛有9mL稀釋液的無菌試管中且吸管或吸頭尖端不觸及稀釋液面，振搖無菌試管或換用I支無菌吸管反復吹打使一次樣品勻液與稀釋液混合均勻，制成1:100的二次樣品勻液；以此類推，制備得到10倍系列稀釋的十次樣品勻液;每遞增稀釋一次，換用I次ImL無菌吸管或吸頭；選擇2個 3個樣品勻液，吸取O.1mL樣品勻液涂布于煙葉細菌選擇性培養基或煙葉真菌選擇性培養基或煙葉放線菌選擇性培養基上，每個稀釋度做三個平皿；細菌于30°C ±1°C培養2-3d ;真菌于28°C ±1°C培養3_4d ；放線菌于28°C ±1°C培養4-5d，即得到煙葉微生物。本發明的各類微生物選擇性培養基，針對煙葉微生物的選擇性培養而配制，通過添加不同抗生素或其他抑菌試劑，能做到將煙葉中的細菌、真菌、放線菌較好的分離開，雜菌率低于5%，極大地方便了分別統計細菌、真菌、放線菌這三類微生物的數量，使傳統的分離培養方法得到有效改善。
具體實施例方式實施例1
本發明具體的煙葉細菌選擇性培養基的配制方法如下
(1)煙葉提取物的制備
取廢棄煙葉或煙末500g加10-15倍水提取2-4h，提取完成后將提取液過濾進行減壓濃縮，濃縮至其相對密度d2020為1.053±0. 008、折光指數Nd20為1. 372±0· 008，放置于4°C溫度保存使用；
(2)煙葉細菌選擇性培養基的配制
按照表I的配方進行煙葉細菌選擇性培養基的配制，煙葉細菌選擇性培養基配制完后，于115°C滅菌30分鐘，臨用前待煙葉細菌選擇性培養基稍冷至40-50°C時，加入10-15Pg/L潮霉素B稀釋液,混勻后倒板；
表I煙葉細菌選擇性培養基配方
I試劑名稱 I用量—
權利要求
1.煙葉微生物選擇性培養基的配制方法，其特征在于，包括如下步驟(O制備煙葉提取物取廢棄煙葉或煙葉碎末500g加10-15倍水提取2-4h，提取完成后將提取液過濾進行減壓濃縮，濃縮至其相對密度d2020為1. 053±0. 008、折光指數Nd20為1. 372±0. 008，放置于4°C溫度保存使用；(2)制作煙葉選擇性培養基，包括a、制作煙葉細菌選擇性培養基配制煙葉細菌選擇性培養基的配方為牛肉膏2.5-3. 5g/L、蛋白胨9-10 g/L、NaC15-6g/L、煙葉提取物15_20g/L、瓊脂10_15g/L、余量為水；煙葉細菌選擇性培養基的PH7. 0-7. 2 ;將配制好的煙葉細菌選擇性培養基于115°C滅菌30分鐘，臨用前待煙葉細菌選擇性培養基稍冷至40-50°C時，加入10-15Pg/L潮霉素B稀釋液，混勻后倒板；b、制作煙葉真菌選擇性培養基配制煙葉真菌選擇性培養基的配方為葡萄糖9-12g/L、蛋白胨 4-6g/L、KH2PO4O. 8-1. 2g/L、MgSO4. 7Η200· 4-0. 6 g/L、煙葉提取物 15_20g/L、1/3000孟加拉紅90-120 ml、瓊脂10-15 g /L、余量為水；煙葉真菌選擇性培養基的pH按自然所得；將配制好的煙葉真菌選擇性培養基于115°C滅菌20分鐘，臨用前待煙葉真菌選擇性培養基稍冷至40-50°C時，加入8-12 mg/L的鏈霉素稀釋液混勻后倒板；C、制作煙葉放線菌選擇性培養基配制煙葉放線菌選擇性培養基的配方為可溶性淀粉 15-20 g/L、KH2PO4O. 3-0. 5 g/L、MgSO4. 7Η200· 3-0. 5 g/L、KNO3O. 8-1. Og/L、FeSO4. 7H200. 008-0. 01 g/L、NaC10. 3-0. 5 g/L、煙葉提取物 15_20g/L、瓊脂 10-15 g/L、余量為水；配制時，需先將可溶性淀粉加少量冷水調制成糊狀，再加入沸水中；煙葉放線菌選擇性培養基的PH7. 2-7. 4 ;將配制好的煙葉放線菌選擇性培養基于115°C滅菌30分鐘，臨用時在已滅菌的培養基中加入45-60 mg/L的重鉻酸鉀溶液，搖勻后倒板。
2.利用權利要求1所述選擇性培養基培養煙葉微生物的方法，其特征在于，稱取IOg新鮮或4°C保存的煙樣置于盛有90mL無菌的磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌三角瓶內，放入適量玻璃珠，于150r/min轉速下震蕩30min,靜置20min,制成1:10的一次樣品勻液；用ImL無菌吸管或微量移液器吸取一次樣品勻液lmL，沿管壁緩慢注于盛有9mL稀釋液的無菌試管中且吸管或吸頭尖端不觸及稀釋液面，振搖無菌試管或換用I支無菌吸管反復吹打使一次樣品勻液與稀釋液混合均勻，制成I 100的二次樣品勻液；以此類推，制備得到10倍系列稀釋的十次樣品勻液；每遞增稀釋一次，換用I次ImL無菌吸管或吸頭；選擇2個 3個樣品勻液，吸取O.1mL樣品勻液涂布于煙葉細菌選擇性培養基或煙葉真菌選擇性培養基或煙葉放線菌選擇性培養基上，每個稀釋度做三個平皿；細菌于30°C ±1°C培養2-3d ;真菌于28°C ±1°C培養3-4d;放線菌于28°C ± 1°C培養4_5d，即得到煙葉微生物。
全文摘要
煙葉微生物選擇性培養基配制及培養煙葉微生物的方法，先用廢棄煙葉或煙葉碎末制備煙葉提取物，再制作煙葉細菌、真菌和放線菌的選擇性培養基。稱取10g新鮮或4℃保存的煙樣置于盛有90mL無菌的磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌三角瓶內，于150r/min轉速下震蕩30min，靜置20min，制成1:10的一次樣品勻液；再用一次樣品勻液經過多次稀釋制備得到10倍系列稀釋的十次樣品勻液；選擇2個～3個樣品勻液，吸取0.1mL樣品勻液涂布于煙葉細菌選擇性培養基或煙葉真菌選擇性培養基或煙葉放線菌選擇性培養基上；細菌于30℃±1℃培養2-3d；真菌于28℃±1℃培養3-4d；放線菌于28℃±1℃培養4-5d，即得到煙葉微生物。本發明可將煙葉中的細菌、真菌、放線菌較好分離，雜菌率低。
文檔編號C12N1/20GK103014122SQ20121055441
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月19日 優先權日2012年12月19日
發明者周麗娟, 薛紅芬, 史云濤, 周芳芳, 王娟, 張曉龍, 資文華, 鄧國賓 申請人:云南瑞升煙草技術(集團)有限公司