鴨皰疹病毒1型ul7截短重組蛋白及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示的鴨皰疹病毒1型(AHV-1)UL7截短重組蛋白，其編碼基因，重組表達(dá)載體，工程菌，并利用工程菌制備該截短重組蛋白以及該截短重組蛋白的多克隆抗體；該截短重組蛋白具有與天然AHV-1UL7蛋白相似的免疫反應(yīng)活性，能夠與AHV-1抗體特異性結(jié)合，可作為檢測(cè)AHV-1抗體的試劑應(yīng)用，由于該截短重組蛋白非全細(xì)菌，應(yīng)用其進(jìn)行檢測(cè)時(shí)無散毒危險(xiǎn)，且制備方法簡(jiǎn)單，適于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)化，利于不同實(shí)驗(yàn)室之間的結(jié)果比較；該截短重組蛋白的多克隆抗體可作為檢測(cè)AHV-1抗原的試劑，具有特異性好，與鴨肝炎病毒、雛鵝新型腸炎病毒不產(chǎn)生交叉反應(yīng)，還可作為檢測(cè)UL7蛋白在AHV-1感染宿主細(xì)胞中的定位和分布的試劑應(yīng)用。
【專利說明】鴨皰疹病毒1型UL7截短重組蛋白及其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種病毒截短重組蛋白及其制備方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]鴨抱疫病毒I型(Anatid Herpesvirusl, AHV-1)屬抱疫病毒科、ct -抱疫病毒亞科、馬立克病毒屬，可引起鴨、鵝和天鵝等水禽發(fā)生一種急性、熱性、接觸性傳染的敗血性傳染病，病鴨臨床表現(xiàn)為精神沉郁，高熱稽留，共濟(jì)失調(diào)、下痢、流淚和部分病鴨頭頸腫大，臨床以急性敗血癥過程為主要特征，流行于世界大多數(shù)養(yǎng)鴨、鵝地區(qū)及野生水禽的主要遷棲地，傳播迅速，發(fā)病率和死亡率可高達(dá)90 %以上，常造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重威脅我國水禽養(yǎng)殖業(yè)的生存和發(fā)展。AHV-1抗原或抗體檢測(cè)對(duì)其防治很關(guān)鍵。抗體檢測(cè)的主要方法有瓊脂凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)、中和試驗(yàn)(neutralizat1n test,NT)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linkedimmunosorbent assay, ELISA)測(cè)定法。其中,ELISA法廣泛用于AHV-1抗體檢測(cè),可用于大批鴨群和鵝群抗體水平的監(jiān)測(cè)以及基層單位檢疫。但是，以往的ELISA方法使用全病毒作為包被抗原，全病毒抗原純度有限、穩(wěn)定性差、難以標(biāo)準(zhǔn)化，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，且操作費(fèi)時(shí)費(fèi)力，進(jìn)一步限制了該方法的大規(guī)模應(yīng)用，因此，一種新型抗原的制備方法對(duì)建立特異敏感的檢測(cè)方法從而防控AHV-1感染顯得尤為重要。同樣,抗原檢測(cè)方法有中和試驗(yàn)、免疫熒光等，但檢測(cè)試劑也涉及到特異性強(qiáng)的抗體且抗體(無論單抗還是多抗)的制備同樣涉及到病毒抗原純化的困難。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種AHV-1UL7截短重組蛋白，其具有與天然UL7蛋白相似的免疫反應(yīng)活性，能夠與AHV-1抗體特異性結(jié)合；目的之二在于提供該UL7截短重組蛋白的制備方法；目的之三在于提供該UL7截短重組蛋白在制備檢測(cè)試劑中的應(yīng)用；目的之四在于提供該UL7截短重組蛋白的多克隆抗體；目的之五在于提供該UL7截短重組蛋白的多克隆抗體在制備檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。
[0004]經(jīng)研究，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
[0005]1.鴨皰疹病毒I型UL7截短重組蛋白，氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0006]2.鴨皰疹病毒I型UL7截短重組蛋白的編碼基因。
[0007]進(jìn)一步，所述編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0008]3.含有所述編碼基因的重組表達(dá)載體。
[0009]4.含有所述重組表達(dá)載體的工程菌。
[0010]進(jìn)一步，所述工程菌是將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21pLysS中而得到，所述重組表達(dá)載體是將核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示的鴨皰疹病毒I型UL7截短重組蛋白的編碼基因克隆入原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)中而得到。
[0011]5.利用所述工程菌制備鴨皰疹病毒I型UL7截短重組蛋白的方法，包括以下步驟:將工程菌接入含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至0D_達(dá)0.6，加入IPTG至終濃度為0.3mmol，37°C誘導(dǎo)培養(yǎng)3小時(shí)，收集菌液，離心，沉淀用20mmol pH8.0的Tris-HCl緩沖液懸浮，加入溶菌酶至終濃度為lmg/mL，置_20°C過夜后，在冰浴條件下超聲波間歇破碎菌體，離心，沉淀洗滌后，用8mol/L尿素溶液溶解，經(jīng)孔徑0.45 μ m的微孔濾膜過濾，透析復(fù)性，即得鴨皰疹病毒I型UL7截短重組蛋白。
[0012]6.鴨皰疹病毒I型UL7截短重組蛋白的多克隆抗體。
[0013]7.鴨皰疹病毒I型UL7截短重組蛋白在制備檢測(cè)鴨皰疹病毒I型抗體的試劑中的應(yīng)用。
[0014]8.鴨皰疹病毒I型UL7截短重組蛋白的多克隆抗體在制備檢測(cè)鴨皰疹病毒I型抗原和/或UL7蛋白在鴨皰疹病毒I型感染宿主細(xì)胞中的定位和分布的試劑中的應(yīng)用。
[0015]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明選取AHV-1UL7基因編碼蛋白的主要抗原域(laa_240aa)，利用原核表達(dá)系統(tǒng)成功制得了 AHV-1UL7截短重組蛋白，該截短重組蛋白具有與天然AHV-1UL7蛋白相似的免疫反應(yīng)活性，能夠與AHV-1抗體特異性結(jié)合，可作為檢測(cè)AHV-1抗體的試劑應(yīng)用，由于該截短重組蛋白非全細(xì)菌，應(yīng)用其進(jìn)行檢測(cè)時(shí)無散毒危險(xiǎn)，且該截短重組蛋白的制備方法簡(jiǎn)單，適于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)化，利于不同實(shí)驗(yàn)室之間的結(jié)果比較。此外，本發(fā)明還通過動(dòng)物免疫制備了 AHV-1UL7截短重組蛋白的多克隆抗體，該多克隆抗體可作為檢測(cè)AHV-1抗原的試劑應(yīng)用且具有特異性，與鴨肝炎病毒、雛鵝新型腸炎病毒不產(chǎn)生交叉反應(yīng)，還可以作為檢測(cè)UL7蛋白在AHV-1感染宿主細(xì)胞中的定位和分布的試劑應(yīng)用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖進(jìn)行說明:
[0017]圖1為UL7截短基因(下文中簡(jiǎn)稱為UL7M基因)PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。其中I為UL7M基因PCR產(chǎn)物，箭頭所指處為UL7M片段；M為DNA Marker DL2000。
[0018]圖2為克隆質(zhì)粒pMD20-T-UL7M的酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖。其中M為DNAMarker DL15000 ；1為pMD20_T_UL7M用BamHI和XhoI雙酶切后的產(chǎn)物，箭頭所指處為UL7M片段。
[0019]圖3為重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a_UL7M的構(gòu)建示意圖。
[0020]圖4為重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a_UL7M的酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖。其中M為DNAMarker DL15000 ；1為pET32a_UL7M用BamHI和XhoI雙酶切后的產(chǎn)物，箭頭所指處為UL7M片段。
[0021]圖5為不同誘導(dǎo)溫度條件下重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a_UL7M轉(zhuǎn)化菌株表達(dá)AHV-1UL7截短重組蛋白(下文中簡(jiǎn)稱為UL7M重組蛋白)的SDS-PAGE電泳圖。其中M為蛋白Marker ;I為空載體pET-32a(+)轉(zhuǎn)化菌株未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)；2為pET32a_UL7M轉(zhuǎn)化菌株未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)；3和4分別為pET32a-UL7M轉(zhuǎn)化菌株在37°C經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后超聲破碎菌體、離心所得的上清與沉淀；5和6分別為pET32a-UL7M轉(zhuǎn)化菌株在30°C經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后超聲破碎菌體、離心所得的上清與沉淀；7和8分別為pET32a-UL7M轉(zhuǎn)化菌株在25°C經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后超聲破碎菌體、離心所得的上清與沉淀；箭頭所指處為UL7M重組蛋白。
[0022]圖6為不同IPTG濃度條件下重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-UL7M轉(zhuǎn)化菌株表達(dá)AHV-1UL7M重組蛋白的SDS-PAGE電泳圖。其中M為蛋白Marker ;1_9的IPTG終濃度依次為0、0.1、
0.2,0.3,0.4,0.5,0.7、1.0、1.3mmol/L ;箭頭所指處為 UL7M 重組蛋白。
[0023]圖7為不同誘導(dǎo)時(shí)間條件下重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a_UL7M轉(zhuǎn)化菌株表達(dá)AHV-1UL7M重組蛋白的SDS-PAGE電泳圖。其中M為蛋白Marker ;1_9的誘導(dǎo)時(shí)間依次為8、7、6、5、4、
3、2、1、0小時(shí)；箭頭所指處為UL7M重組蛋白。
[0024]圖8為AHV-1UL7M重組蛋白純化的SDS-PAGE電泳圖。其中，M為蛋白Marker ；1為經(jīng)2mol/L尿素洗漆3次后得到的純化的AHV-1UL7M重組蛋白，箭頭所指示處為UL7M重組蛋白。
[0025]圖9為瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)AHV-1UL7M重組蛋白多克隆抗血清的效價(jià)。其中，O為純化的AHV-1UL7M重組蛋白；1為陰性血清；2為2倍稀釋的抗血清；3為4倍稀釋的抗血清；4為8倍稀釋的抗血清；5為16倍稀釋的抗血清；6為32倍稀釋的抗血清。
[0026]圖10為AHV-1UL7M重組蛋白多克隆抗體IgG的純化。其中，M為蛋白Marker ;I為過柱純化產(chǎn)物；2為硫酸銨粗提產(chǎn)物。
[0027]圖11為AHV-1UL7M重組蛋白檢測(cè)AHV-1抗體。其中，M為預(yù)染蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量；
1、2為AHV-1UL7M重組蛋白檢測(cè)AHV-1陽性血清結(jié)果；3為AHV-1UL7M重組蛋白檢測(cè)陰性血清結(jié)果；箭頭所指處為UL7M重組蛋白的檢測(cè)印跡位置。
[0028]圖12為AHV-1UL7M重組蛋白多克隆抗體檢測(cè)AHV-1抗原。其中，A為陰性對(duì)照；B為陽性對(duì)照；C為特異性對(duì)照；D為實(shí)驗(yàn)組。
[0029]圖13為AHV-1UL7M重組蛋白多克隆抗體檢測(cè)UL7蛋白在AHV-1感染宿主細(xì)胞中的定位和分布。其中，A-1分別為感染AHV-1后0、2、4、8、12、24、36、48和60小時(shí)的DEF。

【具體實(shí)施方式】
[0030]下面將結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照試劑制造廠商所建議的條件進(jìn)行。
[0031 ] 主要材料:AHV-lCHv株、基因工程菌DH5 α、大腸桿菌BL21pLysS和表達(dá)載體pET-32a(+)均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病研究中心提供；pMD20-T克隆載體由大連寶生物公司提供。10日齡鴨胚，其種鴨AHV-1和抗體均為陰性。
[0032]實(shí)施例1、AHV-1UL7M重組蛋白的制備
[0033]本發(fā)明擬制備的AHV-1UL7M重組蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示(即登錄號(hào)為AFC61876的AHV-1UL7第I位至第241位氨基酸序列)，其編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示(即登錄號(hào)為FJ222445的AHV-1UL7基因第I位至第723位核苷酸序列)。
[0034]一、AHV-1UL7M 基因的克隆
[0035]1、引物的設(shè)計(jì)
[0036]根據(jù)AHV-1UL7M基因序列設(shè)計(jì)如下引物:上游引物AHV_1_UL7M F:5’ -ggatccatgga-tatgaaccagagc-3’ (SEQ ID N0.3，劃線部分為 BamHI 酶切位點(diǎn))；下游引物 AHV-1-UL7MR:5’ -ctcgagtattgcatgattaggtag-3’ (SEQ ID N0.4,劃線部分為 XhoI 酶切位點(diǎn))。
[0037]上述引物委托大連寶生物公司合成后，用滅菌去離子水稀釋至終濃度為1pmol/μ L, _20°C保存。
[0038]2、AHV-1基因組DNA的提取
[0039](I)鴨胚成纖維細(xì)胞(DEF)的制備
[0040]取10日齡健康鴨胚，將蛋殼表面用37°C的0.1%新潔爾滅清洗后，用去離子水沖洗干凈，晾干，再依次用5%碘酒和75%酒精消毒；無菌操作條件下取出胚體，用PBS洗凈后,剪去頭、翅、腿和內(nèi)臟,剩余胚體剪成約Imm大小的小塊，置加有玻璃小珠的三角瓶?jī)?nèi)，加入PBS及細(xì)胞分散劑，37°C水浴消化Imin ;所得細(xì)胞懸液以5000r/min離心5min，棄上清，細(xì)胞沉淀懸浮于適量MEM后，用8層紗布過濾，濾液加10%小牛血清和100IU/mL雙抗后分裝于10mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每瓶7mL，置37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36h，至DEF長(zhǎng)成致密的細(xì)胞單層。
[0041](2) AHV-1細(xì)胞種毒液的制備
[0042]取接種AHV-1CHv后出現(xiàn)75%細(xì)胞病變的DEF，用橡皮刮將細(xì)胞從瓶底刮下并用加有細(xì)石英砂的玻璃勻漿器充分勻漿，勻漿液于4°C、8000r/min離心10min，取上清作為AHV-1細(xì)胞種毒液。
[0043](3) AHV-1基因組DNA的提取
[0044]取前述剛剛長(zhǎng)成致密細(xì)胞單層的DEF，用滅菌PBS清洗細(xì)胞2次后，加入AHV-1細(xì)胞種毒液，3 7 °C吸附2h，棄去AHV-1細(xì)胞種毒液，用含2 %小牛血清和1 OI U/mL雙抗的MEM維持營(yíng)養(yǎng)液于37°C培養(yǎng)；至80%細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)，將細(xì)胞混懸液反復(fù)凍融3次后，取 0.5mL,加入消化緩沖液(10mmoI/L Tris-HCl，ρΗ8.0 ； 10mmoI/L EDTA ；250mmol/LNaCl)0.5mL和10mg/mL蛋白酶K溶液10uL，37°C消化過夜；蛋白完全消化后得到比較清亮的懸浮液，用等體積的苯酚-氯仿(體積比1:1)混合液和氯仿各抽提I次，取上清，加入2倍體積的冰冷無水乙醇和1/10體積的3mol/L NaAc (pH5.2)，靜置于_20°C冰箱過夜；4°C、16000r/min離心20min沉淀DNA，所得DNA用70%冷乙醇洗滌I次，重懸于TER (含有RNA酶的TE)中，室溫作用1min充分消化RNA，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0045]3、AHV_1UL7M 基因的克隆
[0046]以AHV-1基因組DNA為模板，采用前述上、下游引物PCR擴(kuò)增UL7M基因。PCR反應(yīng)體系為:ddH2014y L，2XPCR mastermix20 μ L,模板 DNA2 μ L, lOpmol/μ L 上、下游引物各2yL，總體積為40 μ L。PCR反應(yīng)參數(shù)為:首先95°C 5min，然后94°C 40s, 58.2 °C 40s、72°C lmin，共30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin, 16°C Ih0取PCR產(chǎn)物，進(jìn)行I %瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果如圖1所示，獲得了一條約729bp的特異性DNA條帶，與目標(biāo)DNA片段大小相符。
[0047]將獲得的AHV-1UL7M基因PCR產(chǎn)物委托大連寶生物公司進(jìn)行T克隆和測(cè)序，構(gòu)建的克隆質(zhì)粒為PMD20-T-UL7M。測(cè)序結(jié)果顯示，克隆所得的AHV-1UL7M基因序列如SEQ IDN0.1所示，與目的DNA片段序列一致。
[0048]二、AHV-1UL7M重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0049]用BamHI和XhoI雙酶切克隆質(zhì)粒pMD20_T_UL7M，結(jié)果如圖2所示，pMD20_T_UL7M雙酶切得到兩條DNA片段，其中DNA小片段與723bp的目的DNA片段大小相符。回收目的DNA片段，與經(jīng)相同酶切的原核表達(dá)載體pET-32a(+)連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，抽提質(zhì)粒，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-UL7M(其構(gòu)建示意圖如圖3所示)。對(duì)pET32a-UL7M進(jìn)行BamHI和XhoI雙酶切鑒定，結(jié)果如圖4所示，pET32a_UL7M經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切后得到兩條DNA片段，其中DNA小片段與723bp的目的DNA片段大小相符。將pET32a-UL7M委托大連寶生物公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示，目的DNA片段序列正確。
[0050]三、AHV-1UL7M重組表達(dá)工程菌的構(gòu)建
[0051]將重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a_UL7M轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21pLysS感受態(tài)細(xì)胞，再隨機(jī)挑取單菌落接種到含有Amp的液體LB培養(yǎng)基中，37°C過夜培養(yǎng)，提取重組表達(dá)質(zhì)粒并進(jìn)行雙酶切鑒定，篩選出含重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-UL7M的BL21pLysS工程菌。
[0052]四、AHV-1UL7M重組表達(dá)工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)
[0053]取含重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a_UL7M的BL2 IpLysS工程菌，同時(shí)以空載體pET_32a(+)轉(zhuǎn)化的BL21pLysS菌株為對(duì)照，以1:100接種于30mL含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，劇烈振蕩培養(yǎng)至0D_達(dá)0.6左右，再加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，收集ImL培養(yǎng)菌液，8000r/min離心lOmin，棄上清，菌體沉淀用5mL20mmol Tris-HCl (pH8.0)懸浮，再加入溶菌酶至終濃度為lmg/mL，置-20°C過夜后，在冰浴條件下超聲間歇破碎菌體(150w2min/次，共3次，每次之間間歇lmin)，8000r/min離心1min,收集上清備用；沉淀用8mol/L尿素溶液ImL溶解備用。取前述備用的上清和用尿素溶液溶解的沉淀各40 μ L，分別加入10 μ L5 X SDS上樣緩沖液，煮沸l(wèi)Omin , 12000r/min離心1min,取上清進(jìn)行DS-PAGE電泳。結(jié)果如圖5所示，含重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-UL7M的BL21pLysS工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)、超聲破碎菌體、離心后得到的沉淀在45kDa處有目的條帶，離心后得到的上清未出現(xiàn)相應(yīng)大小的目的條帶，空載體pET-32a (+)轉(zhuǎn)化的BL2 IpLysS菌株與含重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a_UL7M的BL2 IpLysS工程菌在未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)時(shí)也均未出現(xiàn)相應(yīng)大小的目的條帶，說明AHV-1UL7M重組蛋白以包涵體形式表達(dá)。
[0054]IPTG濃度優(yōu)化:取含重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a_UL7M的BL21pLysS工程菌，以1:100接種于30mL含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，30°C劇烈振蕩培養(yǎng)至0D_約0.6，加入IPTG至不同終濃度(分別為 0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.7,1.0,1.3mmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng) 4h，收集 ImL 培養(yǎng)菌液，按前述方法處理后行SDS-PAGE電泳。結(jié)果如圖6所示，優(yōu)選的IPTG濃度為0.3mmol/L0
[0055]誘導(dǎo)溫度優(yōu)化:取含重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a_UL7M的BL21pLysS工程菌，以1:100接種于30mL含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，于不同溫度(分別為25、30、37°C )劇烈振蕩培養(yǎng)至OD600約0.6，加入IPTG至終濃度為1.0mmol/L,繼續(xù)培養(yǎng)4h，收集ImL培養(yǎng)菌液，按前述方法處理后行SDS-PAGE電泳。結(jié)果如圖5所示，優(yōu)選的誘導(dǎo)溫度為37°C。
[0056]誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化:取含重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a_UL7M的BL21pLysS工程菌，以1:100接種于30mL含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37°C劇烈振蕩培養(yǎng)至OD6tltl約0.6，加入IPTG至終濃度為0.5mmol/L,分別繼續(xù)培養(yǎng)不同時(shí)間(分別為O、l、2、3、4、5、6、7、8h)，收集ImL培養(yǎng)菌液，按前述方法處理后行SDS-PAGE電泳。結(jié)果如圖7所示，優(yōu)選的誘導(dǎo)時(shí)間為3h。
[0057]五、AHV-1UL7M重組蛋白的大量表達(dá)與純化
[0058]取優(yōu)化條件下誘導(dǎo)表達(dá)獲得的BL21pLysS工程菌液lOOOmL，4°C、8000r/min離心1min,菌體沉淀用40mL20mmol Tris-HCl (pH8.0)懸浮,再加入溶菌酶至終濃度為lmg/mL,置_20°C過夜后，在冰浴條件下超聲間歇破碎菌體(150w2min/次，共3次，每次之間間歇lmin), 4°C、8000r/min 離心 lOmin,沉淀用 40mL 洗液(1 Ommol /T, PBS+2mol/L 尿素+0.1 %Triton X-100)離心洗漆(4 °C、8000r/min 離心 1min) 3 次后，用尿素溶液(10mmol/LPBS+8mol/L尿素)溶解，經(jīng)孔徑0.45 μ m的微孔濾膜過濾后，SDS-PAGE檢測(cè)純化效果。結(jié)果如圖8所示,AHV-1UL7M重組蛋白是以包涵體形式存在,通過低濃度的尿素洗漆包涵體可以獲得純化的AHV-1UL7M重組蛋白。
[0059]將純化的AHV-1UL7M重組蛋白透析復(fù)性后，用Bradford法測(cè)定蛋白濃度，稀釋至lmg/mL,分裝備用。
[0060]實(shí)施例2、AHV-1UL7M重組蛋白多克隆抗體的制備與純化
[0061]一、動(dòng)物免疫及AHV-1UL7M重組蛋白多克隆抗血清的制備
[0062]以純化的AHV-1UL7M重組蛋白為抗原，將其與等量的弗氏完全佐劑(購于Sigma公司)混合，劇烈振蕩使抗原充分乳化，獲得油包水的乳劑苗A。取健康雄性家兔4只，耳動(dòng)脈采血2mL，分離血清作為陰性對(duì)照，然后每只兔皮內(nèi)注射乳劑苗A(AHV-1UL7M重組蛋白量為0.6mg)進(jìn)行一免；一免兩周后，將純化的AHV-1UL7M重組蛋白與等量的弗氏不完全佐劑(由羊毛脂與液體石蠟按體積比1:4混合而成)混合，劇烈振蕩使抗原充分乳化，獲得油包水的乳劑苗B，然后每只兔皮下注射乳劑苗B(AHV-1UL7M重組蛋白量為0.8mg)進(jìn)行二免；二免一周后，每只兔皮下注射乳劑苗B(AHV-1UL7M重組蛋白量為l.0mg)進(jìn)行三免；三免一周后，直接兔耳源靜脈注射純化的AHV-1UL7M重組蛋白0.4mg/只進(jìn)行四免。四免后10天，收集兔血，37°C放置30min，4°C放置過夜，收集血清，分裝備用。
[0063]二、AHV-1UL7M 重組蛋白多克隆抗血清的效價(jià)測(cè)定
[0064]將10mL0.85被％生理鹽水加入到Ig瓊脂糖中，煮沸，待溫度降至56 °C時(shí)轉(zhuǎn)移至平板中，深度約1.5mm,凝固后打孔(孔直徑3mm,孔間距I~1.2cm);將10 μ L純化的AHV-1UL7M重組蛋白液加入中心孔，周圍每孔加入10 μ L倍比稀釋的AHV-1UL7M重組蛋白多克隆抗血清(分別按體積比1:2、1:4、1:8、1:16、1:32稀釋)，以免疫前的正常兔血清作為陰性對(duì)照；將加樣后的凝膠板置水平濕盒內(nèi)，37°C恒溫培養(yǎng)，12h后取出，置黑色背景觀察結(jié)果并照相。抗血清效價(jià)檢測(cè)結(jié)果如圖9所示，未經(jīng)AHV-1UL7M重組蛋白免疫的陰性兔血清沒有形成沉淀線，而四免10天后倍比稀釋的兔血清可見明顯的沉淀線，所得AHV-1UL7M重組蛋白多克隆抗血清的效價(jià)為1:16。
[0065]三、AHV-1UL7M重組蛋白多克隆抗體的純化
[0066]采用飽和硫酸銨法從AHV-1UL7M重組蛋白多克隆抗血清中粗提AHV-1UL7M重組蛋白多克隆抗體IgG，然后用High-Q陰離子交換柱過柱純化，結(jié)果獲得了純度較高的AHV-1UL7M重組蛋白多克隆抗體IgG (圖10)。
[0067]實(shí)施例3、AHV-1UL7M重組蛋白檢測(cè)AHV-1抗體
[0068]取含重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a_UL7M的BL21pLysS工程菌的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳，同時(shí)設(shè)置空載體pET-32a(+)轉(zhuǎn)化的BL21pLysS菌株的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物為對(duì)照；電泳結(jié)束后將蛋白質(zhì)樣品從PAGE凝膠中經(jīng)濕轉(zhuǎn)方法轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，將所得PVDF膜置平皿中，加入1mL含3% BSA的TBST，37°C輕搖Ih進(jìn)行膜封閉，TBST洗膜3次，再加入用含0.5% BSA的TBST稀釋的兔抗AHV-1血清或正常兔血清作為一抗，4°C過夜孵育，棄一抗，TBST洗膜3次，再加入1mL按體積比1:5000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗，37 °C孵育Ih，TBST洗膜3次，DAB顯色。結(jié)果顯示含重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a_UL7M的BL2IpLysS工程菌的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物對(duì)兔抗AHV-1血清的印跡在約45kDa處出現(xiàn)一條清晰的特異條帶，而空載體pET-32a(+)轉(zhuǎn)化的BL21pLysS菌株的IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)物對(duì)兔抗AHV-1血清的印跡及含重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-UL7M的BL21pLysS工程菌的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物對(duì)正常兔血清的印跡沒有出現(xiàn)任何條帶，說明AHV-1UL7M重組蛋白反應(yīng)原性好，可以用于制備AHV-1抗體的檢測(cè)試劑(圖11)。
[0069]實(shí)施例4、AHV-1UL7M重組蛋白多克隆抗體檢測(cè)AHV-1抗原
[0070]將DEF接種至預(yù)先放有飛片的6孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后棄去培養(yǎng)液，接種AHV-1，待出現(xiàn)細(xì)胞病變后收獲飛片，PBS清洗3次，用4%甲醛于4°C固定30min，PBST清洗3次，
0.2% Triton X-100透化10min，PBST清洗3次，3% BSA室溫封閉lh，PBST清洗3次，再加入按體積比1:100稀釋的實(shí)施例2制備的兔抗AHV-1UL7M重組蛋白多克隆抗體IgG，4°C孵育過夜，PBST清洗3次，再加入按體積比1:150稀釋的FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG，37°C孵育lh，PBST清洗3次，再加入DAPI染色液，室溫避光5min，PBS洗滌3次，甘油封片，鏡檢。同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照(DEF不接種AHV-1)、替代對(duì)照(用正常兔血清IgG替代兔抗AHV-1UL7M重組蛋白多克隆抗體IgG，同時(shí)用3% BSA替代FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG)、陽性對(duì)照(用兔抗AHV-1血清IgG替代兔抗AHV-1UL7M重組蛋白多克隆抗體IgG)和特異性對(duì)照(鴨肝炎病毒、雛鵝新型腸炎病毒接種DEF)。結(jié)果如圖12所示，陰性對(duì)照、替代對(duì)照和特異性對(duì)照的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，陽性對(duì)照的檢測(cè)結(jié)果為陽性，實(shí)驗(yàn)組的檢測(cè)結(jié)果為陽性，說明AHV-1UL7M重組蛋白多克隆抗體可以用于制備AHV-1抗原檢測(cè)試劑且具有特異性。 [0071 ] 實(shí)施例5、AHV-1UL7M重組蛋白多克隆抗體檢測(cè)UL7蛋白在AHV-1感染宿主細(xì)胞中的定位和分布
[0072]將DEF接種至預(yù)先放有飛片的6孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后棄去培養(yǎng)液，接種AHV-1，于病毒感染后不同時(shí)間收獲飛片，按實(shí)施例4所述間接免疫熒光法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如圖13所示，在AHV-1感染后8-60h可觀察到綠色的陽性熒光(圖13D~131):在感染后8h初步觀察到在細(xì)胞質(zhì)中有特異性的綠色熒光(圖13D);在感染后12h檢測(cè)到細(xì)胞質(zhì)中特異性的綠色熒光增多(圖13E);在感染后48h檢測(cè)到細(xì)胞質(zhì)中特異性的綠色熒光亮度達(dá)到最強(qiáng)(圖13H);在感染后60h約80% DEF脫落，檢測(cè)到細(xì)胞質(zhì)中特異性的綠色熒光呈彌散存在且強(qiáng)度較弱(圖131);說明AHV-1UL7M重組蛋白多克隆抗體可以用于制備檢測(cè)UL7蛋白在AHV-1感染宿主細(xì)胞中定位和分布的試劑。
[0073]最后說明的是，以上優(yōu)選實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過上述優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。
【權(quán)利要求】
1.鴨皰疹病毒I型UL7截短重組蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQID N0.2所示。
2.權(quán)利要求1所述的鴨皰疹病毒I型UL7截短重組蛋白的編碼基因。
3.如權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQID N0.1所示。
4.含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的重組表達(dá)載體。
5.含有權(quán)利要求4所述重組表達(dá)載體的工程菌。
6.如權(quán)利要求5所述的工程菌，其特征在于，是將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21pLysS中而得到，所述重組表達(dá)載體是將核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示的鴨皰疹病毒I型UL7截短重組蛋白的編碼基因克隆入原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)中而得到。
7.利用權(quán)利要求6所述工程菌制備鴨皰疹病毒I型UL7截短重組蛋白的方法，其特征在于，包括以下步驟:將工程菌接入含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)0.6，加入IPTG至終濃度為0.3mmol，37°C誘導(dǎo)培養(yǎng)3小時(shí)，收集菌液，離心，沉淀用20mmol pH8.0的Tris-HCl緩沖液懸浮，加入溶菌酶至終濃度為lmg/mL，置_20°C過夜后，在冰浴條件下超聲波間歇破碎菌體，離心，沉淀洗滌后，用8mol/L尿素溶液溶解，經(jīng)孔徑0.45 μ m的微孔濾膜過濾，透析復(fù)性，即得鴨皰疹病毒I型UL7截短重組蛋白。
8.權(quán)利要求1所述的鴨皰疹病毒I型UL7截短重組蛋白的多克隆抗體。
9.權(quán)利要求1所述的鴨皰疹病毒I型UL7截短重組蛋白在制備檢測(cè)鴨皰疹病毒I型抗體的試劑中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求8所述的鴨皰疹病毒I型UL7截短重組蛋白的多克隆抗體在制備檢測(cè)鴨皰疹病毒I型抗原和/或UL7蛋白在鴨皰疹病毒I型感染宿主細(xì)胞中的定位和分布的試劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK104072591SQ201410347473
【公開日】2014年10月1日 申請(qǐng)日期:2014年7月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月21日
【發(fā)明者】汪銘書, 程安春, 黃杰, 賈仁勇, 楊喬, 孫昆峰, 陳舜, 劉馬蜂, 朱德康, 陳孝躍 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)