用于幽門螺桿菌23S rDNA基因突變分型的ARMS-qPCR的檢測方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明公開了用于幽門螺桿菌23S?rDNA基因突變分型的ARMS-qPCR的檢測方法及試劑盒。本發明提供了用于鑒定幽門螺桿菌23S?rDNA基因型的DNA分子組合物，包括單獨使用的DNA分子組合物A和DNA分子組合物B；本發明的實驗證明，本發明設計的引物及其構成的試劑盒能快速、準確、高敏感度的檢測胃粘膜組織中幽門螺桿菌23SrDNA基因特定位點突變。靈敏度高，不僅可以檢測來源于胃粘膜活檢組織，還可以檢測石蠟包埋組織切片中游離DNA。
【專利說明】用于幽門螺桿菌23S rDNA基因突變分型的ARMS-qPCR的檢測方法及試劑盒

【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，尤其涉及用于幽門螺桿菌23S rDNA基因突變分型的ARMS-qPCR的檢測方法及試劑盒。

【背景技術】
[0002]幽門螺桿菌(Helicobaeter pylori, Hp)是一種常見的可長期定植于人類胃黏膜的革蘭陰性微需氧桿菌，與許多上消化道疾病有著緊密的聯系。全世界有超過半數的人感染Hp，而在我國的感染率為55%。Hp的感染給患者造成極大的痛苦，加重醫療負擔。WHO把Hp列為同乙型、丙型肝炎一樣，都是生物致癌物。以質子泵抑制劑(proton pumpinhibitor, PPI)結合阿莫西林和克拉霉素(或者甲硝唑)的三聯療法，是國內外公認的一線抗Hp感染治療組合。克拉霉素屬于大環內酯類抗生素，在體外有強大的殺菌作用，口服生物利用度高，對酸穩定。克拉霉素的抗菌機制是藥物穿入菌體細胞內，與核糖體緊密結合，作用于23S rDNA V功能區的多肽轉移環，抑制多肽轉移酶，影響核糖體的位移過程，阻止肽鏈延長，從而抑制細菌的蛋白質合成。然而，由于克拉素的耐藥的不斷上升，一線療法的成功率正在逐漸的下降。
[0003]細菌的耐藥可分為原發性耐藥和繼發性耐藥。原發性耐藥是由于細菌缺少對藥物敏感的靶位，或細菌具有天然屏障使藥物無法進入菌體，繼發性耐藥是指由于抗生素的廣泛使用，細菌獲得耐藥基因，從敏感菌株變成耐藥菌株。一般認為幽門螺桿菌的耐藥多為繼發性耐藥。幽門螺桿菌對克拉霉素的耐藥機制有以下幾種:l、rDNA甲基化酶引起克拉霉素失活；2、細胞膜滲透性下降使進入細菌的藥物減少；3、克拉霉素排出增加；4、基因突變:主要為幽門螺桿菌23S rDNA的V區發生點突變，導致核糖體變構，克拉霉素的結合位點發生改變，使幽門螺桿菌與克拉霉素的親合力減弱，不能阻止細菌的蛋白合成產生耐藥。綜合以上幾點，國內外學者普遍認為幽門螺桿菌對克拉霉素耐藥的主要機制是23S rDNA基因突變所致，其余的機制相對作用較弱。1997年Taylor等人研究證實位于在23S rDNA基因的結構域V中編碼的肽基轉移酶區的第2142位(其中腺嘌呤核苷酸被胞嘧啶或被鳥嘌呤取代)，或第2143位(其中腺嘌呤被鳥嘌呤取代)的3個點突變，這些突變在此微生物中與克拉霉素抗性機理密切相關。各國學者也一致發現克拉霉素耐藥的幽門螺桿菌菌株的23SrDNA基因的突變最常出現為A2143G、A2142G、A2142C的突變，也有報道發現G2115A、T2182C突變。Raymond等對法國138株克拉霉素耐藥株研究發現:A2143G、A2142G和A2142C的突變率分別占81.9%、14.5%和3.6%。另外，Liu等對北京65株克拉霉素耐藥株研究顯示:A2143G、A2142G 和 A2142C 的突變率分別占 84.6%,6.2%和 1.5%0 因此，檢測 Hp23SrDNA中A2143G、A2142G和A2142C突變，可以檢測到中國90%以上的克拉霉素耐藥Hp株。所以，Hp菌株23rDNA中的A2143G、A2142G和A2142C型突變可以作為國內檢測Hp克拉霉素耐藥的靶點。
[0004]用于克拉霉素耐藥檢測的方法很多，包括如藥物敏感性試驗、DNA直接測序、限制性片段長度多態性分析(RFLP-PCR)、熒光定量PCR法等。其中藥敏實驗為耐藥檢測的金標準，但此類方法是建立在細菌培養基礎上，其缺點為細菌培養時間長，培養要求較高，臨床上比較難做到。近年來，熒光定量PCR以其快速簡便、特異性好、靈敏度高、可定量、有效解決PCR污染問題及自動化程度高等優點，在醫學領域、微生物、動植物疾病檢疫方面得到了廣泛的應用。
[0005]擴增阻礙突變系統(amplificat1nrefractory mutat1n system ARMS)于 1989年建立，用于對已知突變基因進行檢測。該法通過設計突變ARMS引物，其3’末端堿基與待檢測突變型的突變堿基匹配，用于特異性擴增突變模板。ARMS的檢測靈敏度依賴于ARMS引物的特異性和反應條件如酶，鎂離子濃度等的優化。為了增加引物的特異性，減少引物與靶DNA有錯配時的錯配延伸，可通過在引物3’端的第2-3個堿基引入另外一個或者兩個錯配堿基，使之與模板之間形成多重錯配以阻止錯誤延伸。
[0006]ARMS-qPCR技術基于Real-time PCR平臺，結合ARMS突變富集和Taqman特異性熒光檢測兩種技術。利用ARMS引物對突變靶序列進行PCR擴增，Taqman探針對擴增產物進行特異性位點檢測，在Real-time PCR基礎上鑒定特定突變。
[0007]鎖核酸(locked nucleic acid，LNA)是一種新型的寡核酸衍生物，結構中B-D-呋喃核糖的2-0，4C位通過縮水作用形成環形的氧亞甲基橋、硫亞甲基橋或胺亞甲基橋，呋喃糖的結構鎖定在C3內型的N構型，形成了剛性的縮合結構。LNA作為一種新的反義核酸，具有與DNA/RNA強大的雜交親和力、反義活性、抗核酸酶能力、水溶性好及體內無毒性等優點。其能夠與DNA和RNA特異性地結合從而可以制備LNA探針，與DNA探針相比，其雜交的穩定性和特異性增加，可大大提高基因診斷的效率和靈敏度。


【發明內容】

[0008]本發明的一個目的是提供用于鑒定幽門螺桿菌23S rDNA是否含有突變位點ARMS-qPCR的引物組。
[0009]本發明提供的引物組，為如下I)或2):
[0010]I)由單獨使用的23S rDNA的A2143G突變型的ARMS引物、23S rDNA的A2142G突變型的ARMS引物和23S rDNA的A2142C突變型的ARMS引物組成；
[0011]2)由 23S rDNA 的 A2143G 突變型的 ARMS 引物、23S rDNA 的 A2142G 突變型的 ARMS引物和23S rDNA的A2142C突變型的ARMS引物組成；
[0012]所述23S rDNA的A2143G突變型的ARMS引物的核苷酸序列為序列表中序列3 ；
[0013]所述23S rDNA的A2142G突變型的ARMS引物的核苷酸序列為序列表中序列4 ；
[0014]所述23S rDNA的A2142C突變型的ARMS引物的核苷酸序列為序列表中序列5。
[0015]本發明的一個目的是提供用于鑒定幽門螺桿菌23S rDNA是否含有突變位點ARMS-qPCR的DNA分子組合物。
[0016]本發明提供的DNA分子組合物，為如下I)或2):
[0017]I)所示的DNA分子組合物包括單獨使用的DNA分子組合物A、DNA分子組合物B和DNA分子組合物C ；
[0018]所述DNA分子組合物A由鎖核酸阻滯探針、通用TaqMan探針、PCR通用下游引物和23S rDNA的A2143G突變型的ARMS引物組成；
[0019]所述DNA分子組合物B由鎖核酸阻滯探針、通用TaqMan探針、PCR通用下游引物和23S rDNA的A2142G突變型的ARMS引物組成；
[0020]所述DNA分子組合物C由鎖核酸阻滯探針、通用TaqMan探針、PCR通用下游引物和23S rDNA的A2142C突變型的ARMS引物組成；
[0021]2)所示的DNA分子組合物E由鎖核酸阻滯探針、通用TaqMan探針、PCR通用下游引物、23S rDNA的A2143G突變型的ARMS引物、23S rDNA的A2142G突變型的ARMS引物和23S rDNA的A2142C突變型的ARMS引物組成；
[0022]所述鎖核酸阻滯探針的核苷酸序列為序列表中序列I ;
[0023]所述通用TaqMan探針的核苷酸序列為序列表中序列2 ；
[0024]所述23S rDNA的A2143G突變型的ARMS引物的核苷酸序列為序列表中序列3 ；
[0025]所述23S rDNA的A2142G突變型的ARMS引物的核苷酸序列為序列表中序列4 ；
[0026]所述23S rDNA的A2142C突變型的ARMS引物的核苷酸序列為序列表中序列5 ；
[0027]所述PCR通用下游引物的核苷酸序列為序列表中序列7。
[0028]上述的DNA分子組合物還包括所述DNA分子組合物D ；
[0029]所述DNA分子組合物D由所述鎖核酸阻滯探針、所述通用TaqMan探針、所述PCR通用下游引物和內控引物組成；
[0030]所述內控引物的核苷酸序列為序列表中序列6。
[0031]所述突變位點為A2143G、A2142G 或 A2142C。
[0032]幽門螺桿菌23S rDNA野生型基因的核苷酸序列為序列表中的序列8 ；
[0033]幽門螺桿菌23S rDNA的A2143G突變位點為序列表中的序列8自5’末端第97位的A突變為G ；
[0034]幽門螺桿菌23S rDNA的A2142G突變位點為序列表中的序列8自5’末端第96位的A突變為G ；
[0035]幽門螺桿菌23S rDNA的A2142C突變位點為序列表中的序列8自5’末端第96位的A突變為C ；
[0036]上述的DNA分子組合物中，所述DNA分子組合物A中，所述鎖核酸阻滯探針、所述通用TaqMan探針、所述PCR通用下游引物、所述23S rDNA的A2143G突變型的ARMS引物的摩爾比為4:2:5:5 ；
[0037]所述DNA分子組合物B中，所述鎖核酸阻滯探針、所述通用TaqMan探針、所述PCR通用下游引物、所述23S rDNA的A2142G突變型的ARMS引物的摩爾比為4:2:5:5 ；
[0038]所述DNA分子組合物C中，所述鎖核酸阻滯探針、所述通用TaqMan探針、所述PCR通用下游引物、所述23S rDNA的A2142C突變型的ARMS引物的摩爾比為4:2:5:5 ；
[0039]所述DNA分子組合物D中，所述鎖核酸阻滯探針、所述通用TaqMan探針、所述PCR通用下游引物、所述內控引物的摩爾比為4:2:5:5。
[0040]本發明的第二個目的是提供用于鑒定幽門螺桿菌23S rDNA基因型的ARMS-qPCR的PCR試劑。
[0041]本發明提供的PCR試劑，為I)或2):
[0042]I)所示的PCR試劑包括PCR試劑A、PCR試劑B和PCR試劑C組成；
[0043]所述PCR試劑A由PCR擴增反應液、所述DNA分子組合物A和水組成；
[0044]所述PCR試劑B由PCR擴增反應液、所述DNA分子組合物B和水組成；
[0045]所述PCR試劑C由PCR擴增反應液、所述DNA分子組合物C和水組成；
[0046]所述鎖核酸阻滯探針、所述通用TaqMan探針、所述PCR通用下游引物、所述23SrDNA的A2143G突變型的ARMS引物在所述PCR試劑A中的終濃度分別依次為:0.4 μ M、0.2 μ Μ、0.5 μ Μ、0.5 μ M ；
[0047]所述鎖核酸阻滯探針、所述通用TaqMan探針、所述PCR通用下游引物、所述23SrDNA的A2142G突變型的ARMS引物在所述PCR試劑B中的終濃度分別依次為:0.4 μ M、0.2 μ Μ、0.5 μ Μ、0.5 μ M ；
[0048]所述鎖核酸阻滯探針、所述通用TaqMan探針、所述PCR通用下游引物、所述23SrDNA的A2142C突變型的ARMS引物在所述PCR試劑C中的終濃度分別依次為:0.4 μ M、0.2 μ Μ、0.5 μ Μ、0.5 μ Μ。
[0049]2)所示的PCR試劑為PCR試劑Ε，其由PCR擴增緩沖液、2)所示的DNA分子組合物和水組成。
[0050]上述所述I)所示的PCR試劑或所述2)所示的PCR試劑均還包括PCR試劑D ；[0051 ] 所述PCR試劑D由PCR擴增緩沖液、所述DNA分子組合物D和水組成；
[0052]所述鎖核酸阻滯探針、所述通用TaqMan探針、所述PCR通用下游引物、所述內控引物在所述PCR試劑D 中的終濃度分別依次為:0.4 μ Μ、0.2 μ Μ、0.5 μ Μ、0.5 μ M0
[0053]所述突變位點為A2143G、A2142G 或 A2142C。
[0054]在反應體系中，上述23S rDNA的A2143G突變型的ARMS引物、23S rDNA的A2142G突變型的ARMS引物23S rDNA的A2142C突變型的ARMS引物為等摩爾比；在本發明的實施例中其終濃度均為0.25 μ M0
[0055]本發明的第三個目的是提供用于鑒定幽門螺桿菌23S rDNA基因型的ARMS-qPCR的PCR試劑盒。
[0056]本發明提供的PCR試劑盒，包括是上述的DNA分子組合物或上述的PCR試劑。
[0057]上述的DNA分子組合物或上述的PCR試劑或上述的PCR試劑盒中，所述突變位點為 A2143G、A2142G 或 A2142C。
[0058]上述的DNA分子組合物或上述的PCR試劑或上述的PCR試劑盒在鑒定或輔助鑒定幽門螺桿菌23S rDNA是否含有突變為位點中的應用或在制備鑒定或輔助鑒定幽門螺桿菌23S rDNA是否含有突變位點產品中的應用也是本發明保護的范圍；
[0059]或上述的DNA分子組合物或上述的PCR試劑或上述的PCR試劑盒在鑒定或輔助鑒定待測樣本中含有的幽門螺桿菌23S rDNA是否含有突變位點中的應用或在制備鑒定或輔助鑒定待測樣本中含有的幽門螺桿菌23S rDNA是否含有突變位點的產品中的應用；
[0060]或上述的DNA分子組合物或上述的PCR試劑或上述的PCR試劑盒在制備鑒定或輔助鑒定含有幽門螺桿菌的待測樣本是否耐克拉霉素中的產品中的應用；
[0061]或上述的DNA分子組合物或上述的PCR試劑或上述的PCR試劑盒在制備鑒定或輔助鑒定待測幽門螺桿菌是否耐克拉霉素中的產品中的應用。
[0062]上述應用中，所述突變位點為A2143G、A2142G或A2142C。
[0063]本發明第四個目的是提供一種鑒定或輔助鑒定待測樣本含有的幽門螺桿菌23SrDNA是否含有突變位點ARMS-qPCR的方法。
[0064]本發明提供的方法，包括如下步驟:
[0065]I)所示的方法包括如下步驟:
[0066]用所述PCR試劑A、所述PCR試劑B、所述PCR試劑C和所述PCR試劑D分別對待測樣本進行ARMS-qPCR，檢測擴增產物；
[0067]若DNA分子組合物D擴增S型曲線且Ct≤32，且DNA分子組合物A擴增S型曲線且其與DNA分子組合物D擴增曲線Λ Ct < 7，則待測樣本中幽門螺桿菌23S rDNA含有或候選含有A2143G突變位點；
[0068]若DNA分子組合物D擴增S型曲線且Ct≤32，且DNA分子組合物B擴增S型曲線且其與DNA分子組合物D擴增曲線Λ Ct < 7，則待測樣本中幽門螺桿菌23S rDNA含有或候選含有A2142G突變位點；
[0069]若DNA分子組合物D擴增S型曲線且Ct≤32，且DNA分子組合物C擴增S型曲線且其與DNA分子組合物D的擴增曲線Λ Ct < 7，則待測樣本中幽門螺桿菌23S rDNA含有或候選含有A2142C突變位點；
[0070]若DNA分子組合物D擴增S型曲線且Ct≤32，且DNA分子組合物A、B和C均無擴增曲線；或DNA分子組合物D擴增S型曲線且Ct≤32，且DNA分子組合物A、B和C的擴增曲線與DNA分子組合物D擴增曲線Λ Ct > 7 ;則待測樣本中幽門螺桿菌23S rDNA不含有或候選不含有突變位點；
[0071]2)所示的方法包括如下步驟:
[0072]用所述PCR試劑E和所述PCR試劑D分別對待測樣本進行ARMS-qPCR，檢測擴增產物；
[0073]若DNA分子組合物D擴增S型曲線且Ct≤32，且DNA分子組合物E有S型擴增曲線且其與DNA分子組合物D的擴增曲線Λ Ct < 7，則待測樣本中幽門螺桿菌23S rDNA含有或候選含有23S rDNA突變位點；
[0074]若DNA分子組合物D擴增S型曲線且Ct≤32，且DNA分子組合物E無S型擴增曲線與DNA分子組合物D的擴增曲線Λ Ct > 7，則待測樣本中幽門螺桿菌23S rDNA不含有或候選不含有23S rDNA突變位點；
[0075]所述突變位點為A2143G、A2142G或A2142C。本發明所使用的探針兩端分別標記熒光報告基團(R)和熒光淬滅基團(Q)的寡核苷酸，為5’端FAM標記的TaqMan探針。在探針完整時，即隨機狀態和無PCR產物雜交狀態時，報告基團發出的熒光被淬滅基團吸收。在ARMS-qPCR擴增過程中，當特異的PCR產物與TaqMan探針發生雜交反應時Taq酶的5’端外切酶活性同時也把探針裂解，報告基團所釋放出來的熒光就可以被內置在定量檢測儀內的熒光計檢測到。PCR每經過一個循環，熒光信號也和目的片段一樣，有一個同步指數增長的過程，熒光信號的強弱就代表了模板DNA的拷貝數的多少。因此本發明不僅可用于簡單的定性檢測，亦可用做樣本具體含量的定量檢測。
[0076]鎖核酸阻滯探針標記3’段P04。
[0077]所述待測樣本為離體幽門螺桿菌患者胃粘膜組織標本。
[0078]本發明的實驗證明，本發明設計的引物及其構成的試劑盒能快速、準確、高敏感度的檢測胃粘膜組織中幽門螺桿菌23S rDNA基因特定位點突變，靈敏度高，可以進一步預測其對克拉霉素耐藥性。
[0079]本發明采用的鎖核酸阻滯探針，其序列與幽門螺桿菌23S rDNA基因野生模板完全匹配，部分堿基鎖核酸化，用于特異性結合模板DNA中的Hp23S rDNA野生型DNA，因其末端磷酸化，無法延伸從而抑制突變區野生型DNA的擴增，大大增加突變檢測的靈敏度與特異性。
[0080]因此，本發明用于檢測23S rDNA基因突變具有以下優勢:
[0081]1、特異性強:設計的ARMS引物分別針對包括23S rDNA基因的A2143G、A2142G和A2142C的三種突變位點序列，能特異性擴增相應突變模板DNA ;在ARMS引物的3’末端倒數2-3位增加一個或者兩個堿基錯配，可以增加ARMS引物的特異性；本發明技術在PCR反應體系中加入野生型23S rDNA基因特異性的鎖核酸阻滯探針，通過抑制野生型基因組DNA擴增從而富集突變型DNA的擴增，進一步提高了檢測的特異性。
[0082]2、敏感性高:本發明技術在PCR反應液中加入野生型23S rDNA基因LNA阻滯探針，通過特異性地抑制野生型模板的擴增，從而達到對微量突變模板的富集作用，提高檢測敏感性。本技術檢測23S rDNA基因突變敏感度達0.1-1% (即突變基因組DNA達到基因總DNA的0.1-1%即可檢出)；而直接測序法檢測23S rDNA突變的敏感度約為10% (即突變基因組DNA達到基因總DNA的10%才能檢出)。
[0083]3、檢測過程為閉管反應，大大降低了污染及結果偏差的可能性。
[0084]4、操作簡單快速，從標本送檢到得出結果可在3個小時以內完成。而直接測序法檢測步驟繁瑣:送檢標本一提取DNA — PCR擴增一驗證PCR產物(電泳)一純化PCR產物—直接測序，且其經歷兩個PCR產物的電泳過程，污染機會大，不適合在醫院大規模開展。
[0085]5、結果判讀明確、客觀；可以快速對不同突變類型進行準確分型，若需要亦可對結果進行定量分析。
[0086]6、高通量，一次最多可檢測48例。
[0087]7、安全:整個體系中不包含有毒有害物質，無需PCR產物的后處理，對操作員和環境都無危害。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0088]圖1為用ARMS-qPCR檢測試劑盒分型檢測幽門螺桿菌陽性樣本I的23SrDNAA2143G基因突變型的擴增曲線圖
[0089]圖2為用ARMS-qPCR檢測試劑盒分型檢測幽門螺桿菌陽性樣本2的23SrDNAA2142G基因突變型的擴增曲線圖
[0090]圖3為用ARMS-qPCR檢測試劑盒分型檢測幽門螺桿菌陽性樣本3的23SrDNAA2142C基因突變型的擴增曲線圖
[0091 ] 圖4為用ARMS-qPCR檢測試劑盒分型檢測幽門螺桿菌陽性樣本4的23S rDNA基因野生型的擴增曲線圖
[0092]圖5為用ARMS-qPCR檢測試劑盒混合檢測幽門螺桿菌陽性樣本1_3的23S rDNA基因突變型的擴增曲線圖
[0093]圖6為用ARMS-qPCR檢測試劑盒混合檢測幽門螺桿菌陽性樣本4的23S rDNA基因野生型的擴增曲線圖

【具體實施方式】
[0094]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0095]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0096]實施例1、ARMS-qPCR檢測試劑盒及其專用引物和探針的設計
[0097]幽門螺桿菌23S rDNA野生型基因的核苷酸序列為序列表中的序列8 ；
[0098]幽門螺桿菌23S rDNA的A2143G突變位點為序列表中的序列8自5’末端第97位的A突變為G ；
[0099]幽門螺桿菌23S rDNA的A2142G突變位點為序列表中的序列8自5’末端第96位的A突變為G ；
[0100]幽門螺桿菌23S rDNA的A2142C突變位點為序列表中的序列8自5’末端第96位的A突變為C ；
[0101]一、引物及探針
[0102]使用Primer Express Vers1n3軟件在兩個突變的序列區域設計探針及引物。設計并篩選能特異性檢測第2143和第2142兩個位點的三種(A2143G、A2142G、A2142C)堿基置換突變的ARMS引物各一條及內控引物一條，設計通用下游引物一條，設計并篩選通用TaqMan探針一條，設計并篩選鎖核酸阻滯探針一條，各探針、引物序列分別具體如下:
[0103]鎖核酸阻滯探針的核苷酸序列如序列表中序列I所示，其3’端標記P04 ；
[0104]通用TaqMan探針的核苷酸序列如序列表中序列2所示，其5’端標記FAM，3’端標記 BHQl ；
[0105]用于檢測23S rDNA的突變型ARMS引物由用于檢測23S rDNA的A2143G突變型的ARMS引物、用于檢測23S rDNA的A2142G突變型的ARMS引物和用于檢測23S rDNA的A2142C突變型的ARMS引物組成，其中，
[0106]用于檢測23S rDNA的A2143G突變型的ARMS引物的核苷酸如序列3所示；
[0107]用于檢測23S rDNA的A2142G突變型的ARMS引物的核苷酸如序列4所示；
[0108]用于檢測23S rDNA的A2142C突變型的ARMS引物的核苷酸如序列5所示；
[0109]內控引物為一條能夠同時擴增23S rDNA野生型及突變型基因組DNA的上游引物，其核苷酸如序列6所示；
[0110]PCR通用下游引物的核苷酸如序列7所示。
[0111]將設計好的引物及探針序列交由合成公司合成，一般采用儀器自動化學合成，需提供合成檢驗合格報告。
[0112]二、幽門螺桿菌熒光定量PCR的試劑或試劑盒配制
[0113]1、反應體系的優化
[0114](I)引物濃度的優化:在反應體系其它條件相同的情況下，將引物濃度分別從0.1 μ M至1.0 μ M作倍比連續稀釋，通過對試驗結果的分析比較，確定最佳引物濃度是0.5 μ Μ。
[0115](2)探針濃度的優化:在反應體系其他條件相同的情況下，將探針濃度分別從0.05 μ M至0.5 μ M作倍比連續稀釋，通過對試驗結果的分析比較，確定最佳探針濃度是0.2 μ Μ。
[0116](3)酶的優化:在反應體系中加入各種酶，通過對試驗結果的分析比較，確定最佳酶是EXTaq酶。
[0117](4)鎂離子濃度的優化:在反應體系其它條件相同的情況下，將qPCR反應液組分鎂離子濃度分別從0.5mM至4.0mM作倍比連續稀釋，通過對試驗結果的分析比較，確定最佳鎂離子濃度是2mM。
[0118](5)退火溫度的優化:在反應體系其它條件相同的情況下，進行梯度PCR(56_62°C退火溫度)，通過對試驗結果的分析比較，確定最佳退火溫度是58°C。
[0119]經優化，用于檢測待測樣本中的23S rDNA是否突變的PCR試劑為I)或2):
[0120]I)由PCR試劑A-D組成:
[0121]PCR試劑A為A2143G檢測管反應體系:20yL，由qPCR混合反應液10 μ L、通用下游引物I μ L(終濃度0.5 μ M)、A2143G的ARMS引物I μ L(終濃度0.5 μ Μ)、通用TaqMan探針0.4 μ L (終濃度0.2 μ Μ)、鎖核酸阻滯探針0.8 μ L (終濃度0.4 μ Μ)、模板DNA5 μ L (終濃度l-300ng/y L)和水組成。
[0122]PCR試劑B為A2142G檢測管反應體系:20yL，由qPCR混合反應液10 μ L、通用下游引物I μ L(終濃度0.5 μ M)、A2142G的ARMS引物I μ L(終濃度0.5 μ Μ)、通用TaqMan探針0.4 μ L (終濃度0.2 μ Μ)、鎖核酸阻滯探針0.8 μ L (終濃度0.4 μ Μ)、模板DNA5 μ L (終濃度l-300ng/y L)和水組成。
[0123]PCR試劑C為A2142C檢測管反應體系:20μ L，由qPCR混合反應液10 μ L、通用下游引物I μ L(終濃度0.5 μ M)、A2142C的ARMS引物I μ L(終濃度0.5 μ Μ)、通用TaqMan探針0.4 μ L (終濃度0.2 μ Μ)、鎖核酸阻滯探針0.8 μ L (終濃度0.4 μ Μ)、模板DNA5 μ L (終濃度l-300ng/y L)和水組成。
[0124]PCR試劑D為內控管的反應體系，與檢測管相同，不同的是將ARMS引物替換為內控引物。
[0125]2)由PCR試劑E和D組成:
[0126]用于檢測待測樣本23S rDNA是否突變的PCR試劑包括PCR試劑E和PCR試劑D ；
[0127]PCR試劑E為檢測管的反應體系為20 μ L，由qPCR混合反應液10 μ L、通用下游引物 I μ L(終濃度 0.5 μ Μ)、A2143G 的 ARMS 引物、A2142G 的 ARMS 引物和 A2142C 的 ARMS 引物各0.5 μ L(終濃度均為)、通用TaqMan探針0.4 μ L(終濃度0.2 μ Μ)、鎖核酸阻滯探針0.8 μ L (終濃度0.4 μ Μ)、模板DNA5 μ L (終濃度l_300ng/ μ L)和水組成。
[0128]上述qPCR混合反應液組分及其終濃度見表1。
[0129]表1為qPCR反應液組分
[0130]
組分j終濃度

MgCla2mM

Taq DNA 聚合酶 5U/yL

dNTPs2.5mM

反應緩沖液 I1x
[0131]2、試劑盒組成
[0132]可以將上述的鎖核酸阻滯探針、通用TaqMan探針、針對23S rDNA的A2143G的ARMS引物或針對23S rDNA的A2142G的ARMS引物或針對23S rDNA的A2142C的ARMS引物、內控引物、PCR通用下游引物以及水作為試劑盒的主要組成，構建獲得試劑盒；
[0133]試劑盒中具體含有下列試劑和材料:
[0134](I)引物溶液:a、鎖核酸阻滯探針(序列I) ;b、通用TaqMan探針(序列2)，；c、ARMS引物(序列3或序列4或序列5或序列3+序列4+序列5) ;d、內控引物(序列6) ;e、PCR通用下游引物(序列7)。
[0135](2) qPCR 反應液:包括 10XPCR 緩沖液；dNTPs ；MgCl2 溶液；EXTaq 酶。
[0136](3)陽性質控:為人工合成的23S rDNA基因A2143G、A2142G和A2142C三種突變型的混合質粒基因組DNA。
[0137](4)陰性質控:無菌雙蒸水
[0138](5)無菌雙蒸水
[0139]實施例2、幽門螺桿菌23S rDNA基因型的ARMS-qPCR突變檢測方法
[0140]一、檢測
[0141]1、樣本制備
[0142]從離體人胃粘膜組織標本中獲取DNA，推薦使用商業化的試劑盒提取基因組DNA作為樣本1-4 ；
[0143]測定DNA濃度和純度，要求濃度大于1ng/ μ L ；0D260nm/0D280nm = 1.8~2.0。
[0144]2、熒光PCR檢測
[0145]1)ARMS引物分型檢測
[0146]對于樣本1-4中每個樣本均在四個管A-D分別進行反應，四個管分別對應A2143G檢測管(ep管A)、A2142G檢測管(ep管B)、A2142C檢測管(ep管C)、內控管(印管D)。檢測管(A-C)內反應加入qPCR反應液、LNA阻滯探針、通用TaqMan探針、通用下游引物、模板DNA及相應的ARMS引物；內控管⑶基本相同，所不同的是加入內控引物替代ARMS引物，具體如下:
[0147]印管A(PCR試劑A):20 μ L反應體系，由qPCR混合反應液10 μ L、通用下游引物1μ L(終濃度(λ 5μΜ)、A2143G的ARMS弓丨物1μ L(終濃度(λ 5 μ Μ)、通用TaqMan探針0.4 μ L (終濃度0.2 μ Μ)、鎖核酸阻滯探針0.8 μ L (終濃度0.4 μ Μ)、模板DNA5 μ L (終濃度l-300ng/ μ L)和水組成；
[0148]印管B(PCR試劑B):20 μ L反應體系，由qPCR混合反應液10 μ L、通用下游引物1μ L(終濃度(λ 5μΜ)、A2142G的ARMS弓丨物1μ L(終濃度(λ 5 μ Μ)、通用TaqMan探針0.4 μ L (終濃度0.2 μ Μ)、鎖核酸阻滯探針0.8 μ L (終濃度0.4 μ Μ)、模板DNA5 μ L (終濃度l-300ng/ μ L)和水組成；
[0149]印管C(PCR試劑C):20yL反應體系，由qPCR混合反應液10yL、通用下游引物1μ L(終濃度(λ 5μΜ)、A2142C的ARMS弓丨物1μ L(終濃度(λ 5 μ Μ)、通用TaqMan探針0.4 μ L (終濃度0.2 μ Μ)、鎖核酸阻滯探針0.8 μ L (終濃度0.4 μ Μ)、模板DNA5 μ L (終濃度l-300ng/ μ L)和水組成；
[0150]印管D(PCR試劑D):20yL反應體系，由qPCR混合反應液10yL、通用下游引物I μ L(終濃度0.5 μ Μ)、內控引物I μ L(終濃度0.5 μ Μ)、通用TaqMan探針0.4 μ L(終濃度0.2 μ M)、鎖核酸阻滯探針0.8 μ L (終濃度0.4 μ Μ)、模板DNA5 μ L (終濃度l_300ng/ μ L)和水組成。
[0151 ] 2) ARMS弓丨物混合檢測
[0152]樣本1-4的每個樣本均分別在兩個管E、D進行反應，每管分別對應檢測管(ep管E)、內控管(ep管D)。檢測管內反應加入qPCR反應液、LNA阻滯探針、通用TaqMan探針、通用下游引物、模板DNA及三種ARMS引物；內控管(D)基本相同，所不同的是加入內控引物替代ARMS引物，具體如下:
[0153]印管E(PCR試劑E):20 μ L反應體系，由qPCR混合反應液10 μ L、通用下游引物I μ L(終濃度 0.5 μ Μ)、A2143G 的 ARMS 引物 0.5 μ L(終濃度 0.25 μ Μ)、A2142G 的 ARMS 引物 0.5 μ L(終濃度 0.25 μ Μ)、A2142C 的 ARMS 引物 0.5 μ L(終濃度 0.25 μ Μ)、通用 TaqMan探針0.4 μ L (終濃度0.2 μ Μ)、鎖核酸阻滯探針0.8 μ L (終濃度0.4 μ Μ)、模板DNA5 μ L (終濃度l-300ng/ μ L)和水組成；
[0154]印管D(PCR試劑D):2(^1^反應體系，由9?0?混合反應液1(^1^、通用下游引物I μ L(終濃度0.5 μ Μ)、內控引物I μ L(終濃度0.5 μ Μ)、通用TaqMan探針0.4 μ L(終濃度
0.2 μ M)、鎖核酸阻滯探針0.8 μ L (終濃度0.4 μ Μ)、模板DNA5 μ L (終濃度l_300ng/ μ L)和水組成。
[0155]PCR反應條件為:95°C預變性10分鐘，95°C 15秒，58°C 40秒，擴增反應40循環，在58°C 40秒階段收集熒光。
[0156]ARMS-qPCR 在 ABI7500 檢測儀上進行。
[0157]3、結果判讀:
[0158]若內控引物管擴增曲線陰性或Ct > 32，提示該樣本提取失敗，需要重新提取。
[0159]ARMS引物分型檢測結果如圖1-4所示，可以看出，
[0160]對于樣本1，內控引物管D擴增S型曲線且Ct ( 32,ARMS引物管A有擴增S型曲線且ARMS引物管A與內控引物管D的擴增曲線ACt≤7，待測樣本含有或候選含有A2143G突變位點(圖1為樣本I的3個ARMS引物檢測管及內控管的擴增圖)；
[0161]對于樣本2，內控引物管D擴增S型曲線且Ct ( 32,ARMS引物管B有擴增S型曲線且ARMS引物管B與內控引物管D的擴增曲線ACt < 7，待測樣本結果含有或候選含有A2142G突變位點(圖2為樣本2的3個ARMS引物檢測管及內控管的擴增圖)；
[0162]對于樣本3，內控引物管D擴增S型曲線且Ct ( 32,ARMS引物管C有擴增S型曲線且ARMS引物管C與內控引物管D的擴增曲線Λ Ct≤7，待測樣本含有或候選含有A2142C突變位點(圖3為樣本3的3個ARMS引物檢測管及內控管的擴增圖)；
[0163]對于樣本4，內控引物管D擴增S型曲線且Ct ( 32，三種ARMS引物管A、B、C均無擴增曲線，待測樣本不含有或候選不含有A2143G、A2142G、A2142C中任——個突變位點，其為23S rDNA野生型基因(圖4為樣本4的3個ARMS引物檢測管及內控管的擴增圖)；
[0164]分別以樣本1-4的基因組DNA為模板，用5’ATGAATGGCGTAACGA3’引物正向測序樣本1-4的23S rDNA基因目的片段，結果與本發明的方法一致，證明本發明的方法正確。
[0165]ARMS引物混合檢測結果如圖5-6所示，可以看出，
[0166]對于樣本1-3，內控引物管D擴增S型曲線且Ct ( 32, ARMS引物混合管E中有擴增S型曲線且與內控引物管D的擴增曲線Λ Ct <7，待測樣本結果為或候選為23S rDNA突變型基因(圖5為樣本1-3的ARMS檢測管及內控管的擴增圖)；
[0167]對于樣本4，內控引物擴增S型曲線且Ct ( 32,ARMS引物混合管E無擴增曲線或與內控引物的擴增曲線ACt >7，待測樣本結果為或候選為23S rDNA野生型基因(圖6為樣本4的ARMS檢測管及內控管的擴增圖)。
[0168]二、特異性檢測
[0169]用實施例1ARMS引物分型檢測方法檢測實驗室保存的38株經測序已知突變類型的幽門螺桿菌臨床分離株的23S rDNA序列進行擴增，結果除陰性對照外，其余對相應的DNA突變或者不突變形成呈陽性擴增，與測序結果符合率達到100%。
[0170]三、靈敏度檢測
[0171]以人工合成的對應序列幽門螺桿菌23S rDNA野生型基因、幽門螺桿菌23S rDNA的A2143G型突變型基因、幽門螺桿菌23S rDNA的A2142G型突變型基因和幽門螺桿菌23SrDNA的A2142C型突變型基因分別連接到pMD18_T載體為模板，濃度梯度均稀釋為10~16CFU為模板。
[0172]按照上述一的ARMS引物分型檢測方法進行real-time PCR,每個模板濃度梯度做3個平行樣，每個模板用其突變類型對應的檢測管進行檢測，當體系標準模板量為10~16CFU時，每個濃度梯度的3個平行樣均擴增陽性，三種ARMS引物管A、B、C的檢測下限均為10CFU，其靈敏度均為10CFU。
[0173]因此，可以用實施例1中的用于檢測待測樣本中23S rDNA是否突變的PCR試劑A-D檢測待測樣本中幽門螺桿菌23S rDNA基因是否突變或檢測待測樣本是否耐克拉霉素；并且可以對突變陽性樣本進行特異性分型。
[0174]若內控引物擴增S型曲線且Ct≤32，且用于檢測23S rDNA的A2143G突變型ARMS引物擴增S型曲線且其與內控引物的擴增曲線ACt < 7，則待測樣本中幽門螺桿菌23SrDNA含有或候選含有A2143G突變位點，待測樣本為或候選為對克拉霉素耐藥；
[0175]若內控引物擴增S型曲線且Ct≤32，且用于檢測23S rDNA的A2142G突變型ARMS引物擴增S型曲線且其與內控引物擴增曲線ACt < 7，則待測樣本中幽門螺桿菌23SrDNA含有或候選含有A2142G突變位點，待測樣本為或候選為對克拉霉素耐藥；
[0176]若內控引物擴增S型曲線且Ct≤32，且用于檢測23S rDNA的A2142C突變型ARMS引物擴增S型曲線且其與內控引物的擴增曲線ACt < 7，則待測樣本中幽門螺桿菌23SrDNA含有或候選含有A2142C突變位點，待測樣本為或候選為對克拉霉素耐藥；
[0177]若內控引物擴增S型曲線且Ct≤32，且用于檢測23S rDNA的A2143G突變型ARMS弓丨物、A2142G突變型ARMS引物和A2142C突變型ARMS引物均無擴增曲線或與內控引物的擴增曲線均ACt > 7，待測樣本23S rDNA不含有或候選不含有A2143G、A2142G、A2142C中任--個突變位點，表現為對克拉霉素敏感。
[0178]也可以用實施例1中的用于檢測待測樣本中23S rDNA是否突變的PCR試劑E和PCR試劑D混合檢測待測樣本中幽門螺桿菌23S rDNA基因是否突變或檢測待測樣本是否耐克拉霉素。
[0179]若內控引物擴增S型曲線且Ct≤32，且用于檢測23S rDNA的ARMS混合引物有S型擴增曲線且與內控引物的擴增曲線ACt < 7，待測樣本23S rDNA含有或候選含有突變位點，所述突變位點為A2143G、A2142G或A2142C，待測樣本表現為對克拉霉素耐藥；
[0180]若內控引物擴增S型曲線且Ct≤32，且用于檢測23S rDNA的ARMS混合引物無擴增曲線或與內控引物的擴增曲線八以>7，待測樣本233 rDNA不含有或候選不含有突變位點，待測樣本表現為對克拉霉素敏感。
[0181]實施例3、ARMS-qPCR試劑盒的臨床應用
[0182]1、樣本制備
[0183]收集臨床病理診斷為幽門螺桿菌陽性的50例患者(患者之情，編號為1-50)的石蠟包埋胃粘膜組織切片或冰凍胃粘膜組織塊，從組織中提取基因組DNA。
[0184]測定DNA濃度和純度，要求濃度大于1ng/ μ L ；0D260nm/0D280nm = 1.8~2.0。
[0185]2、熒光PCR檢測
[0186]按照實施例2的一的2的方法中的ARMS引物分型檢測進行熒光PCR檢測。
[0187]結果如下:
[0188]在臨床病理診斷為幽門螺桿菌陽性的50例患者中共檢測出13例23S rDNA的A2143G突變型陽性樣本(編號為1-13)、I例23S rDNA的A2142G突變型突變陽性樣本(編號為14)，其余為野生型樣本(編號為15-50)，由于23S rDNA的A2142C的突變率較低，因此，本實驗中沒有檢測出23S rDNA的A2142C突變型陽性樣本，其他各突變或野生型經測序驗證，結果一致。
[0189]將上述野生型樣本、A2143G突變陽性樣本、A2142G突變陽性樣本進行克拉霉素培養法耐藥檢測，結果A214 3G突變陽性、A2142G突變陽性均耐克拉霉素，野生型樣本克拉霉素敏感。
[0190]上述結果表明應用本發明的引物、探針檢測胃粘膜組織23S rDNA基因突變靈敏度高，可檢測臨床樣本中的微量突變模板(0.1-1% );結果可靠，與突變檢測“金標準”直接測序法的結果符合率>95% (為100%)。此外該方法檢測速度快，操作簡單，結果判讀客觀，閉管反應污染少，非常適合于在臨床中大規模開展。
【權利要求】
1.用于鑒定幽門螺桿菌23SrDNA是否含有突變位點ARMS-qPCR的引物組，為如下I)或2): 1)由單獨使用的23SrDNA的A2143G突變型的ARMS引物、23S rDNA的A2142G突變型的ARMS引物和23S rDNA的A2142C突變型的ARMS引物組成； 2)由23SrDNA的A2143G突變型的ARMS引物、23S rDNA的A2142G突變型的ARMS引物和23S rDNA的A2142C突變型的ARMS引物組成； 所述23S rDNA的A2143G突變型的ARMS引物的核苷酸序列為序列表中序列3 ； 所述23S rDNA的A2142G突變 型的ARMS引物的核苷酸序列為序列表中序列4 ； 所述23S rDNA的A2142C突變型的ARMS引物的核苷酸序列為序列表中序列5。
2.用于鑒定幽門螺桿菌23SrDNA是否含有突變位點ARMS-qPCR的DNA分子組合物，為如下I)或2): 1)所示的DNA分子組合物包括單獨使用的DNA分子組合物A、DNA分子組合物B和DNA分子組合物C ； 所述DNA分子組合物A由鎖核酸阻滯探針、通用TaqMan探針、PCR通用下游引物和23SrDNA的A2143G突變型的ARMS引物組成； 所述DNA分子組合物B由鎖核酸阻滯探針、通用TaqMan探針、PCR通用下游引物和23SrDNA的A2142G突變型的ARMS引物組成； 所述DNA分子組合物C由鎖核酸阻滯探針、通用TaqMan探針、PCR通用下游引物和23SrDNA的A2142C突變型的ARMS引物組成； 2)所示的DNA分子組合物由鎖核酸阻滯探針、通用TaqMan探針、PCR通用下游引物、23SrDNA的A2143G突變型的ARMS引物、23S rDNA的A2142G突變型的ARMS引物和23S rDNA的A2142C突變型的ARMS引物組成； 所述鎖核酸阻滯探針的核苷酸序列為序列表中序列I ; 所述通用TaqMan探針的核苷酸序列為序列表中序列2 ； 所述23S rDNA的A2143G突變型的ARMS引物的核苷酸序列為序列表中序列3 ； 所述23S rDNA的A2142G突變型的ARMS引物的核苷酸序列為序列表中序列4 ； 所述23S rDNA的A2142C突變型的ARMS引物的核苷酸序列為序列表中序列5 ； 所述PCR通用下游引物的核苷酸序列為序列表中序列7。
3.根據權利要求2所述的DNA分子組合物，其特征在于:所述DNA分子組合物均還包括所述DNA分子組合物D ； 所述DNA分子組合物D由所述鎖核酸阻滯探針、所述通用TaqMan探針、所述PCR通用下游引物和內控引物組成； 所述內控引物的核苷酸序列為序列表中序列6。
4.根據權利要求2或3所述的DNA分子組合物，其特征在于: 所述突變位點為A2143G、A2142G或A2142C。
5.用于鑒定幽門螺桿菌23SrDNA是否含有突變位點ARMS-qPCR的PCR試劑，為I)或
2): I)所示的PCR試劑包括PCR試劑A、PCR試劑B和PCR試劑C組成； 所述PCR試劑A由PCR擴增緩沖液、所述DNA分子組合物A和水組成；所述PCR試劑B由PCR擴增緩沖液、所述DNA分子組合物B和水組成； 所述PCR試劑C由PCR擴增緩沖液、所述DNA分子組合物C和水組成； 2)所示的PCR試劑為PCR試劑E，其由PCR擴增緩沖液、2)所示的DNA分子組合物和水組成。
6.根據權利要求5所述的PCR試劑，其特征在于:所述I)所示的PCR試劑或所述2)所示的PCR試劑均還包括PCR試劑D ； 所述PCR試劑D由PCR擴增緩沖液、所述DNA分子組合物D和水組成； 所述突變位點為A2143G、A2142G或A2142C。
7.用于鑒定幽門螺桿菌23SrDNA是否含有突變位點ARMS-qPCR的PCR試劑盒，包括權利要求I所述的引物組、權利要求2-4中任一所述的DNA分子組合物或權利要求5或6所述的PCR試劑。
8.根據權利要求2-4中任一所述的DNA分子組合物或權利要求5或6所述的PCR試劑或權利要求7所述的PCR試劑盒，其特征在于:所述突變位點為A2143G、A2142G或A2142C。
9.權利要求1所述的引物組、權利要求2-4中任一所述的DNA分子組合物或權利要求5或6所述的PCR試劑或權利要求7所述的PCR試劑盒在鑒定或輔助鑒定幽門螺桿菌23SrDNA是否含有突變為位點中的應用或在制備鑒定或輔助鑒定幽門螺桿菌23S rDNA是否含有突變位點產品中的 應用； 或權利要求1所述的引物組、權利要求2-4中任一所述的DNA分子組合物或權利要求5或6所述的PCR試劑或權利要求7所述的PCR試劑盒在鑒定或輔助鑒定待測樣本中含有的幽門螺桿菌23S rDNA是否含有突變位點中的應用或在制備鑒定或輔助鑒定待測樣本中含有的幽門螺桿菌23S rDNA是否含有突變位點的產品中的應用； 或權利要求1所述的引物組、權利要求2-4中任一所述的DNA分子組合物或權利要求5或6所述的PCR試劑或權利要求7所述的PCR試劑盒在制備鑒定或輔助鑒定含有幽門螺桿菌的待測樣本是否耐克拉霉素中的產品中的應用； 或權利要求1所述的引物組、權利要求2-4中任一所述的DNA分子組合物或權利要求5或6所述的PCR試劑或權利要求7所述的PCR試劑盒在制備鑒定或輔助鑒定待測幽門螺桿菌是否耐克拉霉素中的產品中的應用； 所述突變位點具體為A2143G、A2142G或A2142C。
10.一種鑒定或輔助鑒定待測樣本含有的幽門螺桿菌23S rDNA是否含有突變位點ARMS-qPCR的方法，為如下I)或2):1)所示的方法包括如下步驟: 用所述PCR試劑A、所述PCR試劑B、所述PCR試劑C和所述PCR試劑D分別對待測樣本進行ARMS-qPCR，檢測擴增產物； 若DNA分子組合物D擴增S型曲線且Ct < 32，且DNA分子組合物A擴增S型曲線且其與DNA分子組合物D擴增曲線Λ Ct < 7，則待測樣本中幽門螺桿菌23S rDNA含有或候選含有A2143G突變位點； 若DNA分子組合物D擴增S型曲線且Ct≤32，且DNA分子組合物B擴增S型曲線且其與DNA分子組合物D擴增曲線Λ Ct < 7，則待測樣本中幽門螺桿菌23S rDNA含有或候選含有A2142G突變位點；若DNA分子組合物D擴增S型曲線且Ct < 32，且DNA分子組合物C擴增S型曲線且其與DNA分子組合物D的擴增曲線Λ Ct < 7，則待測樣本中幽門螺桿菌23S rDNA含有或候選含有A2142C突變位點； 若DNA分子組合物D擴增S型曲線且Ct≤32，且DNA分子組合物A、B和C均無擴增曲線；或DNA分子組合物D擴增S型曲線且Ct≤32，且DNA分子組合物A、B和C的擴增曲線與DNA分子組合物D擴增曲線Λ Ct > 7 ;則待測樣本中幽門螺桿菌23S rDNA不含有或候選不含有突變位點； 2)所示的方法包括如下步驟: 用所述PCR試劑E和所述PCR試劑D分別對待測樣本進行ARMS-qPCR，檢測擴增產物；若DNA分子組合物D擴增S型曲線且Ct < 32，且DNA分子組合物E有S型擴增曲線且其與DNA分子組合物D的擴增曲線Λ Ct < 7，則待測樣本中幽門螺桿菌23S rDNA含有或候選含有23S rDNA突變位點； 若DNA分子組合物D擴增S型曲線且Ct < 32，且DNA分子組合物E無S型擴增曲線與DNA分子組合物D的擴增曲線Λ Ct > 7，則待測樣本中幽門螺桿菌23S rDNA不含有或候選不含有23S rDNA突變位點； 所述突變位點為A21 43G、A2142G或A2142C。
【文檔編號】C12N15/11GK104164491SQ201410347808
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