基于dna條形碼的鑒別赤鏈蛇的引物及pcr-rflp方法和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明屬于中藥品種鑒定【技術領域】，提出了一種鑒別赤鏈蛇的聚合酶鏈反應-限制性酶切圖譜分子鑒定方法(PCR-RFLP)。本發明引物序列為：DK1-CO1：5’-CAA?CTA?ACC?ACA?AAG?ACA?TCG?G-3’，DK1-CO2：5’-CTT?CTG?GGT?GGC?CGA?AAA?ATC?A-3’；赤鏈蛇的特征DNA堿基序列為：5’-GTGCAC-3’；限制性內切酶APaL?I識別并切割該序列。鑒定過程：提取樣本DNA；用引物DK1-CO1、DK1-CO2進行PCR擴增；用限制性內切酶APaL?I消化PCR產物；瓊脂糖凝膠電泳分析結果；通過與赤鏈蛇PCR-RFLP特征結果相比較，判斷待測樣品是否為赤鏈蛇。本發明還提出用于所述鑒定方法的試劑盒。本發明鑒別準確、快速、可靠，有效地區分赤鏈蛇與其它蛇類。
【專利說明】基于DNA條形碼的鑒別赤鏈蛇的引物及PCR-RFLP方法和試劑盒

【技術領域】
[0001]本發明屬于中藥品種鑒定【技術領域】，具體涉及一種鑒別赤鏈蛇的引物及PCR-RFLP方法和試劑盒。

【背景技術】
[0002]赤鏈蛇(Dinodon rufozonatum)為游蛇科鏈蛇屬的爬行動物，具有抗炎、鎮靜催目民、抗驚厥之功效，用于風濕性關節炎、解毒斂瘡、全身疼痛、慢性瘺管、潰瘍、疥癬等。赤鏈蛇是一種常見的金錢白花蛇偽品。隨著近年金錢白花蛇藥材價格的上漲以及資源的逐漸減少，越來越多的赤鏈蛇被用來充作金錢白花蛇。目前，市場上金錢白花蛇商品的50%為赤鏈蛇來源的偽品，兩者從形態學上的特征進行鑒定較為困難。尋找快速、準確方法鑒別赤鏈蛇，是金錢白花蛇藥材鑒定中的一個重要問題。


【發明內容】

[0003]本發明的目的是提供一種準確鑒別赤鏈蛇的PCR-RFLP分子鑒定方法，包括赤鏈蛇的特征DNA堿基序列、一對PCR引物、限制性內切酶酶切位點、鑒定方法及其試劑盒。
[0004]本發明基于DNA條形碼。DNA條形碼(DNA barcoding)是利用一個或少數幾個DNA片段對物種進行識別和鑒定的一項新技術。2003年Herbert等選取線粒體細胞色素C氧化酶亞基I的一段序列在動物界不同分類水平上(門、目、種)進行分析，發現無論在哪個分類水平上該基因都具有良好的識別能力，從而提出建立以一段長度為650bp的COI基因序列為基礎的條形碼識別方法。隨后的研究表明，COI (線粒體細胞色素氧化酶亞基I)基因序列種內變異小，種間變異大，且其DNA序列本身很少存在插入和缺失，對動物物種的識別和鑒定切實可行，被公認為動物界中標準的DNA條形碼基因。
[0005]本發明的技術方案如下:首先從各樣本中提取總DNA，利用引物DKl-COl及DK1-C02,用PCR方法擴增COI片段，經純化后，對該片段進行DNA序列測定，將所得序列登錄到Genbank系統獲得登錄號，并建立各樣品的DNA序列數據庫；在比較數據庫DNA序列的基礎上，得到赤鏈蛇的特征DNA堿基序列:5’ -GTGCAC-3’ (位于COI序列第362位至367位)，針對赤鏈蛇與其他蛇類DNA序列的差異，選擇合適的DNA限制性內切酶ApaL I，通過分析聚合酶鏈反應產物的限制性酶切圖譜差異，達到快速、準確鑒別赤鏈蛇的目的。
[0006]對需要鑒定的赤鏈蛇樣品，提取其DNA，在給定的PCR條件下，用一對引物(DK1-C0UDK1-C02)擴增，供試品能夠擴增出一段DNA片段；用限制性內切酶ApaL I對供試品的PCR擴增產物進行酶切后，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，赤鏈蛇會出現分子量為362bp，296bp的兩條DNA片段，而其它種類的蛇不出現上述兩條帶。當供試品經本法進行PCR擴增，并對PCR產物進行限制性內切酶酶切后，通過瓊脂糖凝膠電泳觀察DNA片段的大小，便可準確鑒定供試品是否為赤鏈蛇。
[0007]本發明用于鑒別赤鏈蛇的PCR擴增引物，其序列為:
[0008]DKl-COl:5，-CAACTAACCACAAAGACATCGG-3，；
[0009]DK1-C02:5’ -CTTCTGGGTGGCCGAAAAATCA-3’。
[0010]本發明設計的用于鑒別赤鏈蛇PCR-RFLP分子鑒定方法，步驟如下:
[0011]I)提取待測樣品DNA;
[0012]2)擴增DNA片段，PCR反應參數包括:93°C預變性5min，55°C 2min ;93°C變性30s，55°C復性45s，70。。延伸45s, 35個循環;70°C延伸5min。所述引物DKl-COl和DK1-C02，其序列為:
[0013]DKl-COl:5’ -CAACTAACCACAAAGACATCGG-3’ (SEQ ID N0.1)
[0014]DK1-C02:5’ -CTTCTGGGTGGCCGAAAAATCA-3’ (SEQ ID N0.2)
[0015]3)純化PCR產物，瓊脂糖凝膠電泳分析；
[0016]4)PCR擴增產物中加入限制性內切酶APaL I進行酶切，限制性內切酶APaL I酶切位點為:G'TGCAC ；
[0017]5)瓊脂糖凝膠電泳分析；
[0018]6)鑒定結果的判斷，若出現362bp和296bp的兩條片段，則待測樣品為赤鏈蛇；若不出現上述兩條片段，則待測樣品不為赤鏈蛇。
[0019]本發明方法的步驟I)和3)，采用現有技術的試劑盒提取DNA及純化PCR產物的方法，不需要配制任何試劑，使得操作時間大大縮短。
[0020]本發明還提出了用于鑒定赤鏈蛇PCR-RFLP方法的試劑盒。所述試劑盒包括:弓丨物DKl-COl (10 μ M);引物DK1-C02 (10 μ Μ) ；2XTaq DNA聚合酶混合緩沖液，其包括:TaqDNA聚合酶(0.1U/ μ L)，四種脫氧核糖核苷三磷酸(dATP、dTTP、dCTP及dGTP各500 μ Μ)，Tris-HCl (20 μ Μ、ρΗ8.3)，KCl (100 μ Μ)，MgCl2 (3 μ Μ)等；ApaL I 酶(1U/ μ L);酶切緩沖液；終止緩沖液；滅菌雙蒸水。
[0021]綜上所述，本發明解決了鑒定赤鏈蛇與其它品種蛇的難題，提供了鑒定所需的一對PCR引物、PCR反應條件、赤鏈蛇特征DNA堿基序列、一種限制性內切酶、鑒定方法及其試劑盒。本發明利用赤鏈蛇與其它蛇類藥材DNA序列的差異，構建了快速、便捷、準確的PCR-RFLP鑒別方法，對于保證金錢白花蛇的藥材質量，打擊金錢白花蛇偽品的市場行為具有重要的價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為各樣本PCR擴增電泳圖:1.赤鏈蛇2.金錢白花蛇3.黃斑漁游蛇4.眼鏡蛇5.百花錦蛇6.尖吻蝮蛇；MK.DNA分子量標準:從上到下依次為1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、lOObp。
[0023]圖2為各樣本COI條形碼序列PCR產物酶切電泳結果:1.赤鏈蛇2.金錢白花蛇
3.黃斑漁游蛇4.眼鏡蛇5.百花錦蛇6.尖吻蝮蛇；MK.DNA分子量標準:從上到下依次為100bp、7 OObp、500bp、400bp、300bp、200bp、10bp。

【具體實施方式】
[0024]結合以下具體實施例和附圖，對本發明作進一步的詳細說明，本發明的保護內容不局限于以下實施例。在不背離發明構思的精神和范圍下，本領域技術人員能夠想到的變化和優點都被包括在本發明中，并且以所附的權利要求書為保護范圍。實施本發明的過程、條件、試劑、實驗方法等，除以下專門提及的內容之外，均為本領域的普遍知識和公知常識，本發明沒有特別限制內容。
[0025]1、材料
[0026]6份蛇類原動物，主要采自廣東省、江西省、廣西壯族自治區(表1)。全部樣本均由華南瀕危動物研究所張亮進行性狀鑒定。
[0027]表1 6份蛇類原動物樣本
[0028]

【權利要求】
1.用于鑒別赤鏈蛇的PCR擴增引物，其特征在于，所述引物序列為:
DKl-COl:5，-CAACTAACCACAAAGACATCGG-3，；
DK1-C02:5’ -CTTCTGGGTGGCCGAAAAATCA-3’。
2.一種鑒定赤鏈蛇的PCR-RFLP方法，其特征在于，用能夠識別赤鏈蛇特征DNA堿基序列的限制性內切酶APaL I對純化后的PCR產物進行消化，形成瓊脂糖凝膠電泳的特征圖譜；赤鏈蛇特征DNA堿基序列為:5’ -GTGCAC-3’，其位于COI序列第362位至367位；所述鑒定方法包括以下步驟: 1)樣品DNA的提取； 2)擴增DNA片段:利用權利要求1所述的引物進行聚合酶鏈反應，得到聚合酶鏈反應擴增產物，所述PCR反應參數包括:93°C預變性5min，55°C 2min ;93°C變性30s，55°C復性45s, 70°C延伸 45s, 35 個循環;70°C延伸 5min ； 3)瓊脂糖凝膠電泳檢測，純化PCR產物； 4)所述PCR純化產物中加入限制性內切酶APaLI進行酶切，所述限制性內切酶APaLI的酶切位點為:G~TGCAC ； 5)瓊脂糖凝膠電泳分析； 6)鑒定結果的判斷:若 在所述電泳產物中檢測到分子量為362bp和296bp的兩條片段，則待測樣品為赤鏈蛇；若未出現上述兩條片段，則待測樣本非赤鏈蛇。
3.一種用于鑒別赤鏈蛇的PCR-RFLP檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括:10μΜ引物 DKl-COl ;10y]\^|*DKl-C02 ；2XTaq DNA 聚合酶混合緩沖液，其包括:0.1U/μ L TaqDNA 聚合酶，dATP、dTTP、dCTP 及 dGTP 各 500 μ M, 20 μ M Tris_HCl、pH8.3，100 μ M KC1，3 μ MMgCl2 ;10υ/μ L ApaL I酶；酶切緩沖液；終止緩沖液；滅菌雙蒸水。
【文檔編號】C12Q1/68GK104164493SQ201410347839
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年7月21日 優先權日:2014年7月21日
【發明者】晁志, 李曉蕾, 曾偉萍 申請人:南方醫科大學