一種提取及培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，是一種提取及培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞的方法，步驟為：(1)取人脂肪組織，用pH值為7.2-7.4的D-Hank’s平衡鹽液反復(fù)離心沖洗；(2)將脂肪組織絞碎為1-2mm3小塊，加入與所取脂肪組織等體積的消化液進(jìn)行消化；(3)靜置分層：將底層細(xì)胞用pH值為7.2-7.4的D-Hank’s平衡鹽液反復(fù)吹打，清洗干凈；清洗下來的液體經(jīng)篩網(wǎng)過濾，去除未消化組織，離心棄去上清液，獲得干細(xì)胞；(4)將獲得的干細(xì)胞按照2-3×104/cm2的密度接種于培養(yǎng)瓶，加入培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。該方法具有消化速度快，不溶性組織塊大幅減少，而且不影響干細(xì)胞活性等優(yōu)點。
【專利說明】一種提取及培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是一種提取及培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]脂肪干細(xì)胞(Adipose-derived Stem Cells, ADSCs),是目前廣泛應(yīng)用于組織工程及再生醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的一種成體干細(xì)胞(Cowan CM,.Nat B1technol，2004.22:560-567)。脂肪干細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞一樣具有多向分化潛能，在特定條件下可以向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞、成內(nèi)皮細(xì)胞和成神經(jīng)細(xì)胞等多個方向分化。除此之外，月旨肪干細(xì)胞還具有許多其他類型成體干細(xì)胞所不具備的優(yōu)勢，如脂肪組織來源充足、取材方便、獲取過程損傷輕微、無倫理學(xué)爭議，平均每10mL的脂肪組織中可獲得約IXlO6個干細(xì)胞，脂肪組織來源的細(xì)胞約有2%具有干細(xì)胞特征，遠(yuǎn)高于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrowmesenchymal stem cells,BMSCs)(約0.02%的細(xì)胞具有干細(xì)胞特征)。并且脂肪干細(xì)胞具有穩(wěn)定的群體倍增率、自我更新潛能及良好的免疫相容性(Strem BM,Trends B1technol,2005.24:1246-1253)，其基因轉(zhuǎn)染效率高、能穩(wěn)定表達(dá)外源基因，已廣泛應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)的研究(Gimble JM,.Circ Res, 2007:1249-1260)。而且ADSCs分化為脂肪細(xì)胞的效率比BMSCs更高。因此，脂肪干細(xì)胞是組織工程研究理想的種子細(xì)胞之一，最有希望成為脂肪組織工程的種子細(xì)胞。
[0003]目前常用的脂肪干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法是從脂肪組織分離獲取細(xì)胞，經(jīng)機(jī)械或酶處理方法分離除去紅細(xì)胞等成熟細(xì)胞后，采用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)。含10%胎牛血清的培養(yǎng)基雖可促進(jìn)脂肪干細(xì)胞的增殖，但難以維持其未分化狀態(tài)，隨著傳代次數(shù)增加，細(xì)胞增殖能力下降，形態(tài)由長梭形變?yōu)閷挻蟊馄剑饾u喪失多向分化能力。另外，動物血清可能存在動物攜帶的潛在病毒或支原體污染，對以后可能的臨床應(yīng)用構(gòu)成威脅。盡管研究人員嘗試了很多的無血清培養(yǎng)基方案，但間充質(zhì)干細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中普遍存在生長緩慢，多向分化能力逐漸消失的問題。
[0004]現(xiàn)有常規(guī)的機(jī)械或酶處理方法僅能除去紅細(xì)胞等成熟細(xì)胞，除紅后的這部分細(xì)胞中仍含有大量成熟細(xì)胞，因而，現(xiàn)有獲得的脂肪干細(xì)胞純度不高，由于細(xì)胞的生長和細(xì)胞之間的信號交通有關(guān)，純度不高的干細(xì)胞更易老化，往往在體外經(jīng)5-6次傳代培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞后，脂肪干細(xì)胞就出現(xiàn)老化。干細(xì)胞老化(或稱衰老)，是指干細(xì)胞增殖能力下降，多向分化潛能(或稱干性)降低或消失。老化意味著干細(xì)胞數(shù)量的減少和功能的減退，也可以說是無法再生。脂肪干細(xì)胞的老化限制了其在脂肪組織工程及其他組織工程中應(yīng)用的深入研究。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為克服現(xiàn)有常規(guī)的機(jī)械或酶處理脂肪干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法存在的缺陷，本發(fā)明提供一種脂肪干細(xì)胞的提取及培養(yǎng)方法，該方法具有消化速度快，不溶性組織塊大幅減少，而且不影響干細(xì)胞活性等優(yōu)點，該方法的步驟是:
[0006](I)取人脂肪組織，用pH值為7.2-7.4的D_Hank’ s平衡鹽液反復(fù)離心沖洗，離心去除多余的水溶液和血液；
[0007](2)將脂肪組織絞碎為l_2mm3小塊，加入與所取脂肪組織等體積的消化液進(jìn)行消化，放入搖床中，溫度為37°C，190rpm，消化時間為30min ;加入等體積的含有15% FBS的BME培養(yǎng)基終止消化；
[0008](3)靜置分層，將底層細(xì)胞用pH值為7.2-7.4的D_Hank’ s平衡鹽液反復(fù)吹打，清洗干凈；清洗下來的液體經(jīng)100目篩網(wǎng)過濾，去除未消化組織，離心棄去上清液，獲得干細(xì)胞；
[0009](4)將獲得的干細(xì)胞按照2-3X 1Vcm2的密度接種于培養(yǎng)瓶，加入培養(yǎng)液，置于37°C、CO2濃度5%、濕度95%的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，1-2天后將原培養(yǎng)液吸棄，更換新鮮的培養(yǎng)液，棄去非貼壁細(xì)胞，以后每24小時更換培養(yǎng)液一次，待細(xì)胞生長達(dá)到80%融合，在培養(yǎng)瓶中加0.25%胰酶-EDTA進(jìn)行消化， 按1:3傳代，獲得傳代培養(yǎng)后的人脂肪干細(xì)胞。
[0010]本發(fā)明所述的消化液為胰酶-EDTA和I型膠原酶的D-Hank’s平衡鹽溶液；其中胰酶-EDTA的濃度為0.05-0.5% (g/100ml，下同)，I型膠原酶的濃度為0.05-0.5% ;進(jìn)一步地，在所述消化液中，還可添加IV型膠原酶，其濃度為0.1-0.5%，在最優(yōu)選的實施方案中，所述消化液是濃度分別為0.1%的胰酶-EDTA、0.1%的I型膠原酶和0.2%的IV型膠原酶的D-Hank’ s平衡鹽溶液。
[0011]在本發(fā)明的實施方案中，在上述步驟(3)中，在過濾后，將脂肪干細(xì)胞懸浮液和紅細(xì)胞裂解液以1:1混合孵育2分鐘，4°C、離心力450g條件下離心5min，利用脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)基重懸脂肪干細(xì)胞。
[0012]所述培養(yǎng)液由L-谷氨酰胺l-5mmol/L，堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF) 5_30ng/ml，表皮生長因子(EGF)l-20ng/ml，白血病抑制因子(LIF) l_20ng/ml，谷胱甘肽5-20 μ g/ml,BME補(bǔ)足至100%組成。進(jìn)一步地,所述培養(yǎng)液優(yōu)選由L-谷氨酰胺lmmol/L,堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF) 20ng/ml，表皮生長因子(EGF) 5ng/ml，白血病抑制因子(LIF)5ng/ml，谷胱甘肽10 μ g/ml，BME補(bǔ)足至100%組成。
[0013]另外，在本發(fā)明的所述培養(yǎng)液中，還可包含50μ g/ml蟲草提取物，所述蟲草提取物可以為現(xiàn)有技術(shù)常規(guī)方法獲得，例如，將冬蟲夏草粉碎，加8-10倍量的水煎煮，過濾，濃縮干燥，即得。使用時，將蟲草提取物用BME培養(yǎng)基溶解，過22 μ m濾膜，加入到已配制好的培養(yǎng)液中。
[0014]本發(fā)明的有益效果是:通過對消化液進(jìn)行改良，采用胰酶-EDTA與膠原酶混合液進(jìn)行消化，不僅消化速度快，不溶性組織塊大幅減少，而且不影響干細(xì)胞活性。另外，本發(fā)明對培養(yǎng)基進(jìn)行了改良，由于其中不含動物血清，避免了潛在的病毒或支原體污染，無血清培養(yǎng)基中添加劑較少，配制簡單，并且結(jié)合中醫(yī)藥的傳統(tǒng)理論，摸索出合適的中藥提取物用于脂肪干細(xì)胞增殖，具有大幅提高干細(xì)胞增值速度、活性好等優(yōu)點，使脂肪干細(xì)胞具有至少130代分裂增殖的自我更新能力，細(xì)胞多向分化能力強(qiáng)。

【具體實施方式】
[0015]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。需要指出的是，以下說明僅僅是對本發(fā)明要求保護(hù)的技術(shù)方案的舉例說明，并非對這些技術(shù)方案的任何限制。本發(fā)明的保護(hù)范圍以所附權(quán)利要求書記載的內(nèi)容為準(zhǔn)。
[0016]術(shù)語解釋
[0017]脂肪干細(xì)胞
[0018]如本文所用，術(shù)語“脂肪干細(xì)胞”、“本發(fā)明脂肪干細(xì)胞”、或“本發(fā)明的干細(xì)胞”可以互換使用，都指分離自脂肪組織的干細(xì)胞。
[0019]在本發(fā)明中，脂肪組織或脂肪原料沒有特別限制，可以是來源于動物或人的任何部位的脂肪組織，優(yōu)選人的脂肪組織。較佳地，脂肪組織可以是腰部、臀部、腹部、大腿、上臂等部位的組織。
[0020]脂肪干細(xì)胞(ADSCs)是從脂肪組織中分離得到的一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞。ADSCs能夠在體外穩(wěn)定增殖且衰亡率低，它取材容易、體內(nèi)儲備量大、適宜大規(guī)模培養(yǎng)、對機(jī)體損傷小、來源廣泛、適宜自體移植。
[0021]干細(xì)胞抗原檢測
[0022]用本發(fā)明方法制備的脂肪干細(xì)胞具有很高的純度，其基本上不含有其他類型的細(xì)胞或干細(xì)胞。這可通過細(xì)胞表面抗原的檢測加以驗證。
[0023]脂肪干細(xì)胞具有多種特異性抗原和受體，主要有⑶3、⑶13、⑶29、⑶31、⑶34、CD45、CD49d、CD59、CD73、CD90、CD105、HLA-ABC 等。
[0024]⑶34抗原是一種高度糖基化I型跨膜蛋白，它選擇性的表達(dá)于人類造血干細(xì)胞(HSC)，祖細(xì)胞(PC)和血管內(nèi)皮細(xì)胞(EC)表面，帶有CD34的脂肪干細(xì)胞在總干細(xì)胞的比例優(yōu)選為< 1%。⑶31是一種內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原，帶有⑶31的脂肪干細(xì)胞在總干細(xì)胞的比例優(yōu)選為<1%。⑶45存在于所有造血細(xì)胞的表面，包括造血干細(xì)胞和破骨細(xì)胞。帶有⑶45的脂肪干細(xì)胞在總干細(xì)胞的比例優(yōu)選為< 1%。
[0025]⑶29、⑶73、⑶90、⑶105和⑶49d等主要存在于脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞表面。帶有⑶29、⑶73、CD90、⑶105和⑶49d的脂肪干細(xì)胞在總干細(xì)胞的比例優(yōu)選為≤95%。
[0026]本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員可以使用通用的方法檢測脂肪干細(xì)胞的純度和分化程度，如流式細(xì)胞儀法。檢測時，加入不同的與有針對性的特異抗體，抗體可以是完整的單克隆或多克隆抗體，也可以是具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab) 2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人,美國專利N0.4，946，778);或嵌合抗體,如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。加入抗體與細(xì)胞表面的抗原結(jié)合一定時間，用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞進(jìn)行自動分析和分選。
[0027]成脂誘導(dǎo)及檢測
[0028]由于脂肪干細(xì)胞具有多向分化能力，在一定的條件下對脂肪干細(xì)胞進(jìn)行分化誘導(dǎo)，能夠得到特定功能的已分化的細(xì)胞。
[0029]本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員可以使用通用的方法對脂肪干細(xì)胞進(jìn)行成脂誘導(dǎo)。一種通用的誘導(dǎo)方法是向培養(yǎng)液中加入地塞米松。誘導(dǎo)成脂的條件主要有3種，包括地塞米松加1-甲基-3-異丁基黃嘌呤(IBMX),地塞米松加胰島素,或地塞米松加卻甲新(indomethacin,消炎痛)、1_甲基-3-異丁基黃嘌呤及胰島素。其中最重要的就是地塞米松，低濃度的地塞米松是無血清或低血清培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的必需成分之一，能夠促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的體外快速增殖；較高濃度的地塞米松則可以誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化。
[0030]本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員可以使用通用的方法和染料(如Oil Red、蘇丹紅5B和溶劑紅27等)對脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)成脂進(jìn)行檢測。最常用的染料是Oil Red(O)，即油紅O。油紅O的結(jié)構(gòu)為1-[2，5_ 二甲基-4-(2，5-二甲基苯偶氮)苯偶氮]-2萘酚，是一種紅色粉末，油溶性偶氮染料，易溶于苯、乙醇和丙酮。成脂肪誘導(dǎo)的過程中，細(xì)胞在胞漿中不斷有油滴的累積，并不斷的增加變大，最后整個細(xì)胞的胞漿中都是油滴。油紅O作為生物染色劑，易與油脂結(jié)合，但與細(xì)胞本身的結(jié)構(gòu)著色力差。在顯微鏡下可以清楚地進(jìn)行成脂染色觀察。
[0031]成骨誘導(dǎo)及檢測
[0032]由于脂肪干細(xì)胞具有多向分化能力，在一定的條件下對脂肪干細(xì)胞進(jìn)行成骨分化誘導(dǎo)，能夠得到成骨細(xì)胞。
[0033]本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員可以使用通用的方法對脂肪干細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)。經(jīng)典的化學(xué)成骨誘導(dǎo)液配方為=DMEM培養(yǎng)液，甘油磷酸鈉，維生素C和地塞米松。成骨誘導(dǎo)的過程是使鈣離子能夠以鈣鹽的方式沉淀下來，即“鈣結(jié)節(jié)”。
[0034]鑒定鈣結(jié)節(jié)的染料常用“茜素紅”。茜素紅溶液包括:茜素磺酸鈉，茜素S，茜素紅S，菌素廁脂紅，I，2- 二羥基惠醒-3-橫酸納，1，2- 二羥基惠醒-3-橫酸納鹽。菌素紅為澄黃色或黃棕色粉末，易溶于水，微溶于乙醇，不溶于苯和氯仿能與許多金屬離子生成帶色化合物，能與鋯、釷、鋁、鈦及鈹和鈣的顯色反應(yīng)。茜素紅染色的原理就是茜素紅和鈣發(fā)生顯色反應(yīng)，產(chǎn)生一種深紅色的帶色化合物，這樣成骨誘導(dǎo)的細(xì)胞外面沉積的鈣結(jié)節(jié)也就被染成了深紅色。
[0035]實施例1
[0036](I)取人脂肪組織50ml，用pH值為7.2-7.4的D_Hank’ s平衡鹽液反復(fù)離心沖洗，離心去除多余的水溶液和血液；
[0037](2)將脂肪組織絞碎為l_2mm3小塊，加入與所取脂肪組織等體積的消化液進(jìn)行消化，放入搖床中37°C，190rpm消化30min ;加入10ml的含有15% FBS的BME培養(yǎng)基終止消化；消化液為0.1%的胰酶-EDTA、0.1%的I型膠原酶和0.2%的IV型膠原酶的D-Hank’s
平衡鹽溶液。
[0038](3)靜置分層，將底層細(xì)胞用pH值為7.2-7.4的D_Hank’ s平衡鹽液反復(fù)吹打，清洗干凈；清洗下來的液體經(jīng)100目篩網(wǎng)過濾，去除未消化組織，將脂肪干細(xì)胞懸浮液和紅細(xì)胞裂解液以1:1混合孵育2分鐘，4°C、離心力450g條件下離心5min，利用培養(yǎng)液重懸脂肪干細(xì)胞；
[0039](4)將獲得的干細(xì)胞按照2X 1Vcm2的密度接種于培養(yǎng)瓶，加入培養(yǎng)液，置于37°C、CO2濃度5%、濕度95%的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，I天后將原培養(yǎng)液吸棄，更換新鮮的培養(yǎng)液，棄去非貼壁細(xì)胞，以后每24小時更換培養(yǎng)液一次，待細(xì)胞生長達(dá)到80%融合，在培養(yǎng)瓶中加0.25%胰酶-EDTA進(jìn)行消化，按1:3傳代，獲得傳代培養(yǎng)后的人脂肪干細(xì)胞。培養(yǎng)液由L-谷氨酰胺lmmol/L，堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF) 20ng/ml，表皮生長因子(EGF) 5ng/ml,白血病抑制因子(LIF) 5ng/ml，谷胱甘肽10 μ g/ml，蟲草提取物50 μ g/ml，BME補(bǔ)足至100%組成。
[0040]實施例2-5消化液配方對脂肪干細(xì)胞的影響
[0041]根據(jù)實施例1的提取及培養(yǎng)方法，對消化液進(jìn)行調(diào)整，觀察最后獲得的脂肪干細(xì)胞的情況。
[0042]

【權(quán)利要求】
1.一種脂肪干細(xì)胞的提取及培養(yǎng)方法，其特征在于，該方法步驟為: (1)取人脂肪組織，用PH值為7.2-7.4的D-Hank’s平衡鹽液反復(fù)離心沖洗，離心去除多余的水溶液和血液； (2)將脂肪組織絞碎為l_2mm3小塊，加入與所取脂肪組織等體積的消化液進(jìn)行消化，放入搖床中，溫度為37°C，190rpm，消化時間為30min ;加入等體積的含有15% FBS的BME培養(yǎng)基終止消化； (3)靜置分層，將底層細(xì)胞用pH值為7.2-7.4的D-Hank’s平衡鹽液反復(fù)吹打，清洗干凈；清洗下來的液體經(jīng)100目篩網(wǎng)過濾，去除未消化組織，離心棄去上清液，獲得干細(xì)胞； (4)將獲得的干細(xì)胞按照2-3X1Vcm2的密度接種于培養(yǎng)瓶，加入培養(yǎng)液，置于37°C、CO2濃度5%、濕度95%的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，1-2天后將原培養(yǎng)液吸棄，更換新鮮的培養(yǎng)液，棄去非貼壁細(xì)胞，以后每24小時更換培養(yǎng)液一次，待細(xì)胞生長達(dá)到80%融合，在培養(yǎng)瓶中加0.25%胰酶-EDTA進(jìn)行消化，按1:3傳代，獲得傳代培養(yǎng)后的人脂肪干細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種脂肪干細(xì)胞的提取及培養(yǎng)方法，其特征在于，，所述的消化液為胰酶-EDTA和I型膠原酶的D-Hank’平衡鹽溶液；其中胰酶-EDTA的濃度為0.05-0.5%, I型膠原酶的濃度為0.05-0.5%。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種脂肪干細(xì)胞的提取及培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的消化液中，添加IV型膠原酶，其濃度為0.1-0.5%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種脂肪干細(xì)胞的提取及培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的消化液是濃度分別為0.1 %的胰酶-EDTA、0.1 %的I型膠原酶和0.2%的IV型膠原酶的D-Hank’ s平衡鹽溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種脂肪干細(xì)胞的提取及培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的步驟(3)中，在過濾后，將脂肪干細(xì)胞懸浮液和紅細(xì)胞裂解液以1:1混合孵育2分鐘，4°C、離心力450g條件下離心5min，利用脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)基重懸脂肪干細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種脂肪干細(xì)胞的提取及培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的培養(yǎng)液由L-谷氨酰胺l-5mmol/L，堿性成纖維細(xì)胞生長因子5-30ng/ml，表皮生長因子l-20ng/ml,白血病抑制因子l_20ng/ml，谷胱甘肽5-20 μ g/ml，BME補(bǔ)足至100%組成。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種脂肪干細(xì)胞的提取及培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的培養(yǎng)液由L-谷氨酰胺lmmol/L,堿性成纖維細(xì)胞生長因子20ng/ml,表皮生長因子5ng/ml,白血病抑制因子5ng/ml，谷胱甘肽10 μ g/ml，BME補(bǔ)足至100%組成。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種脂肪干細(xì)胞的提取及培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的培養(yǎng)液中，添加50 μ g/ml蟲草提取物。
【文檔編號】C12N5/0775GK104164403SQ201410360143
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年7月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月25日
【發(fā)明者】張靜瑩 申請人:大連大學(xué)